Вирусология наука о вирусах микроскопических надмолекулярных созданиях природы, которые являются своеобразной паразитической формой жизни
|
|
Скачать 2.88 Mb.
|
|
5.2. Таксономическая классификация вирусов Глава 8. Вирусы насекомых |
| Глава 5. ТАКСОНОМИЯ ВИРУСОВ 5.1. Общие положения В 1966 г. на международном микробиологическом конгрессе в Москве был утвержден Международный комитет по номенклатуре вирусов — МКНВ. Практически никто не сомневался, что тысячи вирусов человека, животных, растений и микроорганизмов представляют собой единую группу, объединенную в царство «Vira». Оставался выбор конкретной иерархической системы и признаков, по которым следует составлять классификацию. Согласно схеме, предложенной Львовым, Хорном и Турнье, иерархия признаков должна быть нисходящей и включать тип нуклеиновой кислоты, стратегию репликации, симметрию капсида, наличие мембран и другие структурные особенности. На конгрессе эта схема не нашла поддержки, тем не менее, впоследствии стала основой универсальной системы, используемой в настоящее время. В 1973 г. МКНВ был переименован в МКТВ (ICTV) — Международный комитет таксономии вирусов. Современная таксономия вирусов является универсальной для вирусов позвоночных, беспозвоночных, растений, микроорганизмов. Выделение надвидовых таксонов проводится не по фенотипическим показателям, а на основе фундаментальных свойств. Формальными таксонами в царстве Vira являются: Порядок — состоит из семейств вирусов с очевидным общим эволюционным происхождением. Обозначается словами, оканчивающимися на — virales. Семейство (подсемейство) — объединяет роды, представители которых имеют один вид генома и сходную структурную организацию вирусной частицы. Семейства (подсемейства) вирусов обозначаются словами, оканчивающимися на — viridae (virinae). Род — объединяет вирусы на основе стратегии генома, феномена генетических взаимоотношений, архитектуры вириона, круга восприимчивых хозяев, патогенности, географического распространения, способа передачи. Названия родов вирусов оканчиваются на — virus. Вид — формально каждый отдельный вирус может быть определен как вид. Название начинается или оканчивается на слово — вирус. Существование дискретных биологических видов у вирусов не вызывает сомнений. Однако концепция вида в вирусологии до конца не разработана. Отсутствуют четкие критерии определения границ вида. При выделении таксонов высокого ранга (от рода и выше) учитывается строение и молекулярная организация вириона, вид генома, способ его реализации, способность вступать в генетические взаимодействия. Принимаются во внимание биологические и экологические характеристики, антигенные свойства, круг хозяев, способ передачи. Поиск критериев для определения видовых границ включил анализ возможности использования ряда других признаков. Первый признак — способность вызывать определенное заболевание (система: нозологическая форма болезни — этиологический агент). При использовании в качестве критерия вида только этого признака в вид не укладываются природные авирулентные варианты, аттенуированные варианты, затрудняет полиморфизм клинических проявлений инфекции. Второй способ видовой дифференцировки основан на определении антигенных свойств. Однако существование постоянного антигенного дрейфа, дающего множество серологических типов одного вируса, делает серологические реакции не универсальными. Например, в семействе буньявирусов выделено 180 серологических типов, у герпесвирусов — 89, риновирусов — более 100. Многообразие серотипов уменьшает ценность серологического критерия в определении вида. Серологические различия являются качественными, а не количественными, что создает трудности при определении границ вида. Четких критериев принадлежности серологических типов к отдельным видам не установлено и в каждом случае вопрос об определении видовых границ решается индивидуально. Так, у полиовирусов выделено три серотипа, которые не создают перекрестного иммунитета, но относятся к одному виду, так как вызывают одно заболевание — паралитический полиомиелит. В то же время, энтеровирус-71 также вызывает паралитическое заболевание, но относится к другому виду. У аденовирусов в серологическую классификацию введено количественное начало. Серопиты выделяются в отдельные виды в том случае, если в перекрестной реакции нейтрализации с гомологичным и гетерологичным антигенами наблюдается не менее чем 16-кратная разница в титре. Комплексный подход к определению вида основан на привлечении молекулярно-биологических, биохимических, генетических, биологических и экологических данных. Более четкие результаты дает использование в серологических реакциях МКА и изучение генов и их продуктов путем определения первичной структуры. Применение комплексного подхода позволяет не только определить границы вида, но и оценить многообразие молекулярных проявлений внутри него. ICTV не классифицирует вирусы ниже вида, однако в практике и научных исследованиях используют дифференциацию вирусов по антигенам, серотипам, генотипам, электрофоретипам — в зависимости от применяемых методов исследования. Внутри вида различают антигенные типы и генотипы вируса. В ряде случаев эти две характеристики могут коррелировать, в других случаях — используются как разные подходы к характеристике одного вируса, то есть могут заменять, дополнять друг друга или быть единственной характеристикой вируса. Например, вирус гриппа дифференцируется только на уровне антигенных вариантов. Вирус имеет два антигена — гемагглютинин (Н) и нейраминидазу (N), которые комплексируются в нескольких вариантах. Существует 13 вариантов Н (Н1-Н13) и 9 вариантов N (N1-N9). Антигенные варианты вируса гриппа A описываются как H1N1,H2N1 и так далее. Ротавирусы описываются как на уровне антигенных вариантов, так и генотипов. По групповому антигену их разделяют на 7 не имеющих серологических связей антигенных групп (А-F). Ротавирусы группы А имеют два поверхностных белка, являющихся основными антигенами вируса: белок VP7 определяет G-серотип вируса, белок VP4 определяет P-серотип/генотип вируса. Природные штаммы ротавирусов описывают как G/P варианты. Генотип вируса определяют по нуклеотидной последовательности с использованием ПЦР или секвенирования. Для характеристики вирусов разработана система обозначений (криптограмма), включающая следующие признаки; Антигенная группа — вид происхождения — место происхождения — обозначение штамма — год выделения — субтип антигена — генотип. Согласно этим признакам, например, ротавирус обезьян штамм SA11 описывается следующим образом — A/Si/S. Africa/SA11/58/GЗ Р2 [6] SI; вирус гриппа А, штамм Гонконг — A/SW/Goncong/Fort Warren/50/H1N2. В иерархии вирусов «вид» является последним формальным таксоном. Однако с понятием биологический вид неразрывно связаны такие звенья иерархической системы как особь и популяция. В общебиологическом понимании вид включает в себя несколько популяций, а популяция представляет собой совокупность отдельных особей одного вида. Особенности жизненного цикла вируса затрудняют применение к виру, сам термина особь, а следовательно, и популяция. Морфологическими признаками особи обладают лишь покоящиеся внеклеточные формы вируса — вирионы. Внутриклеточный репродуцирующийся вирус представлен функционирующими молекулами и образующимися субвирусными компонентами, к которым понятия особь и индивидуум мало применимы. Однако с точки зрения генетики, принципиальным признаком особи является наличие индивидуального геном а, обеспечивающего жизненные функции и воспроизводство, что, в общем-то, заложено в вирионе и реализуется во время жизненного цикла вируса. Вид у вирусов состоит из автономных популяционных образований с обособленным в той или иной степени генофондом. В вирусологии следует различать локальные популяции и природные популяции вируса. Локальная популяция — это совокупность особей одного вида, имеющих общее место обитания и длительно существующих в определенной части, ареала. Локальная вирусная популяция формируется в естественных условиях в организме зараженных хозяев. Размножающийся вирус объединен экологически, то есть имеет общее место обитания и подвержен сходным воздействиям. Вирус находится в абсолютной пространственной изоляции от других вирусных популяций и проходит на протяжении инфекционного процесса значительное количество генераций. Каждый вид вируса существует в форме природных популяций, связанных с популяциями одного или нескольких хозяев. Популяция хозяев занимает определенный ареал, такой же ареал занимает и природная вирусная популяция. ^ Классификация вирусов очень подвижная система. Постоянно получаемые новые знания о вирусах — о структурной и молекулярной организации, особенностях репликации, филогенетических взаимоотношениях — служат основанием для ее перестроек. По материалам шестого сообщения ICTV (1995 г.) с изменениями, внесенными позже (1997 г.), вирусы классифицированы на 184 рода, 161 из которых был сгруппирован в 55 семейств, 23 определены как «блуждающие». Семейства кластеризованы в соответствии с видом генома — днДНК, онДНК, днРНК, (-)РНК, (+)РНК и те, для репликации которых требуется реакция обратной транскрипции (РТ-вирусы, или ретроидные вирусы). Эти более высокие, чем семейства, кластеры не являются формальными таксонами, но очень удобны для систематизации многообразия вирусов. В седьмом докладе ICTV (Таксономия-2001) в классификации вирусов выделено уже 62 семейства и 222 рода, включая «блуждающие». Как правило, в каждом семействе имеется группа несистематизированных вирусов. Например, в семействе флавивирусов не классифицированы вирус гепатита G и родственные ему вирусы. При получении новых знаний эти вирусы могут быть отнесены к одному из родов семейства или составить свой род. Практически в каждом геномном кластере присутствуют неклассифицированные роды вирусов (всего 23 рода), которые не нашли своего семейства и впоследствии могут составить отдельное семейство вирусов. Примером такой ситуации могут служить роды Deltavirus и Tenuivirus (кластер (-)РНК-геномных вирусов). Другой пример подвижности таксономической системы вирусов — вирус гепатита Е, который ранее входил в семейство Caliciviridae, а в настоящее время является типовым вирусом «блуждающего» рода в кластере (+)РНК-содержащих вирусов. В геномном кластере (+)РНК вирусов сосредоточено наибольшее число неклассифицированных родов вирусов растений. Выделено 2 порядка вирусов: 1) среди вирусов с негативным РНК-геномом сформирован порядок Mononegavirales, включающий 4 семейства (парамиксо-, рабдо-, фило- и борнавирусы); 2) среди вирусов с РНК-геномом позитивной полярности выделен порядок Nidovirales, включающий 2 семейства (корона- и артеривирусы). Порядок выделяют на основе ряда объединяющих признаков, включая очевидную филогенетическую близость между представителями семейств. Например, при формировании порядка Mononegavirales были учтены одиннадцать объединяющих признаков: 1. Сходная геномная организация. 2. Комплементарность геномных концевых последовательностей. 3. Гомологичность последовательностей 3'-НТР. 4. Консервативность транскрипционного сигнала. 5. Прерывание генов внутригеномными последовательностями. 6. Наличие вирионной РНК-зависимой РНК-полимеразы. 7. Синтез репликативных и мРНК идет в составе нуклеокапсида. 8. Репликация РНК включает синтез полноразмерного антигенома. 9. Транскрипция идет путем последовательного прерывистого синтеза от одного промотора. 10. Транскрипция и репликация протекают в цитоплазме. 11. Созревание вириона идет путем почкования переформированного нуклеокапсида через цитоплазм этическую мембрану, содержащую встроенные вирусные белки. Современная классификация семейств вирусов представлена в таблице 3. При рассмотрении таблицы следует обратить внимание, что четыре семейства дифференцированы на подсемейства; восемь семейств являются смежными, т.е. включают вирусы, поражающие представителей разных царств живого (Birnaviridae, Reoviridae, Rhabdoviridae, Bunyamviridae, Parvoviridae, Iridoviridae, Poxviridae, Picornaviridae); не обнаружено семейств, включающих вирусы прокариот и эукариот. Кроме вирусов, в царстве Vira рассматриваются и другие молекулярные паразиты, которые систематизируются в рамках неопределенных таксонов. Это вироиды (Viroid), где в настоящее время выделено два семейства и 8 родов, сателлиты вирусов (Sattelites) и прионы (Prions). Глава 6. БАКТЕРИОФАГИ 6.1. Характеристика семейств вирусов бактерий Бактериофаги — вирусы, размножающиеся в бактериальных клетках. В современной классификации вирусы бактерий распределены на 13 семейств и один неклассифицированный род (табл. 4). У бактериофагов обнаружены четыре вида геномов. Отсутствуют ретроидные вирусы и (-)РНК-геномные вирусы. Сегментированный РНК-геном содержат цистовирусы (Cystoviridae), (+)РНК-геном — левивирусы (Leviviridae). Основная масса бактериофагов — это ДНК-содержащие вирусы. Геномная ДНК бактериофагов может быть однонитевой и двухнитевой, линейной, кольцевой или су перс круче иной. Линейные молекулы ДНК могут иметь липкие концы, содержать прямые или инвертированные концевые повторы или геномные белки. Отличительной особенностью ДНК целого ряда фагов является наличие метилированных оснований (5’-метилцитозина, или 5-МЦ; 6’- метиламинопурина, или 6-МАП), которые могут входить в состав ДНК в качестве минорных или мажорных оснований. Так, ДНК фагов fd и φX174 (колифаги) содержит 1-2 метилированных основания, а в ДНК фага XI2, лизирующего морскую бактерию Xantomonas oryza, вообще нет обычного цитозина, который полностью замещен 5-МЦ. Источником происхождения таких оснований является энзиматическое метилирование уже синтезированной цепи ДНК. Этот процесс осуществляют специфические метилазы, которые используют в качестве донора метильных групп S-аденозилметионин. Вирусы бактерий поражают многообразием морфологических типов и размеров, которые колеблются в пределах 20-200 нм. Обнаружены оболочечные и безоболочечные вирионы, изометрические, палочковидные и нитевидные формы. Уникальной дифференцированной организацией обладают бактериофаги с хвостовым отростком. Группа вирусов с хвостовым отростком включает три семейства: бактериофаги с сократительным хвостовым отростком (Myoviridae), с длинным несократительным отростком (Syphoviridae) и бактериофаги с коротким хвостовым отростком (Podoviridae). Внутри каждого семейства вирусы классифицируют на типы и подтипы по размерам и форме головок, размерам и сложности организации хвостового отростка. Таблица 4 Наиболее сложноустроенными являются бактериофаги T-четной серии. Рассмотрим их организацию на примере бактериофага T4, образованного 30-ю белками (рис. 18). Головка фага T4 состоит из двух неравноценных частей — белкового изометрического капсида с заключенной в нем ДНК, и миниатюрного комплекса, который находится в основании одного из углов капсида. Этот комплекс состоит из муфты и шейки. Шейка, в свою очередь, организована цилиндром и воротничком с 6-ю короткими воротничковыми нитями. Хвостовой отросток состоит из стержня, окруженного белковым чехлом, и базальной пластинки, ассоциированной с 6-ю длинными и 6-ю короткими фибриллами. Чехол хвостового отростка образован 144 белковыми субъединицами и может находиться в растянутом или сокращенном состоянии. Растянутый чехол — это структура, состоящая из стопки дисков (24 диска, каждый образован 6-ю субъединицами), в то время как сокращенный чехол — это спирально закрученный тяж из 144 белковых субъединиц. Рис. 18 6.2. Особенности жизненного цикла бактериофагов 6.2.1. Видовая и штаммовая специфичность бактериофагов Видовая специфичность бактериофагов, как и в случае других вирусов, определяется наличием на клеточной поверхности специфических рецепторов и реализуется на стадии адсорбции. Адсорбция является физико-химическим процессом взаимодействия структур фаговой частицы, отвечающих за адсорбцию, и особых компонентов клеточной стенки, получивших название фаговые рецепторы. Чаще всего рецепторами являются липополисахариды и белки клеточной стенки. Описаны фаги E. Coli f1 и f2 (Inovirus), адсорбирующиеся на половых пилях, в связи с чем, они размножаются только на мужских штаммах (F+). Взаимодействие фага и рецептора высоко специфично. Именно стадия адсорбции определяет круг бактерий — хозяев фага. Как правило, определенный тип бактериофага паразитирует на бактериях одного вида, реже — на нескольких близкородственных видах (например, на кишечных палочках и шигеллах). Потеря фаговых рецепторов или их изменение является основной причиной устойчивости бактерий к фагу. Круг хозяев бактериофагов, кроме наличия у них специфических фаговых рецепторов, определяется и другими специфическими особенностями клеток бактерий. Способность того или иного фага заражать разные виды и штаммы бактерий в определенной степени зависит от систем рестрикции-модификации клеток последнего хозяина, где этот фаг реплицировался. В общем виде сущность феномена модификации хозяином состоит в том, что клетки, где может происходить репликация вируса, имеют специфические эндонуклеазы рестрикции, вызывающие деградацию чужеродных ДНК (система рестрикции или r-система), и одновременно имеют ферменты (метилазы, гликозилазы), защищающие свою ДНК путем придания ей дополнительной, «уточняющей» специфичности в виде минорных метилированных оснований (система модификации или m-система). Клетка защищает свою ДНК от своей r-системы метилированием оснований в строго специфичных местах (сайтах) рестрикции. Поскольку такие сайты (короткие последовательности нуклеотидов) имеются и в ДНК вируса, они также метилируются, то есть клетка как бы метит «свои» вирусы. В разных видах бактерий присутствуют разные эндонуклеазы рестрикции и соответствующие им m-системы. В итоге возникает видовая и даже штаммовая специфичность систем r-m. В связи с этим, пометив и защитив ДНК вируса, бактериальная клетка разрешает размножаться только «своим» вирусам и запрещает реплицироваться «чужим», которые перед этим размножались в других штаммах или видах бактерий. Целый ряд вирусов бактерий научился сам преодолевать г-систему клетки хозяина за счет приобретения фаговой ДНК хозяйских генов, кодирующих специфические метилазы, и таким образом гарантировать себе получение полноценного потомства. Примером такой приспособляемости бактериофагов является фаг T2 (Myoviridae). Паразитизм и высокая приспособляемость бактериофагов могут идти еще дальше. Некоторые фаги (λ, P1 — Syphoviridae) приобрели себе не только т-систему, но и собственные системы рестрикции. При попадании таких фагов в клетку фагоспецифические рестриктазы могут воздействовать на клеточную ДНК, обеспечивая первый этап вирусной инфекции — подавление функции генома клетки хозяина. 6.2.2. Введение фаговой нуклеиновой кислоты в бактериальную клетку Особенности строения бактериальных клеток, имеющих устойчивую к воздействию факторов внешней среды и относительно жесткую клеточную стенку, определяют существование ряда отличительных механизмов введения нуклеиновой кислоты бактериофага в клетку хозяина. Остановимся на двух примерах. 1. Введение ДНК в клетку хозяина фагами с сократительным хвостовым отростком происходит с использованием «шприцевого» механизма. Адсорбция фага на клеточной поверхности и введение нуклеиновой кислоты в клетку представляют собой многоступенчатый энергозависимый процесс, в котором участвуют три структурно и функционально разделенные системы: сенсорная (включает длинные и короткие хвостовые фибриллы), сократительная (хвостовой чехол) и проводящая (хвостовой стержень). Введение ДНК в клетку хозяина включает несколько этапов: — обратимое связывание длинных фибрилл бактериофага с липополисахаридами клеточной стенки бактерии, сопровождающееся их сгибанием и реорганизацией базальной пластинки, что приводит к контакту коротких фибрилл с клеточной поверхностью; — необратимое связывание коротких фибрилл бактериофага с липополисахарид-белковым комплексом бактериальной стенки; — перестройка базальной пластинки, приводящая к энергозависимому сокращению хвостового чехла (каждая молекула белка хвостового чехла содержит 1 молекулу ГТФ, гидролиз которой обеспечивает энергией процесс сокращения); — сокращение хвостового чехла приводит к экспонированию хвостового стержня, который своим дистальным концом остается связанным с базальной пластинкой, обусловливающей точечный лизис клеточной стенки; — хвостовой стержень проходит через клеточную стенку, проникает в периплазму и достигает цитоплазматической мембраны, ДНК фага из головки по полому стержню поступает в периплазму и через цитоплазматическую мембрану транспортируется в клетку. Строгая специфичность взаимодействия сенсорных систем вируса с клеткой и скоординированность структурных перестроек его специализированных компонентов обеспечивает фагу T4 самую высокую эффективность заражения среди всех известных вирусов. 2. Введение РНК бактериофага φ6 (Cystovirus) в клетку хозяина — фитопатогенной псевдомонады Pseudomonas pseudoalcaligenes— представляет собой не менее уникальный механизм. Он включает целый ряд уже известных стадий: слияние мембран, лизис пептидогликана клеточной стенки, эндоцитоз и прямую пенетрацию. Схематично этот процесс выглядит следующим образом: оболочечный вирус адсорбируется на клеточных рецепторах с использованием шипов, образованных прикрепительным белком P3, которые при этом сокращаются. Сокращение P3 позволяет белку слияния P6 войти в контакт с клеточной поверхностью. Слияние P6 с поверхностью псевдомонады активирует литический фермент P5, входящий в состав нуклеокапсида. Фермент Р5 осуществляет разрушение пептидогликана клеточной стенки. В результате этого нуклеокапсид приходит в контакт с цитоплазматической мембраной. Нуклеокапсид проникает через цитоплазматическую мембрану по механизму эндоцитоза, покидая эндосому путем прямой пенетрации с потерей основных белков нуклеокапсида P8 и P5. В цитоплазму выходит полимеразный комплекс, ассоциированный с тремя сегментами днРНК. 6.2.3. Типы взаимодействия фагов с бактериями На основании особенностей жизненного цикла бактериофаги разделяют на две группы: 1) вирулентные бактериофаги — фаги, жизненный цикл которых завершается лизисом клетки хозяина и выходом зрелых фаговых частиц; 2) умеренные или лизогенизирующие бактериофаги — фаги, способные после проникновения в бактериальную клетку переходить в состояние профага и длительное время реплицироваться совместно с бактериальным геномом, передаваясь очередному поколению бактерий. Существуют два основных типа взаимодействия фагов с бактериями — продуктивный и лизогенный, осуществляемый, соответственно, вирулентными и умеренными фагами. Продуктивный тип взаимодействия После проникновения нуклеиновой кислоты фага в клетку начинается экспрессия фаговых генов, при этом используется синтетический аппарат клетки-хозяина. В первую очередь синтезируются белки, регулирующие работу фагового генома, ферменты, участвующие в синтезе фаговых нуклеиновых кислот. Затем реплицируется геномная нуклеиновая кислота фага и синтезируются структурные белки фагового капсида. Механизм репликации фагового генома зависит от его вида и в общих чертах подчиняется принципам, изложенным в разделе «Репликация вирусных геномов». На последнем этапе происходит сборка фаговых зрелых частиц. Продуктивный тип взаимодействия сопровождается наработкой зрелого вирусного потомства и может завершаться двумя исходами — лизисом клетки и внезапным выходом в среду вновь образовавшихся вирионов (литический тип взаимодействия) или секрецией вирионов в среду, не сопровождающейся разрушением клетки хозяина (секреторный тип взаимодействия). При литическом типе взаимодействия к моменту завершения сборки фаговых частиц нарабатываются особые, так называемые, киллерные белки, которые убивают бактериальную клетку, останавливая все метаболические процессы и разрушая клеточную стенку. Зрелые фаговые частицы выходят во внешнюю среду не в результате механического разрушения бактериальной клетки, а в результате лизиса изнутри. Каждая из этих частиц способна инфицировать чувствительную бактериальную клетку и повторить вышеописанный цикл развития. Уникальное завершение жизненного цикла наблюдается у иновирусов (фаги E. coli f1, M13). Зрелые нитевидные частицы этих фагов секретируются из зараженной клетки без лизиса последней. Иновирусы инфицируют только мужские клетки, так как адсорбируются на кончиках F-пилей. В процессе морфогенеза фаговые белки концентрируются на внутренней поверхности клеточной мембраны, зрелые молекулы ДНК проходят через мембрану, захватывая капсидный белок, и секретируются в среду. Иновирусы выделены из E. coli (фаги f1, fd, M13), Salmonella (фаги if1, if2), Pseudomonas (фаги Pf1, Pf3), Xanthomonas (бактериофаг Xf), Vibrio (бактериофаг v6). Особый интерес представляет фаг M13. Существование этого вируса в двух формах — репликативной (в форме плазмиды) и секреторной (инкапсидированная однонитевая кольцевая ДНК) делают его удобным инструментом молекулярно-генетических исследований. Путем различных модификаций генома фага М13 сконструирован целый ряд удобных векторов клонирования на основе репликативной формы. Секретируемая одноцепочечная рекомбинантная молекула ДНК широко применяется при определении нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов ДНК. Лизогенный тип взаимодействия У умеренных бактериофагов первые две стадии жизненного цикла совпадают со стадиями жизненного цикла вирулентных фагов. После введения нуклеиновой кислоты в клетку хозяина умеренные фаги способны в дальнейшем либо пойти по литическому пути, аналогично вирулентному фагу, либо перейти в особое состояние, получившее название «профаг». При этом генетический материал фага интегрирует в бактериальную хромосому или переходит в плазмидоподобное состояние и реплицируется синхронно с геномом клетки. Все бактерии — потомки клетки, инфицированной умеренным фагом, содержат профаг. Такая бактериальная культура называется лизогенной. Лизогенная культура может существовать продолжительное время. Лизогенная культура обладает следующими свойствами: она устойчива к повторной инфекции данным типом фага или фагами, близкородственными ему; всегда содержит небольшое количество зрелых фаговых частиц, о чем свидетельствует спонтанный лизис отдельных клеток в культуре. Для системы «лизогенная бактерия — профаг» описано явление, получившее наименование индукция. При индукции профаг активизируется во всех клетках лизогенной культуры, в результате чего наблюдается продуктивный цикл развития фага, завершающийся полным лизисом клеток и выходом зрелого фагового потомства. Индукция может происходить как спонтанно, без видимых причин, так и в результате воздействия определенных факторов, получивших название индукторов. К индукторам относятся ультрафиолетовое излучение, мутагены, такие как нитрозогуанидин, акридиновые красители и ряд других. В результате детального изучения различных типов мутантов фага λ было показано, что в формировании и поддержании лизогенного состояния участвует белок cI, получивший название иммунитетный репрессор. Установлено, что белок cI связывается с фаговой ДНК в районе области иммунности. В этой области на хромосомной карте фага λ, между геном N и геном CII находятся два промотора PR (R — правый) и PL (L — левый) с соответствующими им операторами OR и OL(, (схема 9). Именно с этими операторами и связывается белок cI, выполняя регуляторную функцию белка-репрессора. Блокирование белком cI левого оператора предотвращает синтез мРНК с гена N, а блокирование правого оператора предотвращает синтез мРНК с генов O и P. Продукты генов N, O, P необходимы для выражения всех остальных генов фага λ, поэтому прямое действие репрессора на операторы OR и OL косвенным образом подавляет выражение практически всего генома. Схема 9 Каждый оператор состоит из трех участков длиной 16 нуклеотидов, расположенных тандемно, и способен связывать от 1 до 3 молекул белка cI. Присоединение хотя бы одной молекулы репрессора предотвращает достижение РНК-полимеразой точки инициации транскрипции. Существует репрессор синтеза репрессора cI, являющийся продуктом гена его. В клетке, содержащей геном фага λ, образование репрессора cI и репрессора репрессора cro являются взаимно исключающими состояниями. При лизогенизации и поддержании лизогении синтезируется репрессор cI и подавлен репрессор репрессора cro. При литической реакции репрессор репрессора образуется, а образование репрессора cI подавлено. В клетке, инфицированной умеренным фагом λ, могут протекать как события, приводящие к лизогенизации, так и события, приводящие к продуктивному развитию фага. Выбор определяется соотношением уровня синтеза репрессора cI и уровня синтеза продукта гена его. Так, суперинфицирование нормальным фагом лизогенных клеток, содержащих продукт его, всегда приводит к литической реакции, а суперинфицирование нормальным фагом лизогенной клетки, содержащей репрессор cI, никогда не приводит к литическому ответу. Кроме продуктов генов cI, cII, cIII, cro, промоторных и операторных участков существенную роль в процессах регуляции выражения генома фага λ играют гены N, O, P, Q. Продукт гена N осуществляет позитивный контроль транскрипции всех остальных генов фага λ. При индукции профага, дефектного по гену N, с промотора PL транскрибируется только сам ген N, а с промотора PR — только ген его. При наличии продукта гена N с обоих промоторов транскрибируются длинные полигенные мРНК. Действие продукта гена N является примером аттенуаторного контроля (аттенуация — регуляция транскрипции на уровне терминации). Аттенуаторные участки закодированы в ДНК фага λ между генами N и CIII, между генами его и CII, а также между генами P и Q. Именно в этих точках обрывается синтез мРНК при отсутствии продукта гена N. Под контролем группы генов C, генов его и N находится выражение, так называемых, ранних белков, участвующих в рекомбинации фаговой ДНК (int, xis, red, rex), регуляторных белков (cI, cII, cIII, cro, N), белков, участвующих в репликации фаговой хромосомы (С, Р). Ни один из этих белков не относится к компонентам зрелой фаговой частицы. Структурные компоненты фага кодируются поздними генами, расположенными справа от гена Q. Их выражение начинается после того, как пройдет 1/3 латентного периода. Выражение поздних генов находится под позитивным контролем продуктов генов О, P, Q. Поздние гены транскрибируются в виде единой полигенной мРНК. При отсутствии продуктов генов O и P фаговая ДНК не реплицируется и не синтезируются продукты поздних генов. Трансдукция При изучении бактериофагов было открыто явление, получившее название трансдукция — перенос фагом генов бактерии-хозяина от клетки к клетке. Различают специфическую и неспецифическую (общую) трансдукцию. Специфическая трансдукция впервые описана Ледербергом и его сотрудниками на примере колифага λ.. Они проводили заражение различных типов ауксотрофных мутантов штамма E. coli K12 фагом λ, выращенном на исходном прототрофном штамме K12. Чтобы проверить, не передались ли с помощью бактериофага ауксотрофам гены штамма дикого типа, культуры высевали на селективные среды. Результаты были в основном отрицательные, ни один из признаков донора не передавался фагом λ лизогенизированным реципиентам. Было лишь одно исключение — бактерии gal- (не способные утилизировать галактозу) с вероятностью 10-6 приобретали от донорского штамма признак gal+. Таким образом, было установлено, что фаг λ способен переносить (трансдуцировать) гены, но трансдукция носит специфический характер и ограничивается только генами gal, так как ДНК фага λ интегрирует в бактериальную хромосому в непосредственной близости от гена gal. С определенной вероятностью при выщеплении профага λ из состава бактериальной хромосомы происходит ошибка, и наряду с генами фага выходит область gal-гена E. coli, а часть фаговых генов остается в хромосоме. Трансдуцирующий фаг λ (λ gal) является дефектным. От 1/4 до 1/3 его генома замещается на область gal бактериальной хромосомы. Такие фаги не способны к вегетативному размножению, не образуют негативных колоний на газоне чувствительных бактерий. Однако при попадании в клетку хозяина, они делают ее устойчивой к повторной инфекции фагом λ. Дефектный фаг размножается и дает структурно полноценное потомство только при наличии фага-помощника (нормального фага λ, присутствующего в клетке-хозяине одновременно с дефектным). Такое возможно при одновременном инфицировании бактерии, как дефектным по гену gal, так и нормальным, диким фагом λ. Неспецифическая (общая) трансдукция была описана Ледербергом и Татумом несколько раньше, чем специфическая. Это явление было открыто неожиданно, при попытке изучить половой процесс у Salmonella typhimurium. Для этого был использован метод, ранее позволивший продемонстрировать коньюгацию у E. coli. На синтетическую среду, содержащую только соли и углевод как источник углерода и энергии и не содержащую аминокислот, высевали смесь двух ауксотрофных мутантов S. typhimurium. Один из них нуждался для роста в фенилаланине, триптофане, тирозине (Phe-, Trp-, Tyr-), другой — в метионине и гистидине (Met-, His-). Одна из 100 000 колоний образовывала прототрофные колонии. Они являлись результатом генетической рекомбинации этих двух штаммов, в котором объединились аллели дикого типа Phe+, Trp+, Tyr+ от одного штамма и Met+, His+ — от другого. Был сделан вывод, что у Salmonella, как и у Escherichia, может происходить генетический обмен, в результате которого образуются рекомбинанты с генетическими признаками разных предков. Однако, в отличие от E. coli, Для образования рекомбинантов у сальмонелл не требуется контакта между родительскими клетками. Обмен генов происходил за счет фага P22, который содержался в одном из родительских штаммов в форме профага. Фаг P22 способен трансдуцировать любой ген Salmonella. Такой вариант трансдукции получил наименование «общая», «неспецифическая». Было выяснено, что частота трансдукции для всех генов приблизительно одинакова и невысока — 10-5. Одновременно несколько признаков (генов), как правило, не передаются. Исключение составляют тесно сцепленные гены (расположенные рядом на хромосоме). Величина трансдуцируемого фрагмента ДНК ограничена объемом фаговой головки. Фаговая частица, осуществляющая общую трансдукцию и содержащая только бактериальную ДНК, не способна к вегетативному размножению и не «иммунизирует» клетку хозяина. Такие частицы возникают в результате ошибок при упаковке ДНК в фаговые капсиды. Фаги, подобные P22, были выделены также и для E. coli, в частности фаг P1. В экспериментах по общей трансдукции генов E. coli фагом P1 была подтверждена правильность построения генетических карт хромосомы E. coli, уточнены расстояния между генами, созданы карты тонкой структуры генома. При трансдукции фаги изменяют свойства бактериальной клетки, привнося в нее генетическую информацию (фрагмент хромосомы) от предыдущей клетки-хозяина. Однако и сам «дикий» не дефектный профаг при лизогенизации клетки, делая ее «иммунной», может сообщать ей новые признаки. Такое явление получило название «фаговая конверсия». Например, E. coli после лизогенизации фагом λ приобретает устойчивость к ряду мутантов вирулентных T-четных фагов. Наличие профага P1 в клетке E. coli делает ее устойчивой к инфицированию неродственным фагом λ. Фаг λ способен адсорбироваться на лизогенизированных клетках E. coli и инъецировать в них свою ДНК. Затем эта ДНК подвергается рестрикции (разрезанию на несколько фрагментов) за счет эндонуклеазы, кодируемой профагом P1, после чего внутриклеточное развитие фага λ прекращается. Наиболее ярким примером лизогенной конверсии служит образование дифтерийного токсина у Corynebacterium diphtheriae. После обработки нетоксигенных штаммов коринобактерий умеренными дифтерийными фагами среди выживших бактерий можно выделить токсигенные штаммы. При этом существует четкое соответствие между токсигенностью и лизогенностью. Однако, в отличие от системы E. coli — фаг λ, где конверсия проявляется в состоянии профага, образование дифтерийного токсина происходит только после индукции профага, в период внутриклеточного вегетативного развития фага. Таким образом, дифтерийный токсин является побочным продуктом вегетативного развития фага. 6.3. Фаговые векторы Генетические исследования фаговых геномов, построение их точных генетических карт, позволили разработать на основе фаговых ДНК векторные системы для решения генно-инженерных задач. Особенно удачный вектор был сконструирован на основе колифага λ. Фаг λ — умеренный колифаг с длинным несократительным хвостовым отростком и днДНК геномом размером 48 502 п.н. Центральная часть генома фага несущественна для его функционирования и используется для заместительной вставки клонируемой ДНК по единственному сайту узнавания для рестриктазы EcoRI. Сам по себе этот вектор короток для упаковки в головку фага (размеры головки накладывают ограничение не только на максимальную, но и на минимальную длину генома). Таким образом, чтобы получить фаг, способный размножаться с образованием зрелых фаговых частиц, в разрезанный родительский вектор должен быть непременно встроен фрагмент чужеродной ДНК. Это приводит к образованию автоматической селективной системы для отбора химерных фаговых геномов. Для удобства отбора рекомбинантных фагов в несущественную область генома, используемую для вставки, введен ген lacZ. Рекомбинантные фаги отбирают из зон лизиса бактериального газона, имеющих белый цвет. Фаг M13 — нитевидный колифаг, имеющий кольцевой онДНК-геном. Для получения рекомбинантных ДНК используют репликативную форму фага, представляющую собой кольцевую двухнитевую ДНК размером 6400 п.н., в которую вставлен ген lacZ, содержащий полилинкер сайтов для целого ряда рестриктаз. Рекомбинантные фаги отбирают из зон лизиса бактериального газона, имеющих белый цвет. Использование векторов на основе фага M13 имеет ряд положительных моментов. Так, одно клонирование дает два вида фагов с однонитевым ДНК-геномом. Каждый вид фага содержит только одну из нитей вставки ДНК, которые могут находиться в разных ориентациях. В связи с этим, клонирование с использованием фага M13 удобно для создания однонитевых ДНК-зондов и секвенирования ДНК. Попытка объединить преимущества плазмидных и фаговых векторов привела к созданию космид. Это плазмиды со встроенными специфическими последовательностями ДНК (cos — сайтами), отвечающими за Упаковку ДНК фага λ в фаговой частице. Такие векторы могут существовать в бактерии в виде плазмид, но могут быть выделены в чистом виде путем их упаковки в фаговые частицы in vitro. Ценность космидных векторов заключается в их большой емкости — то есть в возможности клонирования вставок большого размера. На длину этих векторов также накладываются ограничения, обусловленные размером головки фага, но в таком геноме не обязательно присутствие генов, необходимых для литического цикла. 6.4. Лечебные препараты бактериофагов Применение бактериофагов в качестве антибактериальных лечебных препаратов начато достаточно давно, ранее открытия антибиотиков. Уступая антибиотикам в спектре антибактериальной активности, технологически, бактериофаги обладают рядом характеристик, которые позволили им сохраниться в перечне лекарственных средств до настоящего времени. В первую очередь, их отличает высокая специфичность и избирательность действия. Они поражают только один вид болезнетворных бактерий, не влияя на нормальную микрофлору человека. Бактериофаги не взаимодействуют с клетками человека, что обуславливает отсутствие противопоказаний к их применению и побочных реакций от их использования. Бактериофаги преимущественно используются для лечения пациентов с выраженной отрицательной реакцией на антибиотики: недоношенных детей, лиц с аллергическим статусом, дисбактериозами. В Нижегородском НИИ эпидемиологии и микробиологии совместно с сотрудниками кафедры молекулярной биологии и иммунологии ННГУ им. Н.И. Лобачевского и Нижегородского предприятия по производству бактерийных препаратов под руководством академика РАМН И.Н. Блохиной разработаны фаговые препараты, направленные против большинства бактериальных возбудителей острых кишечных и гнойно-воспалительных инфекций: дизентерийный, сальмонеллезный, колипротейный, клебсиеллезный, стафилококковый, синегнойный бактериофаги. Все перечисленные препараты являются поливалентными, то есть способными разрушать клетки большинства вариантов соответствующего вида бактерий. Исходно фаговые препараты представляли собой суспензию фаговых частиц в питательной среде. Благодаря разработке методов концентрирования фага были созданы новые формы — фаги в таблетках и свечах. Дальнейшее совершенствование технологий производства бактериофагов позволило увеличить активность фагов, приступить к выпуску комплексных форм, эффективных в отношении нескольких видов бактерий, расширить области применения фаговых препаратов. Глава 7. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАЗИТЫ РАСТЕНИЙ 7.1. Вироиды Первое упоминание о ранее неизвестном субвирусном патогене датируется 1971 годом. Изучая этиологию заболеваний картофеля веретеновидностью клубней, Динер с сотрудниками обратили внимание на необычные свойства возбудителя, который был назван вироидом. Вироиды (Vd) — автономные фрагменты генетического материала, транскрибированного в однонитевую РНК. Вироиды представляют собой небольшие ковалентно-замкнутые молекулы онРНК с м.м. 100-120 кД и размером 350-500 рибонуклеотидов со сложной вторичной структурой, обеспечивающей защиту молекулы от нуклеаз. РНК вироидов не имеет АУГ-кодонов и не кодирует белковых продуктов. Вироиды функционируют только в вегетативной форме, покоящаяся фаза (наличие вирионов) отсутствует. По всей вероятности, вироиды произошли от нитронов и подвижных генетических элементов — транспозонов. Все вироиды обладают выраженным структурным сходством. Все изученные к настоящему времени вироиды имеют гомологию нуклеотидных последовательностей, равную 70-80%. При этом обнаруживаются последовательности, типичные для концов транспозонов, оканчивающихся УГ и ЦА. Интрон — транскрибируемый участок ДНК, который удаляется из состава транскрипта при сплайсинге. Транспозон — последовательность ДНК, способная реплицироваться и внедрять одну из копий в новое место генома. Структурно вироиды могут быть организованы как мономеры и как мультимеры (рис. 19). Нативная структура мономерного вироида содержит серию коротких расплетенных внутренних петель (О), организованных в 5 структурных доменов. Крайние домены инвертированы относительно центрального консервативного домена. Границы между доменами определены путем сравнения нуклеотидных последовательностей различных вироидов. Наличие двух и более консервативных доменов определяет мультимерность вирида. Вироиды не имеют собственной системы репликации и не требуют вируса-помощника. Репликация осуществляется за счет ферментов клетки хозяина — РНК-зависимой РНК-полимеразы, РНКазы и РНК-лигазы. Репликация вироидов происходит в ядре клетки и идет по типу катящегося кольца. Для ряда вироидов установлено, что процессинг олигомерных интермедиатов репликации осуществляется за счет рибозимазной активности вироида по механизму «самосплайсинга», т.е. аутокаталитического выщепления участков РНК, расположенных между определенными структурными элементами молекулы. Рис. 19. Вироиды крайне устойчивы к воздействию физико-химических факторов. Они термостабильны, не разрушаются после обработки хлороформом, фенолом, этанолом, что и является одним из подтверждений их нуклеиновой природы. Вироиды — высокоинфекционные агенты. Они переходят из клетки в клетку только в том случае, если клетка-донор и клетка-реципиент оказываются поврежденными. Вироиды могут распространяться как горизонтально (передаются с посадочным материалом, во время прививок, механической инокуляцией), так и вертикально (с семенами и пыльцой). Биологические переносчики, осуществляющие горизонтальную передачу, не установлены. Болезни растений, вызываемые вироидами, получили название вироидозы. Вироидозы по своим проявлениям существенно не отличаются от других вирусных болезней растений. Первым вироидозом, привлекшим внимание вирусологов, была, как уже отмечалось, болезнь веретеновидности клубней картофеля, вызываемая вироидом ВВКК (PSTVd). Этот вироид обладает поразительной устойчивостью к действию ингибиторов, которые содержатся в созревающих семенах и обычно инактивируют вирусы картофеля. Это оригинальное свойство ВВКК определяет его способность передаваться с семенами и пыльцой. Другой повсеместно распространенный вироидоз — экзокортис цитрусовых. Вироид экзокортиса цитрусовых (ВЭК) поражает лимонные, апельсиновые и мандариновые деревья. Заболевание характеризуется задержкой роста, усилением ветвления побегов, отслаиванием коры, хлорозом листьев. ВЭК передается только горизонтально. Что лежит в основе патогенетических свойств вироидов пока, не ясно. Предполагается, что эти свойства не являются первичным свойством генетических элементов, от которых произошли вироиды. 7.2. Вирусоиды и вирусы-сателлиты Вирусоиды — кольцевые сателлитные РНК, которые часто сопровождают РНК-содержащие вирусы, полностью зависят в своей репликации от вируса-помощника и реплицируются основным вирусом по типу катящегося кольца. Так например, в растениях, пораженных собемовирусами, обнаруживается кольцевая вирусоидная РНК, которая отличается от линейной РНК вируса—помощника. Вирусы-сателлиты (SV) — субвирусы, вирусы-паразиты вирусов. SV не несут всей информации, необходимой для их репликации, в связи с чем SV паразитируют на генных продуктах, образованных другими, часто не родственными вирусами. Сателлиты вирусов растений имеют небольшой РНК-геном (400-1200 рибонуклеотидов), который, как правило, не имеет гомологии с геномом вируса-помошника и инкапсидирован в капсид. Белок, формирующий капсид может быть продуктом трансляции генома SV, или может быть капсидным белком вируса-хозяина. Примером SV растений является сателлит вируса некроза табака — STNV. Икосаэдрическая частица STNV имеет размер 17 нм, что гораздо меньше размера вириона вируса-помошника — TNV (Necrovirus), размер которого составляет 30 нм. Дефектный геном также меньше — 1200 нуклеотидов. STNV размножается в присутствии TNV, но кодирует свой собственный белок. Серологически капсидные белки STNV и TNV не имеют никакого родства. Другой SV — сателлит вируса кольцевой пятнистости табака (Nepovirus) не только реплицируется с участием РНК-полимеразы вируса-помощника, но и использует для инкапсидации своей РНК капсидный белок помощника. Вирусы-сателлиты и сателлитные РНК могут играть важную роль в природе, так как они влияют на характер течения вирусного заболевания растения, ослабляя или утяжеляя его проявления. 7.3. Вирусы растений 7.3.1. Характеристика семейств фитовирусов Вирусы растений распределены на 16 семейств, включающих 75 родов, 24 из которых являются блуждающими (табл. 5). При рассмотрении таблицы следует обратить внимание на то, что три семейства вирусов растений являются общими с вирусами позвоночных (Reoviridae, Rhabdoviridae, Bunyaviridae), а одно семейство является общим с вирусами грибов — Partitiviridae. У вирусов растений встречаются как оболочечные вирионы, так и вирионы, лишенные оболочки. Оболочку имеют представители рабдовирусов и буньявирусов. Реовирусы представляют собой двукапсидные частицы. Вирионы геминивирусов (Geminiviridae) характеризуются уникальной организацией и представляют собой спаренную структуру, состоящую из двух слившихся икосаэдров (T=1). Вирионы других вирусов являются непокрытыми структурами с икосаэдрическим или спиральным типом симметрии — округлые, бациллоформные, палочковидные и нитевидные. Палочковидные и нитевидные (+)РНК-содержащие вирусы относятся исключительно к вирусам растений. У вирусов растений представлены не все виды геномов. Среди вирусов, поражающих высшие растения, не обнаружено днДНК-геномных вирусов. днДНК-геномные вирусы обнаружены лишь у хлорофиллсодержащих организмов — одноклеточных зеленых водорослей (хлорелла), парамеций, микромонад и хризомонад (Phycodnaviridae). Геном в виде однонитевой кольцевой ДНК имеют геминивирусы (Geminiviridae). Двухнитевую незамкнутую кольцевую ДНК, реплицирующуюся через стадию обратной транскрипции, имеют каулимовирусы (Caulimoviridae); все остальные вирусы являются РНК-содержашими: (-)РНК, (+)РНК, амбисенс РНК. Таблица 5 Среди вирусов растений широко распространено явление мультипартитности (разобщенности генома) — то есть распределение фрагментов генома в разные вирусные частицы. Количество различающихся вирусных частиц может быть равно 2, 3 или 4. Соответственно вирусы называют бипартитными, трипартитными, тетрапартитными или квадрипартитными. Размер вирусных частиц мультипартитных вирусов может быть одинаковым, а может различаться, что связано с различиями в длине инкапсидированных фрагментов генома. Явление мультипартитности обнаружено как у изометрических, так и у палочковидных вирусов и наиболее широко распространено среди вирусов с (+)РНК-геномом. Например, бипартитными являются представители семейства комовирусов, геном которых размещен в двух изометрических вирионах одинакового размера. В семействе бромовирусов у альфамовирусов геном размещен в четырех бациллоформных вирионах различной величины (тетрапартитные вирусы), а у бромо- и кукумовирусов — в трех изометрических вирионах одного размера (трипартитные вирусы). Трипартитными палочковидными вирусами являются хордейвирусы, бипартитными — тобравирусы. Ни полные вирионы, ни входящие в их состав РНК, взятые в отдельности, не обладают инфекционностью. Для запуска инфекционного процесса необходимо попадание в клетку всех фрагментов генома. В случае проникновения в клетку только вириона, несущего РНК, кодирующую РНК-полимеразу, развивается неустойчивая инфекция, при которой образуется лишь одна вирусная РНК. Такой эффект обнаружен у бипартитного палочковидного вируса стеблевой морщинистости табака (Tobravirus). 7.3.2. Распространение фитовирусов Вирусы растений распространяются в биосфере с участием как природных (ветер, дождь разносят инфицированные семена, пыльцу), так и антропогенных факторов (прививки, вегетативное размножение и размножение семенами, междурядная обработка почвы, импортирование растений). Важную роль в распространении вирусов растений играет орнитохория — перенос плодов и семян птицами. В ряде случаев источником заражения сельскохозяйственных растений являются сорняки и дикорастущие виды, которые являются природным резервуаром вирусов. Инфекция у них, как правило, протекает бессимптомно. Ведущим и древнейшим способом распространения фитопатогенных вирусов является их трансмиссивная передача биологическими переносчиками. Около полутора десятков вирусов растений могут переноситься почвенными нематодами. Своим стилетом они прокалывают покровы корня около корневого чехлика и высасывают содержимое клеток эпидермиса. Питаясь на больном растении, нематода приобретает вирус, который может персистировать в ее теле до 8 месяцев и передаваться здоровому растению опять в процессе питания. В ряде случаев вирусы растений распространяются зооспорами грибов-паразитов. Наиболее изученным является хитридиомицет Olpidium brassicae («черная ножка капусты»), паразитирующий на корнях растений. Вирус некроза табака распространяется, находясь на поверхности зооспоры олпидиума, а вирус карликовости табака — внутри нее. При отмирании корней растения покоящиеся в них зараженные вирусом споры гриба попадают в почву. Зооспоры прикрепляются к корням здоровых растений и, прорастая, разрушают оболочку клеток корня, после чего цитоплазма гриба проникает в цитоплазму растительной клетки. Нарушение целостности клеток эпидермиса позволяет вирусу проникать в цитоплазму клеток корня растений. Распространение фитопатогенных вирусов может происходить при помощи повилики. Повилика — вьющееся бесхлорофильное растение, лишенное листьев, которое питается соками высшего растения-хозяина путем внедрения в его проводящую систему своих присосок. Повилика может одновременно кормиться на двух и более растениях и как бы мостиком соединяет их проводящие пути. Если одно из растений инфицировано, вирус приобретает возможность проникать в здоровые особи. Основным естественным переносчиком вирусов растений в природе являются насекомые — прыгающие, летающие, ползающие (крылатые и бескрылые тли, цикадки, кузнечики, трипсы, кокциды, жуки-листоеды, галлообразующий клещик). Насекомые могут переносить вирусы растений механически — на лапках или с использованием так называемого «стилет-опосредованного» механизма в процессе питания, что широко распространено у тлей. Тли приобретают вирус, насасывая сок инфицированного растения, сохраняют его в течение нескольких часов и вносят вирус в ткани нового растения, прокалывая их своим хоботком. Как правило, насекомые-переносчики являются промежуточным хозяином вирусов растений, т. е. также инфицируются, репродуцируют инфекционный вирус в своем организме и передают его потомству. Персистенция может быть бессимптомной, в ряде случаев инфицирование наносит вред организму насекомого. С использованием техники инъекций насекомым Мараморошу в 1952 г. показал, что вирус желтухи астр реплицируется в жировом теле переносчика — шеститочечной цикады Macrosteles fascifrous и передается потомству трансовариально. До 1% отродившихся личинок наследуют вирус. У инфицированных таким образом цикад наблюдалось отставание в развитии и уродства. То, что вирусы растений, переносимые цикадами, могут передаваться потомству инфицированными женскими особями, показано также для вируса карликовости риса и вируса деформации листьев клевера. Более того, присутствие в жизненном цикле этих вирусов хозяина-растения необязательно. Таким образом, насекомые являются: механическими переносчиками вирусов растений; хозяевами растительных вирусов; резервуаром потенциально патогенных вирусов растений. 7.3.3. Вирусные заболевания растений По способу внедрения возбудителя в организм хозяина все вирусные болезни растений относятся к раневым инфекциям. Исключение составляет инфицирование растений-паразитов, куда вирус проникает в ткани при объединении проводящих путей растения-паразита и инфицированного хозяина. Вирусы распространяются в организме растения от клетки к клетке по плазмодесмам при участии элементов цитоскелета со скоростью примерно 1 мм в день, иногда еще медленнее. Когда вирус попадает в проводящие ткани, то может переноситься по растению со скоростью 2,5 см в минуту. В принципе, вирусы могут распространяться по всему растению, причем степень генерализации процесса зависит как от свойств вируса, так и от свойств растения-хозяина. В связи с этим, вирусные инфекции растения могут быть локальными или системными. Реакция клеток хозяина на вирусную инфекцию варьирует. Одним из крайних проявлений инфекции является некроз. В этом случае клетки отмирают столь быстро, что не успевают передать вирус соседним клеткам. При некротических вирусных инфекциях в тканях листа увеличивается синтез полифенолоксидазы и, соответственно, токсичных полифенолов и хинонов, что, по всей вероятности, и лежит в основе механизма, ведущего к локальному некрозу тканей растения. Другое крайнее проявление реакции растения на вирусную инфекцию — бессимптомное вирусоносительство, при котором клетки растения сохраняют способность к делению. Наличие вируса в теле кажущегося здоровым растения обнаруживается по эффекту проявления инфекции у другого вида растения (растение-индикатор) в случае передачи вируса. Как правило, инфицирование растений вирусами сопровождается мозаичностью, пятнистостью, полосатостью листьев, их скрученностью, отставанием растения в развитии (карликовостью), аспермией (бессемянностью). Одной из характерных особенностей многих фитопатогенных вирусов является их агрегация в виде аморфных кристаллических включений, наблюдаемых в ядре, цитоплазме и хлоропластах. Накопление вирусных включений в хлоропластах, приводящее к потере или изменению пигментации, называют хлорозом. Размножение вирусов, в большинстве случаев, приводит к лизису клеток и может вызывать гибель растения. Несмотря на то, что проявление симптомов варьирует в зависимости от возбудителя, генотипа растения, климатических и других факторов, первым методом диагностики вирусных заболеваний растений является метод оценки по внешним признакам. Данные, полученные при визуальном обследовании растения, позволяют сделать вывод о природе заболевания. В сомнительных случаях, а также при диагностике латентных инфекций, применяют метод растений-индикаторов и методы иммунологической диагностики — латекс-тест, метод двойной диффузии в агаровом геле, иммуноферментный анализ и иммуноэлектронную микроскопию. Вирусы растений могут иметь узкий, ограниченный или широкий круг хозяев. Например, тенуивирусы поражают только однодольные растения семейства злаковых, представители рода каулимовирусов имеют круг хозяев, ограниченный несколькими семействами однодольных растений, баднавирусы поражают широкий круг хозяев. Вирусы, имеющие широкий круг хозяев и специфичных переносчиков, способны формировать у растений природные очаги вирусных инфекций. Для формирования природного очага необходимо наличие многих растений-резерваторов (многолетние сорные и дикорастущие растения, которые служат источником инфекции) и нескольких видов специфических переносчиков вируса. Миграция инфицированных насекомых-переносчиков с дикорастущих растений на культурные происходит при изменении условий среды обитания переносчика. В частности, при высокой температуре и засухе дикорастущие растения становятся непригодными для питания насекомых, что заставляет их мигрировать на культурные растения. В таких крайних случаях вирусное заболевание растений может приобретать характер ЭПИФИТОТИИ (массовое инфекционное заболевание растений). Инфицирование растений теми или иными вирусами может не иметь никакого экономического значения (потивирусы, томбусвирусы). В то же время, целый ряд других вирусов наносят огромный вред сельскохозяйственным культурам. В связи с этим, вирусные болезни растений представляют собой важную проблему фитопатологии., поскольку наносят большой ущерб сельскому хозяйству. Эти болезни поражают плодовые, ягодные культуры и виноград, бахчевые и зерновые культуры, наносят вред тепличному производству и плантациям. Ущерб, наносимый вирусами растений в США, исчисляется биллионами долларов. Урожаю риса наносят вред вирус карликовости риса (фитореовирус) и вирус стерильной карликовости риса (тенуивирус). Картофель наиболее часто страдает от вируса карликовости картофеля (нуклеорабдовирус), вируса X картофеля (потексвирус), вируса Y картофеля (потивирус). Плодово-ягодные культуры преимущественно поражаются альфамо- и иларвирусами; тепличные культуры и плодовые деревья — кри-нивирусами; вирус мозаики цветной капусты (каулимовирус) наносит огромный вред урожаю капусты в Китае. Вирус табачной мозаики (тобамовирус) является причиной потерь не только табака, но и томатов, перцев и бахчевых культур, у которых он вызывает внутренний некроз плодов. Для борьбы с вирусными заболеваниями растений применяют различные подходы, разработанные как на уровне обычных сельскохозяйственных, так и современных наукоемких подходов: — проведение профилактической дезинфекции инвентаря, пропаривание почвы и субстратов в теплицах, или их замена; — термотерапия посадочного материала. Вирионы многих вирусов растений (но не всех) термолабильны. Это их свойство лежит в основе термотерапии ряда вирусных болезней. Так, основным способом освобождения картофеля от вируса скручивания листьев и X-вируса картофеля является его погружение на несколько минут в воду, прогретую до 50-60 °C; вирус бронзовости томатов инактивируется при 40-48 °C в течение 10 минут. Для освобождения от вируса карликовости тростника термотерапия является производственным приемом; — борьба с естественными переносчиками фитопатогенных вирусов; — хемотерапия с использованием вироцидов; — получение и сохранение свободных от вирусов клонов растений, базирующееся на методе апикальной культуры меристемы; — создание трансгенных растений, устойчивых к вирусным инфекциям, основанное на технологии рекомбинантных ДНК. ^ 8.1. Группы вирусов членистоногих Вирусы, поражающие беспозвоночных, условно можно разделить на три группы: первая включает вирусы растений, для которых промежуточными хозяевами являются насекомые; вторая — это арбовирусы — вирусы человека и животных, для которых членистоногие также являются промежуточными хозяевами; третья группа вирусов — это собственно вирусы насекомых или энтомопатогенные вирусы. Как уже отмечалось, целый ряд фитопатогенных вирусов включает в цепь своей циркуляции насекомых-переносчиков. В основном это разнообразные виды тлей и цикадовых. При этом, фитовирусы, в зависимости от вируса и особенностей биологии насекомого, могут бессимптомно персистировать в его организме или вызывать патологический процесс. Взаимоотношения вируса растений с насекомым могут достигать такого уровня, что вирус растения перестает нуждаться в растении для своего размножения и передачи и может полностью воспроизводиться в организме насекомого, передаваясь вертикально. Такой уровень взаимоотношений установлен для вируса карликовости риса, вируса деформации листьев клевера. Вирусы растений могут различными путями интерферировать в теле своих насекомых-переносчиков. Так, заражение цикадок одним из штаммов вируса желтухи астр препятствует заражению другим штаммом этого вируса (двусторонняя интерференция), а инфицирование цикадки вирусом карликовости злаков защищает насекомое от повторного инфицирования этим же штаммом вируса (односторонняя интерференция). Другой аспект взаимоотношений вирусов растений со своими хозяевами-насекомыми заключается в способности фитовирусов помогать насекомому менять круг растений, подходящих для питания. Смена может привести к внезапному появлению «новых» насекомых на тех культурах, которые ранее не подвергались нападению таких вредителей. Открытие «полезного» влияния вируса на своего хозяина-переносчика было сделано при изучении взаимоотношений цикадок с вирусом желтухи астр. Арбовирусы приобретаются членистоногими в процессе питания (кровососания) на хозяевах, содержащих возбудитель во внутренних средах организма. Эти вирусы могут реплицироваться в организме беспозвоночных и передаваться в ряду поколений трансспермально, трансовариально и в процессе метаморфоза. В цепи циркуляции арбовирусов участвуют иксодовые, аргасовые, гамазовые и краснотелковые клещи, комары, мокрецы, москиты, мухи-кровососки, клопы, блохи. Особенности взаимоотношений этих вирусов с организмом хозяев будут рассмотрены в разделе о природной очаговости вирусных инфекций. В цепь циркуляции вирусов, возбудителей природно-очаговых заболеваний животных и человека могут вовлекаться хищные насекомые. Так, трупоядные жуки и мясные мухи при питании на умерших от бешенства животных могут приобретать вирус бешенства. В свою очередь, лисы, поедая таких жуков, инфицируются вирусом и способны передавать его далее. 8.2. Характеристика семейств энтомопатогенных вирусов В современной классификации энтомопатогенных вирусов выделено 12 семейств, включающих 22 рода. Один род не классифицирован и включает вирусы, подобные вирусу паралича сверчков, ранее входившие в состав семейства пикорнавирусов. Пять из 12 семейств образованы только вирусами насекомых (Asco-, Polydna-, Baculo-, Noda- и Tetraviridae). В состав пяти семейств входят также вирусы позвоночных. В состав еще двух семейств, кроме вирусов насекомых, входят вирусы грибов. Краткая характеристика семейств вирусов насекомых представлена в таблице 6. При рассмотрении таблицы следует обратить внимание, что среди вирусов насекомых обнаружены оболочечные (Pox-, Asco-, Baculo-, Rhabdoviridae) вирусы и вирусы, лишенные оболочки. Отсутствуют палочковидные и нитевидные безоболочечные формы вирионов. Изометрические вирионы могут быть округлыми или бациллоформными. Обнаружены бипартитные (Nodaviridae, Omegatetravirus) и мультипартитные вирусы (Polydnaviridae). У энтомопатогенных вирусов представлены все виды геномов. Ретроидные вирусы, репликация которых включает стадию обратной транскрипции, представлены вирусами, геном которых содержит последовательности, гомологичные ретротранспозонам. Эти вирусы, обнаруженные у дрозофилы (вирусы копиа и гипси), выделены в самостоятельные семейства, включающие также вирусы сахаромицетов (Pseudoviridae, Metaviridae, соответственно). Таблица 6 8.3. Взаимоотношения вирусов насекомых с хозяином Вирусы насекомых распространяются в биосфере как естественным, так и искусственным путем при участии человека. Основная роль в распространении вирусов отводится миграциям самих хозяев-насекомых. Немаловажная роль принадлежит и насекомым-переносчикам энтомопатогенных вирусов (вирусофорам). Например, рабочие пчелы, матки и трутни являются хозяевами для клещей Acaripis. Клещи, питаясь на инфицированных пчелах, становятся вирусофорными. Пчелы могут залетать в чужие ульи и таким образом распространять инфицированных клешей между семьями пчел и пасеками. Таким путем распространяются вирусы Нодамура, Арканзас, вирусы хронического и острого паралича пчел. Энтомопатогенные полиэдрические вирусы могут распространяться хищными насекомыми и мясными мухами, которые питаются гусеницами, погибшими от инфекции. Искусственное распространение вирусов насекомых человеком происходит при организации мер контроля за численностью популяций насекомых-вредителей. Вирусы насекомых распространяются двумя путями: горизонтальным (насекомое приобретает вирус, питаясь загрязненными субстратами) и вертикальным путем (от родителей потомству). По спектру хозяев энтомопатогенные вирусы могут быть узкоспецифичными (см. таблицу 6) или иметь широкий круг хозяев. Наиболее широкораспространенным и наиболее вирулентным среди вирусов насекомых является вирус Нодамура (Nodaviridae), обладающий тропностью к мышечным и нервным клеткам. Попадая в организм насекомого, вирус может длительное время бессимптомно персистировать, а затем вызывать острую инфекцию, приводящую к летальному исходу. Одной из отличительных черт вирусных инфекций насекомых является образование при репродукции вирусов внутриклеточных включений — полиэдров и гранул, называемых тельцами включений. Ряд широкораспространенных вирусных заболеваний насекомых получил свое название от места локализации и формы телец включения. К таким заболеваниям относятся ядерный полиэдроз и гранулез, вызываемые бакуловирусами, цитоплазматический полиэдроз, вызываемый реовирусами, и денсонуклеоз, вызываемый энтомопарвовирусами. Эти вирусы имеют большое экономическое значение, так как наносят вред полезным насекомым — пчелам, тутовому и сибирскому шелкопряду. Другой аспект экономического значения вирусов насекомых заключается в том, что они используются для борьбы с вредными насекомыми. Взаимоотношения вирусов насекомых с хозяином не всегда носят характер паразитизма. Описаны случаи симбиотических взаимоотношений. В качестве примеров двух крайних проявлений взаимодействия вирусов насекомых со своими хозяевами рассмотрим два семейства вирусов. Полиднавирусы (Polidnaviridae) Семейство включает своеобразную группу вирусов, поражающих насекомых-паразитов. Вирионы — цилиндрические или эллипсоидные нуклеокапсиды вариабельных размеров. Геном — сегментированная кольцевая суперскрученная днДНК, интегрирует в хромосомы яйцеклеток и клеток спермы и передается согласно законам менделевского расщепления. В настоящее время установлено, что все особи наездников инфицированы полиднавирусами и являются их бессимптомными вирусоносителями. Вирусы реплицируются в эпителиальных клетках яйцеводов насекомого и обнаруживаются в секретах калекса в большом количестве. В процессе паразитоидного развития насекомого после впрыскивания наездником яиц в тело хозяина (личинка другого насекомого) вирус проникает в его ткани, где реплицируется. Инфицирование полиднавирусами клеток хозяина наездника приводит к физиологическим изменениям в организме последнего. Эти изменения включают ингибирование роста личинок и ингибирование фенолоксидазной активности, которая выполняет у насекомых функцию, связанную с иммунологическим надзором. Результатом ингибирования фенолоксидазной активности является угнетение иммунитета хозяина в ответ на внедрение в его тело яиц паразита. Установлено, что в отсутствие полиднавирусов яйца наездника быстро разрушаются под воздействием иммунного ответа личинки. Другими словами, жизненный цикл полиднавирусов может быть представлен двумя основными этапами. Один из них, включающий вирусную трансмиссию и репликацию, опосредуется хромосомной ДНК хозяина, в которой вирус находится в состоянии провируса. Второй — колонизация хозяина паразита, в организме которого вирусный геном транскрибируется и транслируется, но не реплицируется — опосредуется замкнутой некапсулированной молекулой вирионной ДНК. Наличие уникального симбиотического взаимодействия полиднавирусов с организмом собственного хозяина и индуцирование иммуносупресии в организме хозяина паразита определяют возможность паразитирования наездников на личинках других насекомых. Выделено два рода полиднавирусов: 1. Ichnovirus — вирусы, выделенные из организма наездников с яйцекладом (Ichneumonidae, развиваются в личинках ночной бабочки). Вирионы — оболочечные нуклеокапсиды консервативной эллипсоидной формы размером 85x330 нм. Оболочка приобретается в процессе броска через ядерную мембрану. При почковании через плазматическую мембрану могут приобретать вторую оболочку. Геном представлен 20-40 молекулами кольцевых ДНК вариабельных размеров, в сумме составляющих более 300 т.п.н. Геном упакован в один вирион. 2. Bracovirus — вирусы, выделенные из организма мелких наездников с коротким яйцекладом или без яйцеклада (Braconidae, развиваются в теле или личинке мелких насекомых, например, тлей). Вирионы — нуклеокапсиды диаметром 40 нм и вариабельной длины 30-150 нм, которая определяется размером фрагмента ДНК. Имеют единичную или групповую оболочку, приобретаемую во время лизиса клеток. Геном, так же как и у ихновирусов, представлен 20-40 молекулами кольцевой суперскрученной днДНК различного размера. Однако эти молекулы упакованы в разные вирионы — явление, которое называется мультипартитностью. Бакуловирусы (Baculoviridae) Семейство бакуловирусов (от греческого bacculum — прут, палочка) включает структурно и генетически сложные вирусы, изолированные из личинок многих разновидностей насекомых. Бакуловирусы эволюционно и серологически не связаны ни с одним вирусом позвоночных. Вирионы — оболочечные палочковидные нуклеокапсиды размером 40-60x200-400 нм. Липопротеиновая оболочка может быть ядерного или цито плазматического происхождения и содержит только один гликопротеин вирусного происхождения (gp64). Нуклеокапсид представляет собой суперскрученную ДНК, ассоциированную как минимум с четырьмя белками. Наиболее тесно ДНК связана с низкомолекулярным щелочным белком pб.9, который определяет ее уплотнение. Основной капсидный белок p39 образует вокруг ДНК белковый цилиндр, другие белки распределены в капсиде диффузно. При инфицировании бакуловирусами, как и в случае энтомопоксвирусов и вирусов цитоплазматического полиэдроза насекомых (Reoviridae), в клетке образуется большое количество так называемых телец включения. Тельца включения представляют собой один вирион или пакет вирионов, окутанных толстой прозрачной матрицей, состоящей из белка гранулина или полиэдрина, в зависимости от вируса. Гранулин и полиэдрин сходны по своему строению, их аминокислотные последовательности гомологичны на 60%. Геном вируса представлен кольцевой суперскрученной днДНК размером 100-180 т.п.н., кодирующей более 100 белковых продуктов. Отличительной особенностью генома бакуловирусов является наличие в ДНК ряда взаимозаменяющих элементов — ретротранспозонов и множества неавтономных взаимозаменяющих элементов, что свидетельствует о наличии обмена генетической информацией между хозяйским и вирусным геномами. ДНК содержит энхансеры — усилители раннего выражения ряда генов, обеспечивающие суперпродукцию гранулина или полиэдрина. В семействе выделено два рода вирусов, которые различаются морфологией телец включения, местом репликации вируса, хозяином, экологией. 1. Nucleopolyhedrovirus (NPVs) — вирусы ядерного полиэдроза. В клетке вирус образует большие многогранные тельца включений (1x15 мм), представляющие собой, как правило, пакет нуклеокапсидов, покрытых упорядоченным слоем белка полиэдрина, ассоциированного с минорными белками, определяющими инфекционность вируса. Такие структуры получили название полиэдры. NPVs инфекционны для Lepidoptera, Diptera, Hymenoptera, Trichoptera и ряда видов ракообразных, в частности креветок. На разных этапах жизненного цикла вирусов ядерного полиэдроза происходит последовательная смена двух структурно различных вирусных фенотипов. На ранних стадиях инфекции формируется почкующийся непокрытый полиэдрином вирион. Он ответственен за системное распространение вируса в пределах организма насекомого. Полиэдры образуются на поздних стадиях инфекции и играют основную роль в распространении вируса в окружающей среде. Полиэдры попадают в организм насекомого при его питании. Под воздействием щелочных секретов пищеварительного тракта они распадаются. Первично вирус реплицируется в эпителиальных клетках кишечника. Образующееся потомство инфицирует клетки соединительной ткани, затем клетки крови и, в конечном счете, клетки жирового тела насекомого. Вирус реплицируется в ядре клетки, которое увеличивается практически до размеров клетки и становится нашпигованным полиэдрами. Полиэдры освобождаются из клетки путем лизиса последней. Заболевание приводит насекомое к фатальному исходу в течение 4-20 дней. Личинки, как и взрослые насекомые, поражаются вирусом при питании на загрязненных растениях. После инфицирования личинки некоторое время еще продолжают кормиться, однако в конце инфекционного цикла становятся вялыми. Их эпидерма становится хрупкой. Личинки умирают в перевернутом положении. 2. Granulovirus (GVs) — вирусы гранулеза. Вирионы GVs, как правило, в единичном виде, упакованы в маленькие (0,15x0,5 мм) эллипсоидные тельца включений, образованные белком гранулином. Первичные стадии репликации вирусов происходят в ядре, однако ядро рано распадается и дальнейшая репродукция вируса происходит в смешанных ядерно-цитоплазматических компартментах клетки. Вирусы гранулеза, аналогично NPVs, формируют две морфологические формы вируса. Инфекционный цикл вирусов гранулеза более длителен, чем у вирусов ядерного полиэдроза — личинки после инфицирования остаются живыми более 50 дней. GVs патогенны только для членов семейства Lepidoptera. Бакуловирусы играют главную роль в регуляции численности насекомых в окружающей среде, определяя его циклический характер. Эпидемия бакуловирусной инфекции приводит популяцию насекомых к гибели. После разложения насекомых вирус механически распространяется ветром, птицами, насекомыми по обширным территориям, что приводит к возникновению новых эпидемий. Бакуловирусы имеют важное экономическое значение: — Поскольку химические инсектициды с широким спектром действия часто уничтожают полезных насекомых, бакуловирусы используются как альтернативное средство борьбы с насекомыми-вредителями. Так, GVs успешно применяют для борьбы с вредителями яблонь, груш, капусты. В тропических странах для борьбы с жуком-носорогом широкое применение нашел Oryctes-бакуловирус. Жуки-носороги — наиболее широко распространенные вредители, наносящие огромный экономический ущерб кокосовому производству. Для того чтобы передать вирус неинфицированной популяции, проводят сбор взрослых жуков, заражают их через рот (жуки охотно поглощают сладкую инфекционную жидкость) и выпускают на природу. Инфицированные жуки приводят к гибели всю популяцию в течение трех недель. — Бакуловирусы сами являются важным фактором, наносящим ущерб сельскому хозяйству. NPVs может наносить большой вред шелковичному производству, инфицируя и вызывая смерть личинок тутового и сибирского шелкопряда. NPVs являются также главной проблемой промышленного производства креветок, которые быстро погибают после инфицирования. — На основе генома бакуловирусов созданы высокоэффективные векторные экспрессирующие системы. Как уже отмечалось, ДНК бакуловирусов имеет энхансеры, обеспечивающие суперпродукцию гранулина или полиэдрина. Встраивание чужеродных генов под контроль промотора полиэдрина или гранулина позволяет получать их суперэкспрессию в культуре клеток насекомых. Так, выраженный в бакуловирусной системе экспрессии поверхностный белок ВИЧ был первым белком, использовавшимся для создания вакцины против СПИДа. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям