Вирусология наука о вирусах микроскопических надмолекулярных созданиях природы, которые являются своеобразной паразитической формой жизни
|
|
Скачать 2.88 Mb.
|
|
Введение Вирусология — наука о вирусах — микроскопических надмолекулярных созданиях природы, которые являются своеобразной паразитической формой жизни. Общая вирусология изучает природу вирусов, их строение, размножение, биохимию, генетику. Медицинская, ветеринарная и сельскохозяйственная вирусология исследует патогенные вирусы, их инфекционные свойства, разрабатывает меры предупреждения, диагностики и лечения вызываемых ими заболеваний. Вирусология решает фундаментальные и прикладные задачи и тесно связана с другими науками. Открытие и изучение вирусов, в частности бактериофагов, внесло огромный вклад в становление и развитие молекулярной биологии. Раздел вирусологии, изучающий наследственные свойства вирусов, тесно связан с молекулярной генетикой. Вирусы не только предмет изучения, но и инструмент молекулярно-генетических исследований, что связывает вирусологию с генетической инженерией. Вирусы — возбудители большого количества инфекционных заболеваний человека, животных, растений, насекомых. С этой точки зрения вирусология тесно связана с медициной, ветеринарией, фитопатологией и другими науками. Возникнув в конце XIX века как ветвь патологии человека и животных, с одной стороны, и фитопатологии — с другой, вирусология стала самостоятельной наукой, по праву занимающей одно из основных мест среди биологических наук. Глава 1. История вирусологии 1.1. Открытие вирусов Вирусология — молодая наука, ее история насчитывает немногим более 100 лет. Начав свой путь как наука о вирусах, вызывающих болезни человека, животных и растений, в настоящее время вирусология развивается в направлениях изучения основных законов современной биологии на молекулярном уровне, основываясь на том, что вирусы являются частью биосферы и важным фактором эволюции органического мира. История вирусологии необычна тем, что один из ее предметов — вирусные болезни — стал изучаться задолго до того, как были открыты собственно вирусы. Начало истории вирусологии — это борьба с инфекционными заболеваниями и только впоследствии — постепенное раскрытие источников этих болезней. Подтверждением тому служат работы Эдуарда Дженнера (1749-1823 гг.) по предупреждению оспы и работы Луи Пастера (1822-1895 гг.) с возбудителем бешенства. С незапамятных времен оспа была бичом человечества, унося тысячи жизней. Описания оспенной заразы встречаются в рукописях древнейших китайских и индийских текстов. Первые упоминания об эпидемиях оспы на европейском континенте датируются VI столетием нашей эры (эпидемия среди солдат эфиопской армии, осаждавшей Мекку), после чего наблюдался необъяснимый период времени, когда упоминания об эпидемиях оспы отсутствовали. Оспа снова начала гулять по континентам в XVII веке. Например, в Северной Америке (1617-1619 гг.) в штате Массачусетс погибло 9/10 населения, в Исландии (1707 г.) после эпидемии оспы от 57 тыс. человек осталось только 17 тыс., в г. Истхем (1763 г.) от 1331 жителя осталось 4 человека. В связи с этим, проблема борьбы с оспой стояла очень остро. Методика предупреждения оспы через прививку, называемая вариоляцией, была известна с давних времен. Упоминания о применении вариоляции в Европе датируются серединой 17-го века со ссылками на более ранний опыт применения в Китае, на Дальнем Востоке, в Турции. Суть вариоляции заключалась в том, что содержимое пустул от пациентов, болевших легкой формой оспы, вносили в маленькую ранку на коже человека, что вызывало легкое заболевание и предупреждало острую форму. Однако при этом сохранялась большая опасность заболевания тяжелой формой оспы и смертность среди привитых достигала 10%. Дженнер совершил переворот в методике предупреждения оспы. Он первый обратил внимание на то, что люди, переболевшие коровьей оспой, которая протекала легко, впоследствии никогда не болели оспой. 14 мая 1796 г. Дженнер внес в ранку Джеймса Фипса, никогда не болевшего оспой, жидкость из пустул больной коровьей оспой доярки Сары Селмес. На месте искусственной инфекции у мальчика появились типичные пустулы, которые через 14 дней исчезли. Тогда Дженнер внес в ранку мальчика высокоинфекционный материал из пустул больного оспой. Мальчик не заболел. Так зародилась и подтвердилась идея вакцинации (от латинского слова vacca — корова). Во времена Дженнера вакцинация понималась как внесение инфекционного материала коровьей оспы в организм человека с целью предотвращения заболевания натуральной оспой. Термин вакцина применяли к веществу, предохранявшему от оспы. С 1840 г. противооспенную вакцину стали получать заражением телят. Вирус оспы человека был открыт только в 1904 г. Таким образом, оспа — это первая инфекция, против которой была применена вакцина, т. е. первая управляемая инфекция. Успехи в вакцинопрофилактике черной оспы привели к ее искоренению в мировом масштабе. В наше время вакцинация и вакцина употребляются как общие термины, обозначающие прививку и прививочный материал. Пастер, по существу не знавший ничего конкретного о причинах бешенства, кроме неоспоримого факта его инфекционной природы, использовал принцип ослабления (аттенуации) возбудителя. В целях ослабления болезнетворных свойств возбудителя бешенства был использован кролик, в мозг которого ввели мозговую ткань умершей от бешенства собаки. После смерти кролика мозговая ткань его была введена следующему кролику и т. д. Было проведено около 100 пассажей, прежде чем возбудитель адаптировался к ткани мозга кролика. Будучи введен подкожно в организм собаки, он проявлял лишь умеренные свойства патогенности. Такой «перевоспитанный» возбудитель Пастер назвал «фиксированным», в отличие от «дикого», которому свойственна высокая патогенность. Позднее Пастер разработал метод создания иммунитета, состоящий из серии инъекций с постепенно увеличивающимся содержанием фиксированного возбудителя. Собака, прошедшая полный курс инъекций, оказалась в полной мере устойчивой к инфекции. Пастер пришел к выводу, что процесс развития инфекционной болезни, по существу, является борьбой микробов с защитными силами организма. «Каждая болезнь должна иметь своего возбудителя, а мы должны способствовать развитию иммунитета к этой болезни в организме пациента», — говорил Пастер. Еще не понимая, каким образом организм вырабатывает иммунитет, Пастер сумел использовать его принципы и направить механизмы этого процесса на пользу человека. В июле 1885 г. Пастеру представился случай испытать свойства «фиксированного» возбудителя бешенства на ребенке, укушенном бешеной собакой. Мальчику была проведена серия инъекций все более ядовитого вещества, причем последняя инъекция содержала уже полностью патогенную форму возбудителя. Мальчик остался здоров. Вирус бешенства был открыт Ремленже в 1903 г. Следует отметить, что ни вирус оспы, ни вирус бешенства не были первыми открытыми вирусами, поражающими животных и человека. Первое место по праву принадлежит вирусу ящура, открытому Леффлером и Фрошем в 1898 г. Эти исследователи, используя многократные разведения фильтрующегося агента, показали его ядовитость и сделали заключение о его корпускулярной природе. К концу XIX-го столетия выяснилось, что целый ряд заболеваний человека, таких как бешенство, оспа, грипп, желтая лихорадка являются инфекционными, однако их возбудители не обнаруживались бактериологическими методами. Благодаря работам Роберта Коха (1843-1910 гг.), который впервые использовал технику чистых бактериальных культур, появилась возможность различать бактериальные и небактериальные заболевания. В 1890 г. на X конгрессе гигиенистов Кох вынужден был заявить, что «…при перечисленных болезнях мы имеем дело не с бактериями, а с организованными возбудителями, которые принадлежат к совсем другой группе микроорганизмов». Это высказывание Коха свидетельствует, что открытие вирусов не было случайным событием. Не только опыт работы с непонятными по своей природе возбудителями, но и понимание сущности происходящего способствовали тому, что была сформулирована мысль о существовании оригинальной группы возбудителей инфекционных заболеваний небактериальной природы. Оставалось экспериментально доказать ее существование. Первое экспериментальное доказательство существования новой группы возбудителей инфекционных заболеваний было получено нашим соотечественником — физиологом растений Дмитрием Иосифовичем Ивановским (1864-1920 гг.) при изучении мозаичных заболеваний табака. Это неудивительно, так как инфекционные заболевания эпидемического характера часто наблюдались и у растений. Еще в 1883-84 гг. голландский ботаник и генетик де Фриз наблюдал эпидемию позеленения цветов и предположил инфекционную природу заболевания. В 1886 г. немецкий ученый Майер, работавший в Голландии, показал, что сок растений, больных мозаичной болезнью, при инокуляции вызывает у растений такое же заболевание. Майер был уверен, что виновником болезни является микроорганизм, и безуспешно искал его. В 19 веке заболевания табака наносили огромный вред сельскому хозяйству и в нашей стране. В связи с этим, для изучения заболеваний табака на Украину была направлена группа исследователей, в которую, будучи студентом Петербургского университета, входил Д.И. Ивановский. В результате изучения заболевания, описанного в 1886 г. Майером как мозаичная болезнь табака, Д.И. Ивановский и В.В. Половцев пришли к выводу, что оно представляет собой два различных заболевания. Одно из них — «рябуха» — вызывается грибком, а другое — неизвестного происхождения. Изучение мозаичной болезни табака было продолжено Ивановским в Никитском ботаническом саду под руководством академика А.С. Фамицина. Используя сок пораженного болезнью листа табака, профильтрованный через свечу Шамберлана, задерживающую самые мелкие бактерии, Ивановский вызвал заболевание листьев табака. Культивирование зараженного сока на искусственных питательных средах не дало результатов и Ивановский приходит к выводу, что возбудитель болезни имеет необычную природу — он фильтруется через бактериальные фильтры и не способен расти на искусственных питательных средах. Прогревание сока при 60-70 °C лишало его инфекционности, что свидетельствовало о живой природе возбудителя. Ивановский сначала назвал новый тип возбудителя «фильтрующиеся бактерии». Результаты работы Д.И. Ивановского были положены в основу его диссертации, представленной в 1888 г., и опубликованы в книге «О двух болезнях табака» в 1892 году. Этот год и считается годом открытия вирусов. Определенный период времени в зарубежных публикациях открытие вирусов связывали с именем голландского ученого Бейеринка (1851-1931 гг.), который также занимался изучением мозаичной болезни табака и опубликовал свои опыты в 1898 г. Профильтрованный сок зараженного растения Бейеринк поместил на поверхность агара, проинкубировал и получил на его поверхности бактериальные колонии. После этого верхний слой агара с колониями бактерий был удален, а внутренний слой был использован для заражения здорового растения. Растение заболело. Из этого Бейеринк сделал вывод, что причиной заболевания являются не бактерии, а некая жидкая субстанция, которая могла проникнуть внутрь агара, и назвал возбудителя «жидкий живой контагий». В связи с тем, что Ивановский только подробно описал свои опыты, но не уделил должного внимания небактериальной природе возбудителя, возникло недопонимание ситуации. Известность работы Ивановского приобрели только после того, как Бейеринк повторил и расширил его опыты и подчеркнул, что Ивановский впервые доказал именно небактериальный характер возбудителя самой типичной вирусной болезни табака. Сам Бейеринк признал первенство Ивановского и в настоящее время приоритет открытия вирусов Д.И. Ивановским признан во всем мире. Слово ВИРУС означает яд. Этот термин применял еще Пастер для обозначения заразного начала. Следует отметить, что в начале 19 века все болезнетворные агенты назывались словом вирус. Только после того, как стала понятна природа бактерий, ядов и токсинов терминами «ультравирус», а затем просто «вирус» стали обозначать «новый тип фильтрующегося возбудителя». Широко термин «вирус» укоренился в 30-е годы нашего столетия. В настоящее время ясно, что вирусы характеризуются убиквитарностью, то есть повсеместностью распространения. Вирусы поражают представителей всех царств живого: человека, позвоночных и беспозвоночных животных, растения, грибы, бактерии. Первое сообщение, имеющее отношение к вирусам бактерий было сделано Ханкин в 1896 г. В Летописи Института Пастера он заявил, что «... вода некоторых рек Индии обладает бактерицидным действием...», что без сомнения связано с вирусами бактерий. В 1915 г. Туорт в Лондоне, изучая причины лизиса бактериальных колоний, описал принцип передачи «лизиса» новым культурам в ряду поколений. Его работы, как это часто бывает, фактически оказались не замеченными, и два года спустя, в 1917 г., канадец де Эрелль повторно обнаружил явление лизиса бактерий, связанного с фильтрующимся агентом. Он назвал этот агент бактериофагом. Де Эрелль предполагал, что бактериофаг один. Однако исследования Барнета, работавшего в Мельбурне в 1924-34 гг., показали широкое разнообразие бактериальных вирусов по физическим и биологическим свойствам. Открытие многообразия бактериофагов вызвало большой научный интерес. В конце 30-х годов трое исследователей — физик Дельбрюк, бактериологи Лурия и Херши, работавшие в США, создали так называемую «Фаговую группу», исследования которой в области генетики бактериофагов в конечном итоге привели к рождению новой науки — молекулярной биологии. Изучение вирусов насекомых существенно отстало от вирусологии позвоночных животных и человека. В настоящее время ясно, что вирусы, поражающие насекомых, условно можно разделить на 3 группы: собственно вирусы насекомых, вирусы животных и человека, для которых насекомые являются промежуточными хозяевами, и вирусы растений, которые также поражают насекомых. Первый вирус насекомых, который был идентифицирован — вирус желтухи шелковичного червя (вирус полиэдроза тутового шелкопряда, названный Bollea stilpotiae). Еще в 1907 г. Провачек показал, что фильтрованный гомогенат больных личинок является инфекционным для здоровых личинок тутового шелкопряда, но только в 1947 г. немецкий ученый Бергольд обнаружил палочковидные вирусные частицы. Одним из наиболее плодотворных исследований в области вирусологии является изучение Ридом природы желтой лихорадки на волонтерах армии США в 1900-1901 гг. Убедительно было продемонстрировано, что желтая лихорадка вызывается фильтрующимся вирусом, который передавался комарами и москитами. Было также установлено, что москиты после впитывания инфекционной крови в течение двух недель остаются неинфекционными. Таким образом, был определен внешний инкубационный период заболевания (время, необходимое для репродукции вируса в насекомом) и установлены основные принципы эпидемиологии арбовирусных инфекций (вирусных инфекций, передаваемых кровососущими членистоногими). Способность размножения вирусов растений в своем переносчике — насекомом была показана в 1952 г. Мараморошу. Исследователь, используя технику инъекций насекомым, убедительно показал способность вируса желтухи астр размножаться в своем переносчике — шеститочечной цикаде. 1.2. Этапы развития вирусологии История достижений вирусологии напрямую связана с успехами развития методической базы исследований. ^ Основным методом идентификации вирусов в этот период был метод фильтрации через бактериологические фильтры (свечи Шамберлана), которые использовались как средство разделения возбудителей на бактерии и небактерии. С использованием фильтруемости через бактериологические фильтры были открыты следующие вирусы: 1892 г. — вирус табачной мозаики; 1898 г. — вирус ящура; 1899 г. — вирус чумы рогатого скота; 1900 г. — вирус желтой лихорадки; 1902 г. — вирус оспы птиц и овец; 1903 г. — вирус бешенства и вирус чумы свиней; 1904 г. — вирус оспы человека; 1905 г. — вирус чумы собак и вирус вакцины; 1907 г. — вирус денге; 1908 г. — вирус оспы и трахомы; 1909 г. — вирус полиомиелита; 1911 г. — вирус саркомы Рауса; 1915 г. — бактериофаги; 1916 г. — вирус кори; 1917 г. — вирус герпеса; 1926 г. — вирус везикулярного стоматита. 30-е годы — основным вирусологическим методом, используемым для выделения вирусов и их дальнейшей идентификации, являются лабораторные животные (белые мыши — для вирусов гриппа, новорожденные мыши — для вирусов Коксаки, шимпанзе — для вируса гепатита B, куры, голуби — для онкогенных вирусов, поросята-гнотобионты — для кишечных вирусов и т. д.). Первым, кто начал систематически использовать лабораторных животных при изучении вирусов, был Пастер, который еще в 1881 г. проводил исследования по инокуляции материала от больных бешенством в мозг кролика. Другая веха — работы по изучению желтой лихорадки, следствием которых явилось использование в вирусологической практике новорожденных мышей. Кульминацией этого цикла работ стало выделение Сайклзом в 1948 г. на мышах-сосунках группы вирусов эпидемической миалгии. 1931 г. — в качестве экспериментальной модели для выделения вирусов стали использоваться куриные эмбрионы, которые обладают высокой чувствительностью к вирусам гриппа, оспы, лейкоза, саркомы кур и некоторым другим вирусам. И в настоящее время куриные эмбрионы широко используются для выделения вирусов гриппа. 1932 г. — английский химик Элфорд создает искусственные мелкопористые коллоидные мембраны — основу для метода ультрафильтрации, с помощью которого стало возможным проводить определение размера вирусных частиц и дифференцировать вирусы по этому признаку. 1935 г. — применение метода центрифугирования дало возможность кристаллизации вируса табачной мозаики. В настоящее время методы центрифугирования и ультрацентрифугирования (ускорение на дне пробирки превышает 200000 g) широко используются для выделения и очистки вирусов. В 1939 г. для изучения вирусов впервые был применен электронный микроскоп, обладающий разрешающей способностью 0,2-0,3 нм. Использование ультратонких срезов тканей и метода негативного контрастирования водных суспензий позволило проводить изучение взаимодействия вирусов с клеткой и исследовать структуру (архитектуру) вирионов. Сведения, полученные с помощью электронного микроскопа, были значительно расширены с помощью рентгеноструктурного анализа кристаллов и псевдокристаллов вирусов. Совершенствование электронных микроскопов завершилось созданием сканирующих микроскопов, позволяющих получать объемные изображения. С использованием метода электронной микроскопии изучена архитектура вирионов, особенности их проникновения в клетку хозяина. В этот период была открыта основная масса вирусов. В качестве примера могут быть приведены следующие: 1931 г. — вирус гриппа свиней и вирус западного энцефаломиелита лошадей; 1933 г. — вирус гриппа человека и вирус восточного энцефаломиелита лошадей; 1934 г. — вирус паротита; 1936г. — вирус рака молочной железы мышей; 1937г. — вирус клещевого энцефалита. 40-е годы. В 1940 г. Хогланд с коллегами установили, что вирус осповакцины содержит ДНК, но не РНК. Стало очевидным, что вирусы отличаются от бактерий не только размерами и неспособностью расти без клеток, но и тем, что они содержат только один вид нуклеиновой кислоты — ДНК или РНК. 1941 г. — американский ученый Херст на модели вируса гриппа открыл феномен гемагглютинации (склеивания эритроцитов). Это открытие легло в основу разработки методов выявления и идентификации вирусов и способствовало изучению взаимодействия вируса с клеткой. Принцип гемагглютинации положен в основу ряда методов: ^ — реакция торможения гемагглютинации — применяется для идентификации и титрования вирусов. 1942 г. — Херст устанавливает наличие у вируса гриппа фермента, который позднее идентифицирован как нейраминидаза. 1949 г. — открытие возможности культивирования клеток животных тканей в искусственных условиях. В 1952 г. Эндерс, Уэллер и Роббинс получили Нобелевскую премию за разработку метода культуры клеток. Введение в вирусологию метода культуры клеток явилось важным событием, давшим возможность получения культуральных вакцин. Из широко применяемых в настоящее время культуральных живых и убитых вакцин, созданных на основе аттенуированных штаммов вирусов, следует отметить вакцины против полиомиелита, паротита, кори и краснухи. Создателями вакцин против полиомиелита являются американские вирусологи Сэбин (трехвалентная живая вакцина на основе аттенуированных штаммов полиовирусов трех серотипов) и Солк (убитая трехвалентная вакцина). В нашей стране советскими вирусологами М.П. Чумаковым и А.А. Смородинцевым разработана технология производства живой и убитой вакцин против полиомиелита. В 1988 г. Всемирная ассамблея здравоохранения поставила перед ВОЗ задачу ликвидации полиомиелита во всем мире с полным прекращением циркуляции дикого полиовируса. К настоящему времени достигнут огромный прогресс в этом направлении. Применение глобальной вакцинации против полиомиелита с применением «туровых» схем вакцинации позволило не только кардинально снизить заболеваемость, но и создать территории, свободные от циркуляции дикого полиовируса. Открыты вирусы: 1945 г. — вирус Крымской геморрагической лихорадки; 1948 г. — вирусы Коксаки. 50-е годы. В 1952 г. Дульбекко разрабатывает метод титрования бляшек в монослое клеток эмбриона цыпленка, что позволило ввести в вирусологию количественный аспект. 1956-62 гг. Уотсон, Каспар (США) и Клуг (Великобритания) разрабатывают общую теорию симметрии вирусных частиц. Структура вирусной частицы стала одним из критериев в системе классификации вирусов. Этот период характеризовался значительными достижениями в области бактериофагов: — установлена индукция профага лизогенизирующих фагов (Львов и др., 1950г.); — доказано, что инфекционность присуща фаговой ДНК, а не белковой оболочке (Херши, Чейз, 1952 г.); — открыто явление общей трансдукции (Циндер, Ледерберг, 1952 г.). Реконструирован инфекционный вирус табачной мозаики (Френкель-Конрад, Вильяме, Сингер, 1955-57 гг.), в 1955 г. получен в кристаллическом виде вирус полиомиелита (Шаффер, Шверд, 1955 г.). Открыты вирусы: 1951 г. — вирусы лейкоза мышей и ECHO; 1953 г. — аденовирусы; 1954 г. — вирус краснухи; 1956 г. — вирусы парагриппа, цитомегаловирус, респираторно-синцитиальный вирус; 1957 г. — вирус полиомы; 1959 г. — вирус аргентинской геморрагической лихорадки. 60-е и последующие годы характеризуются расцветом молекулярно-биологических методов исследования. Достижения в области химии, физики, молекулярной биологии и генетики легли в основу методической базы научных исследований, которые стали применяться не только на уровне методик, но и целых технологий, где вирусы выступают не только как объект исследований, но и как инструмент. Ни одно открытие молекулярной биологии не обходится без вирусной модели. 1967 г. — Катес и МакАуслан демонстрируют присутствие в вирионе осповакцины ДНК-зависимой РНК-полимеразы. В следующем году обнаруживается РНК-зависимая РНК-полимераза у реовирусов, а затем у парамиксо- и рабдовирусов. В 1968 г. Якобсон и Балтимор устанавливают наличие у полиовирусов геномного белка, соединенного с РНК, Балтимор и Бостон устанавливают, что геномная РНК полиовируса транслируется в полипротеин. Открыты вирусы: 1960 г. — риновирусы; 1963 г. — австралийский антиген (HBsAg). 70-е годы. Балтимор одновременно с Темином и Мизутани сообщают об открытии в составе РНК-содержащих онкогенных вирусов фермента обратной транскриптазы (ревертазы). Становится реальным изучение генома РНК содержащих вирусов. Изучение экспрессии генов у вирусов эукариот дало фундаментальную информацию о молекулярной биологии самих эукариот — существование кэп-структуры мРНК и ее роль в трансляции РНК, наличие полиадениловой последовательности на 3'-конце мРНК, сплайсинг и роль энхансеров в транскрипции впервые выявлены при изучении вирусов животных. 1972 г. — Берг публикует сообщение о создании рекомбинантной молекулы ДНК. Возникает новый раздел молекулярной биологии — генная инженерия. Применение технологии рекомбинантных ДНК позволяет получать белки, имеющие важное значение в медицине (инсулин, интерферон, вакцины). 1975 г. — Келер и Мильштейн получают первые линии гибридов, продуцирующих моноклональные антитела (МКА). На основе МКА разрабатываются самые специфичные тест-системы для диагностики вирусных инфекций. 1976 г. — Бламберг за открытие HBsAg получает Нобелевскую премию. Установлено, что гепатит A и гепатит B вызываются разными вирусами. Открыты вирусы: 1970 г. — вирус гепатита B; 1973 г. — ротавирусы, вирус гепатита A; 1977 г. — вирус гепатита дельта. 80-е годы. Развитие заложенных отечественным ученым Л.А. Зильбером представлений о том, что возникновение опухолей может быть связано с вирусами. Компоненты вирусов, ответственные за развитие опухолей, назвали онкогенами. Вирусные онкогены оказались в числе лучших модельных систем, помогающих изучению механизмов онкогенетической трансформации клеток млекопитающих. 1985 г. — Мюллис получает Нобелевскую премию за открытие полимеразной цепной реакции (ПЦР). Это — молекулярно-генетический метод диагностики, позволивший, кроме того, усовершенствовать технологию получения рекомбинантных ДНК и открыть новые вирусы. Открыты вирусы: 1983 г. — вирус иммунодефицита человека; 1989 г. — вирус гепатита C; 1995 г. — с использованием ПЦР открыт вирус гепатита G. 1.3. Развитие концепции о природе вирусов Ответы на вопросы «Что такое вирусы?» и «Какова их природа?» составляли предмет дискуссии многие годы со времени их открытия. В 20-30 гг. никто не сомневался, что вирусы являются живой материей. В 30-40 гг. считалось, что вирусы — это микроорганизмы, так как способны размножаться, обладают наследственностью, изменчивостью и приспособляемостью к меняющимся условиям среды обитания, и, наконец, подвержены биологической эволюции, которая обеспечивается естественным и искусственным отбором. В 60-е годы первые успехи молекулярной биологии определили закат концепции о вирусах как организмах. В онтогенетическом цикле вируса выделены две формы — внеклеточная и внутриклеточная. Для обозначения внеклеточной формы вируса введен термин ВИРИОН. Установлены отличия его организации от строения клеток. Обобщены факты, указывающие на совершенно отличный от клеток тип размножения, названный дисъюнктивная репродукция. Дисъюнктивная репродукция — это временная и территориальная разобщенность синтеза вирусных компонентов — генетического материала и белков — от последующей сборки и формирования вирионов. Показано, что генетический материал вирусов представлен одним из двух типов нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК). Сформулировано, что основным и абсолютным критерием отличия вирусов от всех других форм жизни является отсутствие у них собственных белоксинтезирующих систем. Накопившиеся данные позволили прийти к выводу, что вирусы не являются организмами, пусть даже мельчайшими, так как любые, даже минимальные организмы типа микоплазм, риккетсий и хламидий имеют собственные белоксинтезирующие системы. Согласно определению, сформулированному академиком В.М. Ждановым, вирусы являются автономными генетическими структурами, способными функционировать только в клетках с разной степенью зависимости от клеточных систем синтеза нуклеиновых кислот и полной зависимостью от клеточных белоксинтезирующих и энергетических систем, и подвергающимися самостоятельной эволюции. С точки зрения паразитологии, вирусы — облигатные внутриклеточные паразиты. Паразитизм (от греческого parasitos — нахлебник) — состояние симбиоза, при котором один организм (паразит) живет за счет другого, нанося ему вред. При этом паразит физически и физиологически зависит от хозяина. Внутриклеточный паразитизм — это высшая стадия облигатного паразитизма, суть которого заключается в абсолютной зависимости метаболизма паразита от организма хозяина и характеризуется полной невозможностью размножения паразита за пределами клетки. Однако уровень паразитизма вирусов качественно иной, чем у внутриклеточных паразитов-микроорганизмов. Вирусы — это генетические паразиты. Крайним проявлением генетического паразитизма является способность ряда вирусов интегрировать в геном клетки хозяина. С этой точки зрения вирусы могут быть определены как особая неклеточная форма жизни, которой присущ строгий внутриклеточный паразитизм на молекулярном и молекулярно-генетическом уровнях, Таким образом, вирусы представляют собой многообразную и многочисленную группу неклеточных форм жизни, не являющихся микроорганизмами, и объединенных в царство Vira, Вирусы изучаются в рамках вирусологии, которая представляет собой самостоятельную научную дисциплину, имеющую свой объект и методы исследования. Вирусологию разделяют на общую и частную, а вирусологические исследования — на фундаментальные и прикладные. Предметом фундаментальных исследований в вирусологии является архитектура вирионов, их состав, особенности взаимодействия вирусов с клеткой, способы переноса наследственной информации, молекулярные механизмы синтеза элементов и процесс их объединения в целое, молекулярные механизмы изменчивости вирусов и их эволюция. Прикладные исследования в вирусологии связаны с решением проблем медицины, ветеринарии и фитопатологии. ГЛАВА 2 ^ В онтогенетическом цикле вируса выделены две стадии — внеклеточная и внутриклеточная и, соответственно, две формы его существования — вирион и вегетативная форма. Вирион — это целая вирусная частица, в основном состоящая из белка и нуклеиновой кислоты, часто устойчивая к воздействию факторов внешней среды и приспособленная для переноса генетической информации из клетки в клетку. Вегетативная форма вируса существует в едином комплексе вирус-клетка и только в их тесном взаимодействии. 2.1. Архитектура вирионов Внеклеточная форма вируса — вирион, предназначенная для сохранения и переноса нуклеиновой кислоты вируса, характеризуется собственной архитектурой, биохимическими и молекулярно-генетическими особенностями. Под архитектурой вирионов понимают ультратонкую структурную организацию этих надмолекулярных образований, различающихся размерами, формой и сложностью строения. Для описания архитектуры вирусных структур разработана номенклатура терминов: Белковая субъединица — единая, уложенная определенным образом полипептидная цепь. Структурная единица (структурный элемент) — белковый ансамбль более высокого порядка, образованный несколькими химически связанными идентичными или неидентичными субъединицами. Морфологическая единица — группа выступов (кластер) на поверхности капсида, видимая в электронном микроскопе. Часто наблюдаются кластеры, состоящие из пяти (пентамер) и шести (гексамер) выступов. Это явление получило название пентамерно-гексамерной кластеризации. Если морфологическая единица соответствует химически значимому образованию (сохраняет свою организацию в условиях мягкой дезинтеграции), то применяют термин капсомер. Капсид — внешний белковый чехол или футляр, образующий замкнутую сферу вокруг геномной нуклеиновой кислоты. Кор (core) — внутренняя белковая оболочка, непосредственно примыкающая к нуклеиновой кислоте. Нуклеокапсид — комплекс белка с нуклеиновой кислотой, представляющий собой упакованную форму генома. Суперкапсид или пеплос — оболочка вириона, образованная липидной мембраной клеточного происхождения и вирусными белками. Матрикс — белковый компонент, локализованный между суперкапсидом и капсидом. Пепломеры и шипы — поверхностные выступы суперкапсида. Как уже отмечалось, вирусы могут проходить через самые микроскопические поры, задерживающие бактерии, за что и были названы фильтрующимися агентами. Свойство фильтруемости вирусов обусловлено размерами, исчисляемыми нанометрами (нм), что на несколько порядков меньше, чем размеры самых мелких микроорганизмов. Размеры вирусных частиц, в свою очередь, колеблются в относительно широких пределах. Самые мелкие просто устроенные вирусы имеют диаметр чуть больше 20 нм (парвовирусы, пикорнавирусы, фаг Qβ), вирусы средних размеров — 100-150 нм (аденовирусы, коронавирусы). Наиболее крупными признаны вирусные частицы осповакцины, размеры которых достигают 170x450 нм. Длина нитевидных вирусов растений может составлять 2000 нм. Представители царства Vira характеризуются разнообразием форм. По своей структуре вирусные частицы могут быть простыми образованиями, а могут представлять собой достаточно сложные ансамбли, включающие несколько структурных элементов. Условная модель гипотетического вириона, включающего все возможные структурные образования, представлена на рисунке 1. Существует два типа вирусных частиц (ВЧ), принципиально отличающихся друг от друга: 1) ВЧ, лишенные оболочки (безоболочечные или непокрытые вирионы); 2) ВЧ, имеющие оболочку (оболочечные или покрытые вирионы). Рис. 1. Строение гипотетического вириона 2.1.1. Строение вирионов, лишенных оболочки Выделено три морфологических типа вирионов, лишенных оболочки: палочковидные (нитевидные), изометрические и булавовидные (рис. 2). Существование первых двух типов непокрытых вирионов определяется способом укладки нуклеиновой кислоты и ее взаимодействием с белками. 1. Белковые субъединицы связываются с нуклеиновой кислотой, располагаясь вдоль нее периодическим образом так, что она сворачивается в спираль и образует структуру под названием нуклеокапсид. Такой способ регулярного, периодического взаимодействия белка и нуклеиновой кислоты определяет образование палочковидных и нитевидных вирусных частиц. 2. Нуклеиновая кислота не связана с белковым чехлом (возможные нековалентные связи очень подвижны). Такой принцип взаимодействия определяет образование изометрических (сферических) вирусных частиц. Белковые оболочки вирусов, не связанные с нуклеиновой кислотой, называют капсидом. 3. Булавовидные вирионы обладают дифференцированной структурной организацией и состоят из ряда дискретных структур. Основными структурными элементами вириона являются изометрическая головка и хвостовой отросток. В зависимости от вируса в структуре вириона также могут присутствовать муфта, шейка, воротничок, хвостовой стержень, хвостовой чехол, базальная пластинка и фибриллы. Наиболее сложную дифференцированную структурную организацию имеют бактериофаги T-четной серии, вирион которых состоит из всех перечисленных структурных элементов. Вирионам или их компонентам могут быть присущи два основных типа симметрии (свойство тел повторять свои части) — спиральный и икосаэдрический. В том случае, если компоненты вириона обладают разной симметрией, то говорят о комбинированном типе симметрии ВЧ. (схема 1). Спиральная укладка макромолекул описывается следующими параметрами: числом субъединиц на виток спирали (u, число необязательно целое); расстоянием между субъединицами вдоль оси спирали (p); шагом спирали (P); P=pu. Классическим примером вируса со спиральным типом симметрии является вирус табачной мозаики (ВТМ). Нуклеокапсид этого палочковидного вируса размером 18x300 нм состоит из 2130 идентичных субъединиц, на виток спирали приходится 16 1/3 субъединиц, шаг спирали составляет 2,3 нм. Икосаэдрическая симметрия — самая эффективная для конструирования замкнутого чехла из отдельных субъединиц. При рассмотрении элементов икосаэдрической симметрии следует различать понятия симметрия и форма. Симметрия в данном случае — это набор поворотов, которые переводят объект сам в себя, форма — это лишь общий вид кубической поверхности объекта (тетраэдр, октаэдр, додекаэдр и т. д.). Многие объекты, имея икосаэдрическую симметрию, не имеют икосаэдрической формы. Икосаэдр — это геометрическая фигура, имеющая 12 вершин, 20 граней, 20 ребер. Наименьшее число структурных элементов, способных образовать икосаэдр, равно 60, однако капсиды сложноустроенных вирусов могут быть образованы 60n структурными элементами. Для описания икосаэдрической упаковки структурных элементов в капсиде введено так называемое триангуляционное число (T). Это число, равное частному от деления числа субъединиц на 60. Так, у вируса некроза табака и фага φX174 T=1 (60 субъединиц), многие вирусы растений имеют T=3 (180 субъединиц), вирус Синдбис имеет T=4 (240 субъединиц), ротавирус имеет T=13 (780 субъединиц). Многие крупные икосаэдрические вирусы для получения плотной упаковки капсида формируют субтриангуляции на основе структур меньших размеров, что предполагает наличие разных типов субъединиц на вершинах икосаэдра и нарушение локальной симметрии в местах их контактов. В этом случае наблюдается расхождение между реально существующей симметрией ВЧ и видом структуры с соответствующим числом Т. Наиболее простую конструкцию капсида, построенного по такому принципу, имеют паповавирусы. Их капсид образован 72 морфологическими единицами, каждая построена из трех белковых субъединиц, организованных в пентамеры, а ВЧ имеет вид структуры с Т=7. Схема 1. Типы симметрии вирусных частиц Более сложная структура вириона наблюдается у аденовируса, капсид которого организован по принципу ансамблей, обладает строгой икосаэдрической симметрией и имеет вид структуры с Т=25. На вершинах икосаэдра находятся кластеры — пентоны, содержащие в основании так называемые фибры — стержень с утолщением на конце. Остальная структура капсида построена из гексонов. Гексоны и пентоны — это простейшие подструктуры капсида аденовирусов. Всего в состав аденовириона входит 12 оснований пентонов и 240 гексонов. При диссоциации в мягких условиях образуются надструктуры (капсомеры), состоящие из 9-ти гексонов. Еще более сложноустроенные вирионы, на пример частицы бактериофагов T-чётной серии, обладают комбинированным типом симметрии. Так, головка бактериофага T4 имеет икосаэдрический тип симметрии, а сокращенный чехол хвостового отростка обладает спиральным типом симметрии. В целом вирион фага T4 обладает комбинированным типом симметрии. 2.1.2. Строение вирионов с оболочкой Другой тип вирусных частиц — это покрытые или оболочечные вирионы. Оболочечные вирионы, также как и непокрытые, могут быть палочковидными, нитевидными и изометрическими разной формы — от четко очерченных кирпичеобразных вирионов вируса оспы до плейоморфных частиц вирусов герпеса и коронавирусов, имеющих различные размеры и форму. Оболочка вириона (пеплос, суперкапсид) состоит из липидсодержащей мембраны клеточного происхождения (цитоплазматической мембраны, мембраны эндоплазматического ретикулюма или аппарата Гольджи, ядерной мембраны) и вирусных гликопротеинов, встроенных в мембрану. Оболочку вирионы приобретают в процессе почкования через ту или иную мембрану. Вирусные гликопротеины, находящиеся в мембране, как правило, формируют поверхностные выступы, называемые шипами и пепломерами. Эти поверхностные выступы характеризуются разной степенью упорядоченности и могут быть представлены одним белком (вирус кори) или двумя разными белками (вирусы гриппа, ретровирусы), могут быть образованы мономерами белка или его димерами и тримерами. Таким образом, структурная организация вириона описывается двумя характеристиками — наличием/отсутствием оболочки и типом симметрии капсида. Оболочечные вирионы могут обладать икосаэдрической, спиральной и комбинированной симметрией капсида, также как и безоболочечные, что представлено на схеме 2. Вирионы без оболочки Вирионы с оболочкой Спиральная Комбинированная Икосаэдрическая симметрия симметрия симметрия Схема 2. Характеристика структурной организации вирионов 2.2. Химический состав вирусов Основными химическими соединениями, которые входят в состав всех вирусов, являются белки и нуклеиновые кислоты. В состав ряда вирусов входят липиды и углеводы. 2.2.1. Белки Локализация вирусных белков. Белки, связанные с жизненным циклом вируса, разделяют на белки, детерминируемые геномом вируса и белки, имеющие клеточное происхождение. В качестве примера клеточных белков, которые обнаружены в составе некоторых вирионов, могут быть приведены белок цитоскелета — актин, и ядерные белки — гистоны. Белки клеточного происхождения, участвующие в процессе репликации вируса, будут рассмотрены в разделе взаимодействия вируса с клеткой. По месту локализации белки, детерминируемые вирусным геномом, разделяют на две группы: 1) структурные белки — это белки, входящие в состав ВЧ, их обозначают как VP; 2) неструктурные белки — это предшественники структурных белков, регуляторные белки и ферменты, обслуживающие процесс внутриклеточной репродукции вируса и не входящие в состав ВЧ. Их обозначают как NS-белки (схема 3). Свойства вирусных белков. В состав вирионов входят белки с различной молекулярной массой (от 4 до 100 кД), состоящие из одной или нескольких полипептидных цепей. Количество этих белков также различно у разных вирусов. В состав нуклеокапсида ВТМ входит один белок. У других вирусов в состав вириона может входить несколько десятков белков, имеющих различные физико-химические свойства. Белки, формирующие капсид, нуклеокапсид и коровую оболочку, обладают одним общим свойством — способностью к самосборке. В состав ВЧ могут входить низкомолекулярные белки, не участвующие в формировании капсида. Например, геномные белки пикорнавирусов и аденовирусов. Геномный белок ковалентно связан с нуклеиновой кислотой и участвует в ее репликации. ^ Детерминированы геномом вируса Имеют клеточное происхождение Белки суперкапсида, ферменты, гистоны Неструктурные: Предшественники архитектурных белков Ферменты Регуляторные белки Структурные: Архитектурные (суперкапсидные, капсидные, матриксные, коровые) Ферменты Геномные Схема 3. Локализация вирусных белков Сложные белки представлены гликопротеинами (обозначают как gp) и липопротеинами. Наличие гликопротеина определяет присутствие в вирионе углеводного компонента, который может быть представлен олигосахаридами маннозного типа, галактозой, N-ацетилглюкозамином или нейраминовой кислотой. Вирусные гликопротеины, как правило, экспонированы на наружной поверхности ВЧ и выполняют три основные функции: обеспечивают связывание вириона с клеточным рецептором (функция прикрепительного белка), обладают фузионной активностью (обеспечивают слияние мембран) и определяют антигенные свойства вирусов. В то же время, вирусные гликопротеины могут быть и неструктурными белками и, оставаясь в интегральной форме в мембране шероховатого эндоплазматического ретикулюма (ШЭР), выполнять функции транслоказ, обеспечивая транспорт вирусных компонентов в его просвет. Вирусные липопротеины представлены белками, ацилированными, как правило, миристиновой (C14) кислотой. Остатки жирных кислот, соединенные с молекулой белка, выполняют функцию липофильного якоря. Вирусные белки-ферменты могут входить в состав вирусной частицы или являться неструктурными белками и появляться в клетке после экспрессии вирусного генома. Наиболее оснащенным ферментами является вирион вируса оспы, который имеет практически полный набор энзимов, необходимых для независимой внутриклеточной репликации вируса. В то же время, мелкие просто организованные изометрические вирусы с позитивным РНК-геномом могут не иметь никаких ферментов в составе вириона. Функционально активные белки вирусов представлены, в первую очередь, ферментами нуклеинового обмена, обеспечивающими сложные механизмы репликации/транскрипции вирусного генома; ферментами, осуществляющими посттрансляционный процессинг и модификацию белков, и ферментами, участвующими в проникновении вирионов в клетку хозяина. Первая группа ферментов наиболее многочисленна и включает как аналоги клеточных ферментов, так и вирус-специфические ферменты. ДНК-зависимая ДНК-полимераза — осуществляет синтез ДНК на матрице ДНК (вирус оспы). ДНК-зависимая РНК-полимераза — осуществляет синтез мРНК на матрице ДНК (вирус оспы). РНК-зависимая РНК-полимераза — осуществляет синтез РНК на матрице РНК. Выполняет функции транскриптазы и репликазы. Впервые обнаружена в 1970 г. Балтимором у вируса везикулярного стоматита. Входит в состав вирионов или является NS-белком РНК-содержащих вирусов. Обратная транскриптаза или ревертаза или РНК-зависимая ДНК-полимераза осуществляет синтез ДНК на матрице РНК. Впервые открыта в 1970 г. у ретровирусов Темином и Мизутани. Хеликаза — осуществляет расплетете двухнитевой структуры ДНК. Кроме этого хеликазы обладают нуклеотидтрифосфат-зависимой РНК-хеликазной активностью, которая включает три процесса: связывание дезоксинуклеотидтрифосфата, его гидролиз и за счет этой энергии расплетение двухнитевой РНК. мРНК-модифицирующие ферменты: поли-А-полимераза — аденилирует 3'-конец РНК за счет энергии АТФ; Кэп-энзим и метилтрансферазный комплекс — катализирует образование на 5'-конце кэп-структуры. АТФ-аза, ГТФ-аза — осуществляют гидролиз соответствующих энергетических субстратов. Рибонуклеаза Н — разрушает РНК, находящуюся в дуплексе с ДНК. Вторая группа вирусных ферментов — ферменты белкового обмена. Здесь мы приведем лишь некоторые из них: Протеиназы — ферменты, участвующие в посттрансляционном процессинге полипротеинов. Являются NS-белками РНК-содержащих вирусов; Протеинкиназы — ферменты, фосфорилирующие структурные белки вирионов. Обнаружены в составе вируса везикулярного стоматита, вируса бешенства, альфавирусов и ретровирусов. Примерами ферментов, участвующих в проникновении вирусов в клетку, являются лизоцим бактериофагов и нейраминидаза вируса гриппа. 2.2.2. Липиды Все оболочечные РНК-содержащие почкующиеся вирусы имеют липиды клеточного происхождения, входящие в состав суперкапсида (15-30% от сухого веса). 50-60% липидов представлены фосфолипидами, 20-30% составляет холестерин. У ДНК-геномных вирусов липиды содержат вирусы оспы, герпеса, гепатита B. Это непочкующиеся вирусы. У вируса оспы липиды не образуют дифференцированной оболочки, которая формируется в цитоплазме в процессе морфогенеза поксвириона. Липиды вируса гепатита B образуются путем инвагинации мембран эндоплазматического ретикулюма (ЭПР). Липидсодержащая оболочка вируса герпеса формируется при прохождении внутреннего компонента вириона через ядерную мембрану. Следовательно, в состав вирусной оболочки герпесвирусов входят липиды ядерной мембраны. 2.2.3. Нуклеиновые кислоты Клетки всех живых организмов содержат два вида нуклеиновой кислоты — ДНК (двухнитевая ДНК клеточного генома) и РНК (мРНК, тРНК, рРНК). В отличие от клеток, вирионы содержат только один вид нуклеиновой кислоты — ДНК или РНК. И та и другая являются хранителями наследственной информации и выполняют функции генома. Однако следует учитывать, что наличие одного вида нуклеиновой кислоты является характеристикой вириона, но не вируса. В жизненном цикле вируса его геномная нуклеиновая кислота транскрибируется, то есть ДНК-содержащие вирусы образуют РНК. Ряд РНК-содержащих вирусов имеют в цикле репродукции стадию обратной транскрипции и синтезируют ДНК на матрице РНК. Примерно 20% всех вирусов имеют ДНК-геном, 80% — РНК-геном. Способность РНК хранить наследственную информацию — уникальное свойство вирусов. Размеры вирусных геномов (длина нуклеотидных последовательностей, выраженная в нуклеотидах) варьируют в широких пределах — от 1,7 тысяч нуклеотидов (т.н.) у цирковируса свиней до 300 т.н. у фикоднавирусов архибактерий. Кроме того, что геном вирусов может быть представлен или ДНК или РНК, он может находиться в разных видах — в виде двухнитевой (дн) или однонитевой (он) формы, в виде линейной или кольцевой, в виде непрерывной или сегментированной формы (схема 4). РЯК двухнитевая однонитевая ДНК двухнитевая однонитевяя I I линейная кольцевая линейная кольцевая линейная / кольцевая сегментирован- /сегментирован- сегментированная непрерывная частично двухнитевая линейная (+)РНК (-)РНК непрерывная сегментированная Схема 4. Виды нуклеиновых кислот вирусов Особенностями ДНК-геномов является то, что линейные молекулы никогда не имеют бессмысленных концов. Концы молекул могут содержать прямые (►►) или инвертированные концевые повторы (►◄), выступающие комплементарные (липкие) концы, самокомплементарные концевые последовательности, терминальные геномные белки (○) (рис. 3). ~^-*> —*► дн, линейная с прямыми концевыми повторами Герпесвирусы Фаги Т7, Т2 пм дн, линейная с инвертированными повторами и терминальными белками Аденовирусы г» дн, линейная с липкими концами Фаг X дн, с ковалентно замкнутыми концами (терминальные петли) 1 J Поксвирусы Иридовирусы дн, с разрывами одной цепи ФагТ5 & частично дн, кольцевая Гепаднавирусы @ дн, кольцевая Папиломавирусы Фаг RM2 <*> о он, кольцевая Фаги фХ 174, Ml3 он, линейная с самокомплементарной 3'-последовательностью —> Парвовирусы Рис. 3. Виды ДНК-геномов вирусов +Кэ AAA 5'-кэп, 3'-поли-А последовательность Флавирусы 1 Коронавирусы +Кэп — -tf 5'-кэп, 3'-тРНК-подобная структура ВТМ +VPg п - AAA 5'-терминальный геномный белок Калицивирусы Пикорнавирусы Потивирусы +Кэп +Кэп AAA AAA диплоидный набор Ретровирусы - он,линейная Парамиксовирусы Рабдовирусы 1 1 он, линейная, сегментированная Ортомиксовирусы (7-8 сегментов) L О М О S О он, кольцевая, сегментированная Буньявирусы Аренавирусы — дн, линейная, сегментированная Реовирусы (10-11 сегментов) II + 1 — обоюдозначащая (амбисенс) РНК S-сегмент аренавиру- сов Тосповирусы Рис. 4. Виды РНК-геномов вирусов Многообразие видов РНК геномов расширяется за счет существования последовательностей, отличающихся направлением связей сахаро-фосфатного остова (рис. 4). Однонитевые РНК могут иметь позитивную полярность — (+)РНК, негативную полярность — (-)РНК или могут быть представлены обоюдозначащей цепью — (+,-)РНК (амбисенс стратегия кодирования). В свою очередь, РНК позитивной полярности могут иметь разную структурную организацию: могут, являясь матричной РНК, иметь на 5'-конце кэп (7-метилгуанозин, Сар), а на 3'-конце — поли-А (poly-A) последовательность; могут не иметь кэпа или поли-А; могут иметь на 5'-конце геномный белок; могут иметь на 3'-конце тРНК-подобную или шпильковую структуру. Виды геномов вирусов легли в основу их классификации. Однако следует учитывать, что вид генома в настоящее время не является формальным таксоном и используется для удобства ориентации в многообразии вирусов. ГЛАВА 3 ^ 3.1. Пути распространения вирусов в биосфере Экологическая ниша вирусов — это многокомпонентная система взаимосвязанных элементов, включающая клетку, организм, популяцию хозяина, переносчиков, другие вирусы и внешнюю среду. Для сохранения вируса как биологического вида необходима его последовательная передача от хозяина к хозяину. Передача происходит по горизонтальному и вертикальному направлениям, что имеет место не только в популяциях человека и животных, но и среди бактерий, насекомых, растений, грибов. Горизонтальная передача — рассеивание возбудителей среди восприимчивых хозяев с использованием различных механизмов и путей, во многом определяемых средой обитания и особенностями жизнедеятельности организма-хозяина. Вертикальная передача — это передача возбудителя от родителей потомству, которая также может осуществляться различными путями, и предполагает сохранение вируса в ряду поколений. Бактериофаги в природных условиях встречаются в тех местах, где есть чувствительные бактерии (в воде, почве, выделениях человека и животных), которые инфицируются вирусом при случайных контактах и распространяются водными потоками или путями, используемыми хозяином. Применение бактериофагов в качестве лечебных препаратов значительно увеличило интенсивность циркуляции вирусов бактерий в биосфере. Возможно распространение бактериофагов воздушным путем, что создает определенные трудности при работе с бактериальными культурами в научно-исследовательских лабораториях. Вирусы растений могут распространяться в процессе размножения хозяев (с пыльцой, семенами), где важную роль играют природные факторы (дождь, ветер, птицы). Человек распространяет вирусы растений при использовании зараженного посадочного материала (вегетативные побеги, семена), а также при использовании зараженной земли. Однако основными переносчиками фитопатогенных вирусов являются их промежуточные хозяева (насекомые, клещики, нематоды, фитопатогенные грибы). Вирусы насекомых инфицируют хозяина в процессе его питания и размножения. Различают трасспермальную, трансовариальную и трансстадийную (в процессе метаморфоза) передачи вируса. Распространяются вирусы в процессе миграций насекомых. Распространение вирусов позвоночных осуществляется с использованием механизмов, которые реализуются различными путями, и часто включают внешнюю среду и промежуточных хозяев вируса. Важную роль в распространении вирусов играют миграционные процессы, наблюдаемые среди людей и животных. Распространение вирусов в человеческой популяции имеет свои особенности. В соответствии с четырьмя основными типами локализации возбудителя в организме (дыхательные пути, желудочно-кишечный тракт, кровь, наружные покровы) выделены несколько механизмов передачи вирусов. Трансмиссивный механизм — передача с помощью биологических переносчиков. При любом варианте такой передачи вирус черпается переносчиком из внутренних сред донора и внедряется во внутреннюю среду реципиента. Парентеральный механизм — передача вирусов через кровь. Вирусы, циркулирующие в крови, могут передаваться в процессе переливаний крови, при использовании загрязненных шприцев и других медицинских инструментов (искусственный путь), в процессе сексуальных контактов (половой путь) и другими путями. Алиментарный (энтеральный) механизм — вирус проникает через слизистые оболочки органов пищеварения. Разновидностью алиментарного механизма является фекально-оральный механизм передачи вируса. Аэрогенный механизм — входными воротами инфекции являются слизистые органов дыхания. Реализуется воздушно-капельным или пылевым путем. Контактный механизм — реализуется через кожные покровы. Такой механизм передачи могут использовать очень немногие вирусы. Так, например, вирус бешенства может проникать в организм животного и человека при ослюнении кожных покровов. Слюна собак содержит гиалуронидазу, которая облегчает проникновение вируса в кровь через кожу. Вертикальный механизм — передача вирусов от матери плоду во время вынашивания и родов. Возбудитель может передаваться через плаценту, через околоплодные воды и оболочки, при прохождении плода через родовые пути матери. Таблица 1 Механизмы и пути распространения вирусов человека
^ Циркулируя в биосфере, вирус встречает восприимчивого хозяина, проникает в организм и может вызвать инфекцию. Инфекция (infectio) — заражение. Как биологическое явление представляет собой процесс взаимодействия одного или нескольких видов возбудителей-паразитов с более высокоорганизованным организмом хозяина, который может проявляться болезнью или носительством. Совокупность вызываемых патологических изменений в организме определяется как инфекционный процесс. Проникновение вируса в организм хозяина у разных биологических видов решается по-разному. 1. Вирусы растений проникают в организм хозяина по типу раневых инфекций, где распространяются по плазмодесмам, ксилеме и флоэме. 2. Вирусы бактерий — путем введения нуклеиновой кислоты в тело клетки или путем проникновения вириона. 3. Вирусы насекомых попадают в организм хозяина в процессе питания или размножения. 4. Вирусы животных и человека при инфицировании организма хозяина проходят более сложный путь. Одни вирусы (вирус гриппа, ротавирусы) реплицируются и вызывают заболевание в месте проникновения в организм (входные ворота инфекции). Другие вирусы, попав в организм хозяина с использованием того или иного механизма, проходят стадию распространения. Распространение вируса в организме сопровождается виремией (вирусемией) — циркуляцией вируса в крови, что свидетельствует о генерализации инфекции. Различают несколько путей распространения вирусов в организме: 1. Нейронный путь (вирусы бешенства, герпеса). 2. Лимфатический путь (реовирусы, полиомавирусы). 3. Гематогенный путь, ассоциированный с клеточными компонентами и плазмой крови (вирус краснухи, вирусы гепатита B и C, цитомегаловирус, энтеровирусы). Сохранение вируса как биологического вида обеспечивает его восприимчивый хозяин, который является основным элементом экологической ниши вируса. Способность клеток или организма хозяина заражаться называется восприимчивостью. Спектр хозяев разных вирусов значительно варьирует. Одни вирусы имеют широкий круг хозяев, другие заражают лишь определенные клетки одного вида хозяина. Широта круга хозяев может быть ограничена видом (видоспецифические вирусы) или определяться таксономическими категориями более высокого порядка. Вирусы, имеющие широкий круг хозяев, распространены среди вирусов растений. Например, вирус табачной мозаики и вирус желтухи астр инфицируют как растения, так и своего переносчика-насекомого. Примером вирусов животных и человека, имеющих несколько хозяев, являются арбовирусы. Вирус лихорадки Западного Нила инфицирует человека, комаров, водоплавающих птиц; вирус клещевого энцефалита — человека, животных, клещей. Однако не найдены вирусы, способные поражать одновременно клетки прокариот и эукариот. Экологические ниши вирусов, выражающиеся в круге восприимчивых хозяев, сложились в ходе эволюции. Однако они могут меняться, и вирусы способны преодолевать межвидовые барьеры. Так, вирусы гриппа циркулируют среди многих видов животных и птиц, которые являются резервуаром сохранения вируса в межэпидемический период. В Китае среди детей часто наблюдаются вспышки кишечной инфекции, вызванной ротавирусами антигенной группы B, резервуаром которых являются крысы. В качестве примера вируса, преодолевшего межвидовой барьер, можно привести вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), который перешел в человеческую популяцию от обезьян. Процесс адаптации вируса к новым хозяевам определяется мутациями рецептор-распознающих участков вирионов и собственно изменением вирулентности для данного биологического вида. Однако следует понимать, что не все так однозначно и изучение молекулярных основ преодоления межвидовых барьеров еще впереди. Для того чтобы размножиться, вирус должен найти восприимчивую клетку. Каждый вирус обладает так называемой тканевой тропностью — способностью инфицировать клетки определенного типа. Так, вирусы растений поражают или ткань листа, или ткань прицветника или клетки корневой системы. Вирусы бактерий видоспецифичны — вирусы архибактерий не могут инфицировать клетку E. coli, а многие колифаги не проникают в клетку шигеллы. Наиболее выражена тканевая специфичность вирусов животных и человека. Так, вирусы гепатитов поражают гепатоциты, вирус Эпштейна-Барр (вызывает инфекционный мононуклеоз) обладает тропностью к B-лимфоцитам, ВИЧ — к T-лимфоцитам, кишечные вирусы — к энтероцитам, кардиотропностью обладают вирусы Коксаки B. Целый ряд вирусов обладает тропностью не к одному, а к нескольким типам клеток. Так полиовирусы тропны к клеткам респираторного тракта, желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), центральной нервной системы (ЦНС). Вирус гепатита C (ВГC) лимфотропен и гепатотропен. Специфическое сродство вирусов к клеткам и тканям определяется двумя механизмами: — Присутствием на клеточной поверхности специфических для вируса рецепторов. — Содержанием в системе активирующих ферментов, необходимых для протеолитического расщепления вирусных поверхностных белков и проявления инфекционной активности вируса. ^ Основные этапы взаимодействия: адсорбция вируса на клеточной поверхности; проникновение-раздевание вируса; реализация генетической информации; морфогенез вирусных частиц; выход вирусов из клетки. ^ Первый этап взаимодействия вируса с клеткой — адсорбция вируса на клеточной поверхности, инициирует цепь динамических событий, конечной целью которых является проникновение вируса в клетку. Специфическое сродство вирусов к клеткам и тканям определяется присутствием на клеточной поверхности мембранных молекул, называемых рецепторами и способных связываться с вирусными поверхностными образованиями, называемыми антирецепторами. Вирусные антирецепторы — это белки и гликопротеины, их также называют прикрепительными белками. Часто (но не всегда) прикрепительные белки образуют выступы на поверхности вириона (шипы, пепломеры), однако собственно антирецептор (функциональная часть молекулы прикрепительного белка), как правило, экранирован от случайных взаимодействий и находится в углублении. В качестве примеров прикрепительных белков вирусов человека и животных, выступающих над поверхностью вириона, могут быть приведены гемагглютинин вируса гриппа, VP4 ротавируса, σl реовирусов, фимбрии аденовирусов. Специфическими прикрепительными структурами являются фибриллы бактериофагов. У энтеровирусов антирецептор находится на дне так называемых каньонов — углублений на поверхности капсида. Эволюция не создала для вирусов особых мембранных структур, обеспечивающих проникновение вирусов в клетку. Вирусы используют клеточные рецепторы, уже существующие для проникновения в клетку жизненно-важных факторов — питательных веществ, факторов роста, гормонов и т. д. Химическая природа клеточных рецепторов многообразна и до конца не изучена. Для разных вирусов это разные мембранные молекулы. Так, для ряда вирусов рецепторами являются мембранные молекулы интегринового суперсемейства. Для вирусов Коксаки A — αvβ3 интегрин, для вирусов Коксаки B — α2β3 интегрин, для ротавирусов — α2β1 интегрин. Интегрины — молекулы адгезии, экспрессируемые на поверхности клеток и связанные с цитоскелетом. Являются гетеродимерами (состоят из двух цепей — α и β). Идентифицировано около 20 членов этого суперсемейства, которые образуются за счет различных комбинаций α- и β-цепей. Во многих случаях интегрины узнают трипептид Arg-Gly-Asp (RGD). Для других вирусов рецепторами являются молекулы иммуноглобулинового суперсемейства. Так, основным рецептором для ВИЧ является; молекула CD4, для риновирусов — молекула адгезии ICAM-1, для полиовирусов — CD44 антиген, для вируса гепатита C — молекула CD81. Рецепторами для ряда РНК-содержащих вирусов (миксовирусов и рабдовирусов) являются ганглиозиды GTlb, GQlb (гликопротеины, содержащие сиаловую кислоту). Установлено, что в проникновении вируса в клетку могут принимать участие не одна, а несколько разных мембранных молекул, относящихся к различным суперсемействам. Так, получены данные, что ВГС проникает в клетку также при участии рецептора липопротеинов низкой плотности (ЛНП) — то есть в связывании и проникновении вируса в клетке участвуют два рецепторных белка. В проникновении в клетку аденовируса принимают участие белки двух суперсемейств — иммуноглобулинового и интегринового. Фибры взаимодействуют с белком суперсемейства иммуноглобулинов, пентон — с интегринами. Количество рецепторов, участвующих в проникновении вируса герпеса достигает десяти. Одни и те же белки могут принимать участие в проникновении разных вирусов. Так, аденовирусы и вирусы Коксаки используют один в тот же мембранный белок иммуноглобулинового суперсемейства. Вирусологи называют его CAR. Полиовирусы и вирусы герпеса имеют один и тот же рецептор на клетках ЦНС, что определяет их нейротропность (CD155 молекула, относящаяся к суперсемейству иммуноглобулинов). Рецепторы распределены в мембране клетки диффузно. Подвижность (текучесть) белково-липидного слоя мембраны определяет возможность концентрации рецепторов в ограниченном участке. Такая концентрация способствует образованию мультивалентных связей между рецептором и антирецептором, которые необходимы для необратимой адсорбции вируса. Количество молекул рецептора в участке адсорбции вируса может достигать нескольких тысяч. Взаимодействие между рецептором и антирецептором прикрепительного белка вируса происходит по принципу комплементарности. Комплементарность — дополнительность (пространственная, по заряду, электронной структуре и т. д.) является основой взаимного сродства молекул. Необратимая адсорбция вируса на клеточной поверхности является пусковым механизмом для следующего этапа взаимодействия вируса с клеткой. ^ Установлены и охарактеризованы два ведущих механизма проникновения вирусов в клетку — трансмембранное проникновение и проникновение путем рецепторного эндоцитоза. Выбор пути, по которому происходит проникновение вируса, зависит от индивидуальных особенностей вируса, типа клеток, температуры и рН среды. Однако эти два механизма не исчерпывают всего многообразия путей, которыми пользуются вирусы для проникновения в клетку. Так, многие вирусы растений не могут преодолеть клеточную стенку и попадают внутрь только при ее механическом повреждении. Уникальным механизмом введения генома в клетку хозяина обладают бактериофаги с сократительным хвостовым отростком. Они прокалывают оболочку бактериальной клетки и впрыскивают геном в тело клетки хозяина («шприцевой» механизм). Другие бактериофаги для преодоления клеточной стенки применяют ее ферментативный лизис. Таблица 2 Основные механизмы проникновения вирусов в клетку
Трансмембранное проникновение вирусов Трансмембранное проникновение вирусов или, другими словами, прямая пенетрация через клеточную мембрану, происходит, минуя стадию эндоцитоза. В основе трансмембранного проникновения вируса лежит взаимодействие со специфическим рецептором, что приводит к конформационным изменениям белков вирусной поверхности, а также конформационным изменениям компонентов цитоплазматической мембраны. Следствием конформационных изменений является проникновение в клетку нуклеокапсида или геномной нуклеиновой кислоты. Такой способ проникновения используют как оболочечные, так и безоболочечные вирусы. Оболочечные вирусы проникают в клетку путем слияния клеточной мембраны и мембраны вирусной оболочки. Слияние происходит после взаимодействия вируса с рецептором за счет так называемых белков слияния. В клетку проникает внутренний компонент вириона (нуклеокапсид). Белки вирусной оболочки остаются на поверхности клеточной мембраны. В ряде случаев может наблюдаться слияние не только вирусной и клеточной мембран, но и мембран соседних клеток. Слияние приводит к образованию отдельных многоядерных клеток, симпластов (многоядерный слой слившихся клеток) и синцитиев (конгломераты клеток). При высокой множественности заражения клеточные мембраны сливаются за счет вирусных белков слияния при проникновении вируса в клетку. Это так называемое слияние снаружи (миксовирусы). При низкой множественности заражения слияние клеточных мембран может происходить после проникновения вируса. В таких случаях для слияния необходимо накопление внутриклеточного пула белков слияния за счет внутриклеточного синтеза. Накопление вирусных белков внутри клетки приводит к так называемому слиянию изнутри (герпесвирусы, ретровирусы). Пенетрация через клеточную мембрану безоболочечных вирусных частиц — это конформационно-зависимый процесс. При взаимодействии антирецепторов вирионов с белками-рецепторами клетки капсидные белки претерпевают конформационные изменения, изменяя одновременно состояние мембраны, в результате чего в клетку проникает геномная нуклеиновая кислота вируса. Теория рецепторного эндоцитоза Теория проникновения вирусов в клетку путем рецепторного эндоцитоза впервые сформулирована в 1979 г. Голдстайном и в общих чертах повторяет хорошо изученный механизм рецепторного эндоцитоза белков и гормонов (рис. 5). С использованием механизма рецепторного эндоцитоза в клетку проникают как оболочечные, так и безоболочечные вирусы. Стадия 1. Вирус связывается с клеточной поверхностью за счет комплементарного взаимодействия антирецепторных участков прикрепительных белков и рецепторов клетки мультивалентным способом. Стадия 2. Комплекс «ВЧ-рецепторы» мигрирует в область окаймленной ямки, которая может быть ассоциирована с цитоскелетом. Окаймленная ямка представляет собой участок цитоплазматической мембраны, ассоциированный с внутренней стороны мембраны с белковым комплексом, называемым трискелионом. Мажорным белком этого комплекса является клатрин — консервативный фибриллярный белок. Трискелион служит структурным элементом чехла окаймленного пузырька, образующегося путем эндоцитоза. Часто окаймленные ямки располагаются над пучками цитоплазматических актиновых филаментов, формирующих цитоскелет. Стадия 3, 4. Появление комплекса «ВЧ-рецепторы» в окаймленной ямке является сигналом для активизации процесса эндоцитоза (образования эндосомы), который включает следующие стадии — переход цитоплазмы в области ямки из золя в гель за счет полимеризации актина и инвагинацию окаймленной ямки, происходящую при сокращении нитей актина (3), замыкание мембраны (4). Образуется покрытая клатрином вакуоль (эндосома). Стадия 5. На следующем этапе происходит цепь взаимодействий покрытой эндосомы с клеточными непокрытыми везикулами, в основе которых лежит механизм слияния мембран. Слияние эндосомы с клеточной везикулой преследует своей целью освобождение от клатриновой оболочки и завершается образованием так называемой рецептосомы, теряющей клатрин. Стадия 6. Дальнейшие события, происходящие в рецептосоме, различаются в каждом конкретном случае в зависимости от свойств белков капсида и от наличия или отсутствия вирусной оболочки. Однако общим является акт взаимодействия вирусных белков слияния с мембраной рецептосомы, с последующим раздеванием вирусной частицы и проникновением нуклеиновой кислоты к месту репликации. У вируса гриппа, относящегося к ортомиксовирусам (оболочечные вирусы, реплицирующиеся в ядре клетки) раздевание идет в два этапа. На первом этапе снижение рН внутри рецептосомы, создаваемое за счет работы K-Na насоса, приводит к взаимодействию вирусного белка гемагглютинина с мембраной рецептосомы, в результате чего происходит слияние мембран. В итоге, в цитоплазму выходит субвирусная частица, потерявшая оболочку. В таком виде она транспортируется к ядру клетки. Второй акт раздевания происходит при взаимодействии матриксного белка субвирусной частицы (M-белок) с ядерной оболочкой, в результате чего в ядро проникает нуклеокапсид. У ротавирусов (безоболочечные двукапсидные вирусы) раздевание вирусной частицы осуществляется в один этап. Понижение концентрации Ca2+, происходящее в рецептосоме после ее образования, приводит к разрушению наружного капсида вириона. Освободившиеся из состава наружного капсида белки слияния VP4 и VP7 дезинтегрируют мембрану рецептосомы, и в цитоплазму выходит внутренний капсид, содержащий нуклеиновую кислоту. Примеры белков слияния Гемагглютинин (HA) вируса гриппа — главный вирусный антиген является прикрепительным белком (содержит антирецептор) и белком слияния. Однако эти функции выполняют разные участки HA. HA синтезируется как полипептид-предшественник и нарезается внеклеточной трипсиноподобной протеиназой на 2 субъединицы — большую (HA1) и малую (HA2). Вирионы с нерасщепленным HA неинфекционны. Инфекционность в таком случае блокируется на стадии слияния мембран и контролируется хозяином. HA1 служит антирецептором, HA2 выполняет функцию слияния. Для слияния HA с клеточной мембраной необходимо экспонирование на поверхности белковой молекулы гидрофобных аминокислот, которые облегчают внедрение аминокислотной последовательности в липидный бислой клеточной мембраны. Экспонирование происходит в результате конформационной престройки молекулы, индуцируемой при низких значениях pH (рис. 6). Кроме вируса гриппа, низкие значения pH (5,0-5,5) необходимы для проявления активности белков слияния вирусов везикулярного стоматита, бешенства, лесов Семлики, желтой лихорадки, Эпштейна-Барр. ^ (вирусы Сэндай, кори, паротита, парагриппа) функционирует при нейтральных значениях pH, в связи с чем эти вирусы могут проникать в клетку трансмембранно. F-белок представляет собой гидрофобный гликопротеин с высококонсервативным расположением остатков цистеина (рис. 7). F-белки синтезируются как неактивные предшественники и приобретают функциональную активность после нарезания клеточной трипсиноподобной протеазой на пептиды F1 и F2. Нарезание вызывает конформационные изменения молекулы и экспонирование вновь образованного N-конца, где находится сливающий пептид. Пептид слияния на вновь образованном N-конце содержит высоконсервативную последовательность из 25 гидрофобных аминокислот, способную взаимодействовать с липидами клеточной мембраны. Пептид F2 содержит остатки цистеина, которые также участвуют в процессе слияния путем образования межбелковых-S-S-связей. ^ Вирус может попасть внутрь клетки разными путями, однако непременным условием начала инфекционного процесса является сочетание проникновения вируса с его раздеванием и успешным выходом геномной нуклеиновой кислоты в место дальнейших событий — ядро или цитоплазму, или, как в случае ряда вирусов растений, в хлоропласты. Как уже отмечалось, при реализации генетической информации вирусы имеют разную степень зависимости от клеточных систем репликации/транскрипции и полностью зависят от белоксинтезирующих систем клетки хозяина. Таким образом, в синтезе вирусных макромолекул задействованы как клеточные, так и сугубо вирус-специфические молекулярные механизмы, которые представляют собой отдельный аспект вирусной репродукции и будут рассмотрены в “Молекулярных аспектах репродукции вирусов”. Существует ряд общих ограничений, которые клетка хозяина накладывает на вирус: 1. Ни в ядре, ни в цитоплазме клеток прокариот и эукариот (кроме клеток растений) нет ферментов для транскрипции/репликации вирусного РНК-генома. Это означает, что вирус или должен иметь собственные ферменты в составе вириона или нести их в закодированном виде. 2. В цитоплазме нет ферментов, способных транскрибировать вирусные ДНК. Следовательно, клеточную транскриптазу (ДНК-зависимую РНК-полимеразу) могут использовать только ядерные ДНК-содержащие вирусы. Все цитоплазматические вирусы должны создавать собственные ферменты для синтеза мРНК. 3. В клетках эукариот белоксинтезирующий аппарат клетки приспособлен для трансляции моноцистронных мРНК, так как не распознает внутренних участков инициации. Поэтому вирусы вынуждены синтезировать или отдельные мРНК для каждого гена или мРНК, включающую несколько генов и кодирующую полипротеин, который затем разрезается на индивидуальные белки. 4. В клетках прокариот возможна множественная внутренняя инициация трансляции на полицистронных матрицах. 5. Стратегия реализации генетической информации вирусов включает три известные стадии — транскрипцию (процесс синтеза мРНК), трансляцию (процесс синтеза белка на мРНК) и репликацию (процесс самовоспроизведения генетического материала на основе матричного синтеза). При успешном протекании всех трех стадий реализации генетической информации вируса в клетке на фоне подавления синтеза ее собственных макромолекул наблюдается формирование пула вирусных макромолекул — белков капсида, гликопротеинов суперкапсида, геномных нуклеиновых кислот. Это является пусковым механизмом следующего этапа репликативного цикла вируса — сборки (морфогенеза) вирионов. ^ По месту своей репродукции (ядро или цитоплазма) вирусы разделяют на ядерные и цитоплазматические. Сборка вирионов цитоплазматических вирусов происходит в разных компартментах цитоплазмы. Так, поксвирусы созревают в районе цитоплазмы, лишенном мембранных структур, флавивирусы — в аппарате Гольджи, реовирусы — в каналах ЭПР, многие вирусы растений формируют вирионы в хлоропластах. Процесс созревания ВЧ включает несколько этапов: формирование капсида, упаковку нуклеиновых кислот, приобретение оболочки. Общие принципы формирования вирусных частиц мы представим на нескольких примерах. Пример 1. Самым простым примером вирусного морфогенеза является образование РНП. В этом случае сборка белковой оболочки происходит одновременно с включением геномной РНК в состав нуклеокапсида. Субъединицы, представленные идентичными полипептидными глобулами, собираются по принципу самосборки (самопроизвольно, но упорядоченно). Белковые субъединицы, образующие нуклеокапсид, несут как неизменяющиеся комплементарные поверхности, так и разупорядоченные участки, которые упорядочиваются при сборке, играя роль «зажима» для РНК (РНК-связывающий центр). В случае вируса табачной мозаики (безоболочечный, палочковидный, цитоплазматический (+)РНК-содержащий вирус, входящий в блуждающий род Tobamovirus) морфогенез ВЧ проходит 4 стадии: 1. Образование структуры, состоящей из двух дисков, сформированных белковыми субъединицами. 2. Образование инициаторной петли РНК. 3. Встраивание петли РНК в отверстие диска (инициация сборки). 4. Элонгация (собственно сборка) — идет в двух направлениях вдоль цепи РНК, сопровождается закручиванием спирали рибонуклеопротеина. Такой механизм образования рибонуклеопротеида в общих чертах имеют как безоболочечные палочковидные и нитевидные вирусы, так и оболочечные вирусы со спиральным типом симметрии внутреннего компонента. Пример 2. Сборка вирионов с икосаэдральным типом симметрии также протекает по принципу самосборки, однако, как правило, капсид собирается из преформированных структурных единиц. Капсид полиовируса состоит из 60-ти структурных единиц, каждая из которых образована четырьмя полипептидами (VP1, VP2, VP3, VP4). В процессе морфогенеза на первой стадии происходит ассоциация VP0, VP1 и VP3, в результате чего образуется протомер. Пять протомеров агрегируют с образованием пентамера, пентамеры образуют рыхлый провирион. Есть предположение, что на этой стадии происходит инкапсидация РНК, однако механизм ее упаковки неясен. На последней стадии происходит протеолиз VP0 с образованием VP2 и VP4, что приводит к конформационным перестройкам в капсиде и, как следствие, к уплотнению структуры капсида (рис. 8). Пример 3. Сборка капсида из преформированных субансамблей на примере ядерного аденовируса. Вирусные белки синтезируются в цитоплазме, затем транспортируются в ядро. Для таких белков предусмотрен механизм проникновения через ядерные поры за счет специальных нуклеофильных сигналов, расположенных на N- или C-конце полипептида. Так, белки аденовируса имеют на C-конце нуклеофильный сигнал из пяти аминокислотных остатков, а белки ядерного обезьяньего вируса SV40 — из семи. Капсид аденовириона состоит из 252 структурных единиц, организованных в 12 пентонов, расположенных на вершинах икосаэдра, и 240 гексонов. Названия пентон и гексон происходят от числа структурных единиц, окружающих данное образование. Пентон — окружен 5 гексонами, гексон — 6-ю. Каждый пентон построен из 5 белков VPIII и трех белков VPIV. Группа из 9-ти гексонов (наномер) выделяется при разрушении вириона в мягких условиях и представляет собой капсомер. Морфогенез вирусной частицы протекает в 5 стадий (рис. 9). Предполагается, что при сборке икосаэдрических вирусов нуклеиновая кислота инкапсидируется после формирования незрелого вириона, проникая через отверстие в капсиде. Однако известен механизм, когда геномная нуклеиновая кислота икосаэдрического вируса не только аккумулируется в процессе сборки, но и одновременно реплицируется. Так, у реовирусов, геном которых представлен сегментированной двухнитевой РНК, морфогенез запускается в цитоплазме ассоциацией плюс-нитей РНК с белками кора и NS. В процессе созревания первого вирусного капсида происходит синтез минус-нитей РНК и их затягивание внутрь капсида. Наружный капсид формируется в каналах ЭПР. Морфогенез оболочечных вирусов имеет свои особенности, так как включает стадию приобретения оболочки. У разных вирусов оболочка может приобретаться в процессе почкования через ядерную мембрану, мембрану аппарата Гольджи, мембрану ЭПР, а может формироваться непосредственно в цитоплазме зараженной клетки (поксвирусы). Прежде чем произойдет почкование вируса через мембрану, она должна быть подготовлена (рис. 9). Это значит, в нее должны быть встроены вирусные поверхностные гликопротеины, которые синтезируются и созревают на мембранах ЭПР и Гольджи, а потом, при необходимости, перемещаются в цитоплазматическую мембрану. Затем необходимы синтез и правильная локализация матриксного белка, который располагается на внутренней поверхности цитоплазматической мембраны. Аутоконденсация гидрофобного матриксного белка сопровождается вытеснением белков хозяина и аккумуляцией вирусных гликопротеинов. После этого мембрана готова и вирусный внутренний компонент может быть отпочкован из клетки. Почкование идет по механизму экзоцитоза. ^ выделяют три типа взаимодействия вируса с клеткой. 1. В клетке образуется новое полноценное поколение вирусных частиц — вирионов, а сама клетка погибает вследствие цитопатогенного действия вируса. Такой тип взаимодействия получил название продуктивного. В основе цитопатогенности вирусов лежат прямые и опосредованные механизмы. Прямые механизмы (цитолиз, образование симпластов и синцитиев, апоптоз) зависят от самого вируса. Цитолиз может быть связан с повышением проницаемости клеточной мембраны. Поступление Са+2 в клетку ведет к ионному дисбалансу, вхождению воды в клетку, ее разбуханию, разрыву мембраны и вытеканию цитоплазмы. При множественном почковании оболочечных вирусов возможен феномен «решета», когда клетка не успевает латать бреши и погибает. Возможна гибель клеток в результате аутолизиса, связанного с повреждением лизосом. Иногда клетка погибает без гиперпродукции вируса, что свидетельствует о существовании и других механизмов цитолиза. Еще один механизм, приводящий к гибели вирусинфицированные клетки — это формирование под действием вирусов многоядерных клеточных образований (симпластов и синцитиев), не способных выполнять обычные клеточные функции и, вследствие этого, обреченных на гибель. Вирусинфицированные клетки могут гибнуть также по механизму апоптоза — программированной клеточной гибели. Программа клеточной смерти инициируется сигналами, поступающими с мембраны в ядро клетки после взаимодействия вирусоспецифических белков с рецептором. В результате достаточно сложных молекулярных событий клетка фрагментируется на так называемые апоптотические тельца, покрытые мембраной, и поглощается макрофагами. Опосредованные механизмы цитопатогенности вирусов реализуются за счет уничтожения вирусинфицированных клеток цитотоксическими Т-лимфоцитами и натуральными киллерами. Кроме того, гибель инфицированных клеток осуществляется с помощью антителозависимой клеточной цитотоксичности с участием антител против вирусных белков и натуральных киллеров. 2. Биосинтез вируса в клетке не достигает завершения, гибнет вирус, а не клетка, которая возвращается к нормальному функционированию. Такой процесс получил название абортивного. 3. Еще одним типом взаимодействия вируса с клеткой является ее трансформация. Онкогенная трансформация блокирует механизмы гибели клетки путем апоптоза, и клетка приобретает способность к непрерывному росту и делению, что может привести к развитию опухоли. В зависимости от продолжительности пребывания вируса в организме выделяют два главных типа взаимодействия возбудителя с организмом хозяина. Первый тип взаимодействия характеризуется непродолжительным пребыванием вируса в организме, и проявляется в двух формах инфекционного процесса. 1. Острая или продуктивная инфекция. 2. Инапарантная (субклиническая) форма инфекции — бессимптомная инфекция с непродолжительным пребыванием вируса в организме и его выделением во внешнюю среду (например, гепатит A, ротавирусная инфекция). Второй тип взаимодействия характеризуется длительным пребыванием вируса в организме, когда вирус сосуществует с клеткой и может репродуцироваться, не нанося клетке видимого вреда. Такое состояние длительного сосуществования получило название персистентенции. Персистентная инфекция у человека может проявляться в разных формах. 1. Латентная инфекция — при которой вирус «молчит». Инфекционный вирус, находящийся в организме в состоянии провируса (интегрированного в геном клетки хозяина), в нормальных условиях не проявляет себя и не выделяется из клеток организма. Однако в определенных условиях (при снижении иммунитета), он может реактивироваться, вызывая характерные клинические проявления инфекции (например, герпесвирусные инфекции). 2. Хроническая инфекция — вирус присутствует в организме постоянно. Возможно полное отсутствие клинических проявлений инфекции — непрерывный вариант хронической инфекции, и обострение патологического процесса — рецидивирующий вариант хронической инфекции (например, вирусный гепатит C). 3. Медленная инфекция — медленно прогрессирующее заболевание с исключительно длинным латентным периодом (например, ВИЧ-инфекция, переходящая в СПИД). ^ При взаимодействии вируса с клеткой могут образовываться не только зрелые инфекционные частицы, но и так называемые дефектные вирусы или ВЧ с дефектным геномом. Дефектный геном — это любой вирусный геном, в котором один или несколько генов утратили функцию, необходимую для автономной репликации вируса, в связи с чем для репликации необходима помощь другого вирусного генома или гена. Выделено 5 классов дефектных вирусных геномов, которые сохранили свою биологическую активность: 1. Дефектные геномы, зависящие от вируса-помощника. 2. Дефектные геномы, интегрированные в хромосому клетки хозяина. 3. Вирусы-сателлиты. 4. Псевдовирионы. 5. Условно-дефектные геномы. Дефектные геномы, зависящие от вируса-помошника. Сюда входят так называемые дефектные интерферирующие вирусы — ДИ-частицы. Они представляют собой субгеномные делеционные мутанты, потерявшие существенную часть генома родительского вируса. Делеция может достигать 90%, хотя обнаружены делеции, затрагивающие лишь 1% генома. Для восстановления утраченных функций ДИ-частицы необходимо одновременное заражение родственным вирусом-помощником. При этом, ДИ-частицы угнетают (интерферируют) репликацию вируса-помощника, используя с этой целью продукты его собственных генов. ДИ-частицы образуются при репликации любого вируса, отличаются размером от нормального вириона и имеют разную степень интерференции. Например, ДИ-частицы полиовируса интерферируют слабо, а ДИ-частицы вируса везикулярного стоматита — сильно. Дефектные геномы, интегрированные в хромосому клетки хозяина. Факт интеграции генома ряда вирусов в геном клетки хозяина в настоящее время не вызывает сомнения. Однако интегрировать могут не только полные, но и дефектные геномы, особенно в клетках бактерий. Как правило, это «молчащие» дефектные гены. В определенных условиях они могут быть индуцированы (активация, запуск репликации) и их экспрессия может влиять на выживаемость и эволюцию клетки хозяина. При индукции таких геномов вирусов бактерий с помощью митомицина или ультрафиолета можно наблюдать образование фрагментов вируса: пустых головок, хвостовых отростков, полных головок без отростков. Индуцированные частицы фагов могут вызывать гибель чувствительных к вирусу штаммов бактерий. Также как и нормальные интегрированные геномы, интегрированные дефектные геномы могут инактивировать гены клетки-хозяина или способствовать их экспрессии, придавать новые генетические свойства, вводить, устранять или способствовать их экспрессии, устранять или перемещать регуляторные элементы, а также способствовать рекомбинационным изменениям ДНК клетки хозяина. В последние годы установлено, что значительная часть онкогенных РНК-содержащих опухолеродных вирусов — это дефектные вирусы, несущие клеточные онкогены и зависящие от вируса-помошника. Например, LTR-последовательности дефектных ретровирусов при встраивании неподалеку от онкогенов, активируют их. Вирусы-сателлиты — крайняя форма вирусного паразитизма. Это вирусы, паразитирующие на генных продуктах, образованных другими, часто неродственными вирусами. Вирусы-сателлиты широко распространены среди вирусов растений. Вирусы-сателлиты могут так же, как ДИ-частицы, интерферировать с вирусом-помощником, однако, в отличие от ДИ-частиц, возникновение вирусов-сателлитов не связано с делецией генов вируса-помощника. Очень часто РНК- или ДНК-геном вируса-помощника не имеет гомологии с геномом вируса-паразита. Вирус-сателлит в своей репликации полностью зависит от одновременного заражения вирусом-помощником. Примеры вирусов-сателлитов: 1. STNV — сателлит вируса некроза табака, помощник — вирус некроза табака. 2. Сателлит — колифаг p4, помощник — колифаг p2. 3. AAV — аденоассоциированные вирусы, помощник — аденовирусы. 4. Дельта — вирус, помощник — вирус гепатита B. Псевдовирионы — это ВЧ, содержащие вместо геномной нуклеиновой кислоты вируса, нуклеиновую кислоту клетки хозяина. У прокариот образование таких псевдовирусов имеет огромное генетическое значение и представляет собой механизм перемещения генетического материала клетки-хозяина из одной клетки в другую. У эукариот генетическое значение псевдовирионов не установлено, но их образование показано. Например, при инфицировании вирусом полиомы большая доля образующегося потомства представляет собой псевдовирионы. Условно-дефектные геномы — это мутантные геномы, дефектные только в определенных условиях: ts-мутанты (температурочувствительные); hr-мутанты (по спектру хозяев) и другие. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям