Особенности использования тест-систем «дс-ифа-hbsAg» и «дс-ифа-hbsAg -0,01» для тестирования препаратов крови и иммуноглобулинов на наличие hbsAg
|
|
Скачать 125.32 Kb.
|
|
Особенности использования тест-систем «ДС-ИФА-HBsAg» и «ДС-ИФА-HBsAg -0,01» для тестирования препаратов крови и иммуноглобулинов на наличие HBsAg Н.И. Егорова, И.Ю. Пыренкова, М.А. Крыжанова, И.Н. Шарипова, С.Н. Иголкина, А.Н. Бурков, Т.И. Уланова Ключевым требованием к лечебным препаратам, для производства которых требуется донорская кровь, является вирусная безопасность. Несмотря на достижения обследования и отбора доноров крови, повышение качества диагностических тест-систем, сохраняется возможность заготовки крови от лиц с отсутствием клинико-лабораторных признаков гемотрансмиссивных инфекций. Для получения серии лечебных доз препаратов крови необходимой стадией является пулирование нескольких сотен или тысяч образцов донорской крови, и чем больше размер пула, тем значительнее риск инфекционной контаминации конечного продукта. Для снижения риска контаминации препаратов крови в технологический процесс их производства вводятся дополнительные стадии инактивации вирусов. Традиционно серологические маркеры гемотрансмиссивных инфекций исследуются методом иммуноферментного анализа в сыворотке (плазме) крови доноров, из чего логично следует, что такое испытание должно проводиться в отношении сырья, а не готового препарата. Препарат крови - лекарственное средство, содержащее химически модифицированные нативные белки и стабилизаторы. Специфические диагностикумы для выявления серологических маркеров инфекций в большинстве своем разработаны именно для крови (плазмы, сыворотки) с учетом, в частности, ее физико-химических свойств (вязкости, рН и т.д.). В отношении крови как диагностического объекта разработана система подтверждающих тестов, система верификации результатов скрининга, позволяющая определить чувствительность и специфичность диагностикумов. Поэтому, считается, что использование предназначенных для крови тест-систем в отношении другого объекта не корректно, так как может привести к ложноположительным или ложноотрицательным результатам, верифицировать которые невозможно (Жибурт Е.Б., 2005). Тем не менее производителям препаратов крови предписывается проводить посерийный контроль качества препаратов крови с обязательным их тестированием на отсутствие антител к ВИЧ, вирусу гепатита С, поверхностного антигена вируса гепатита В. Существуют нормативные документы (Отраслевой стандарт ОСТ 91500.05.001.00 "Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения", утвержденный приказом Минздрава России от 1 ноября 2001 г. № 388), которые предусматривают включение в Перечень разделов фармакопейных статей и фармакопейных статей предприятий-производителей по разделам «XV. Иммунобиологические лекарственные средства (аллергены, аллергоиды, анатоксины, бактериофаги, вакцины, иммуноглобулины (антитела), иммуномодуляторы, диагностические препараты)» и «XVI. Препараты крови человека» пунктов «Специфическая безопасность: а. контроль на отсутствие HBsAg, антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 (другие контаминанты крови человека в случае установленной необходимости) (все препараты);…» и «Испытание на отсутствие антигенов (антител) вирусов гепатита, иммунодефицита человека, других возможных контаминантов крови человека», соответственно. Поэтому, несмотря на кажущуюся биологическую нецелесообразность обязательного тестирования препаратов крови на отсутствие антител к ВИЧ и вирусу гепатита С, поверхностного антигена вируса гепатита В при контроле качества препаратов крови, отсутствующего в мировой практике (Жибурт Е.Б., 2005), задачей отечественных производителей является разработка тест-систем, позволяющих с большой достоверностью выявлять маркеры гепатитов В, С, ВИЧ и т д. не только в сыворотке (плазме) крови, но и в готовых препаратах крови. Необходимостью при поиске серологических маркеров в препаратах крови становится посерийная валидация иммуноферментных тест-систем для каждого вида лекарственных средств (по методике А.В. Карякина, 2003). Таким образом, в соответствии с современными требованиями к препаратам крови, производители обязаны тестировать свою продукцию на отсутствие маркеров основных гемотрансмиссивных инфекций, при этом проводя трудоемкую процедуру посерийной валидации тест-систем, некоторые из которых уже и так предназначены предприятием-производителем иммунодиагностикумов и контролирующим органом (ФГУН ГИСК им Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора) для тестирования препаратов крови. Сохранение неблагоприятной эпидемиологической ситуации в отношении гепатита В приводит к большому риску контаминации препаратов крови вирусом гепатита В. Представленный далее материал, на наш взгляд, является достаточно убедительным, чтобы говорить о том, что тест-системы «ДС-ИФА–НВsAg» и «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» (ООО НПО «Диагностические системы») пригодны для выявления поверхностного антигена ВГВ в препаратах крови. Первый тест позволяет выявлять HBsAg в концентрации 0,1 – 0,05 МЕ/мл. Второй тест обладает более высокой чувствительностью – 0,01 МЕ/мл. Для выяснения возможности использования системы с целью тестирования препаратов крови были изучены следующие вопросы:
Для изучения первого вопроса было исследовано 9 наименований цельных препаратов крови разных серий различных производителей (Табл. 1). В тест-системах «ДС-ИФА-HBsAg» и «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» ни с одним из исследуемых препаратов (за исключением инфузамина) ложнопозитивных реакций не наблюдалось. В ряде случаев потребители могут сталкиваться с проблемой неспецифических реакций, которые могут давать препараты крови не только определенных наименований, но и определенных производителей и даже серий. В эпизодических случаях получения позитивных результатов скрининга необходимо использовать подтверждающий тест. В массовых случаях ложнопозитивных результатов рекомендуется предварительная обработка тестируемых образцов с целью устранения компонентов препарата крови (белки, фибрин), неспецифически взаимодействующих с реагентами тест-системы. В большинстве случаев достаточно прогреть образец препарата крови в течение 20-30 мин при 56 °С с последующим центрифугированием. В серии экспериментов было показано, что обработка препаратов крови данным способом не приводит к разрушению и элиминации HBsAg. В отношении инфузамина довольно частой была ситуация неспецифической реактивности в тест-системе «ДС-ИФА-HBsAg-0,01», в связи с чем необходимо исследовать инфузамин повторно с подтверждающим тестом. Наличие неспецифических реакций с препаратами крови при постановке их в одной тест-системе и отсутствие при тестировании в другой связано с особенностями конструкции тест-систем. Таблица 1 Количество неспецифических реакций с препаратами крови при выявлении HBsAg
Для решения второго вопроса была смоделирована ситуация попадания сыворотки, содержащей HBsAg в разных концентрациях, в препараты крови. Для этой цели образцы разных серий препаратов крови были искусственно контаминированы HBsAg, входящим в состав Отраслевого Стандартного Образца ОСО-HBsAg №42-28-311-06П в концентрации 20 МЕ/мл, откалиброванным по Международному Стандарту – Second International Standard for HBsAg subtype adw2, genotype A, NIBSC code number: 00/588. В соответствии с методикой проведения проверки пригодности тест-системы для контроля вирусной безопасности препаратов крови А.В. Карякина препараты крови (альбумин, инфузамин, интерферон, криопреципитат, фибринолизин) предварительно разводились в соотношении 1:1 Реагентом 1, входящим в состав набора ОСО-HBsAg, и затем использовались для приготовления образцов ОСО-HBsAg с различными концентрациями антигена. Исходный раствор ОСО-HBsAg (20 МЕ/мл) вносился в испытуемый образец препарата крови, разведенный Реагентом 1, в определенных объемах, согласно схемам (Рис.1, Рис.2). Так, при валидации тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg» для получения концентраций ОСО-HВsAg - 0,4; 0,2 и 0,1 МЕ/мл в образцы препарата крови, разведенного Реагентом 1, вносилось, соответственно, 20, 10 и 5 мкл исходного раствора ОСО-HBsAg (Рис.1).  Препарат крови Реагент 1  + 1:1 2 мл 2 мл  Рис. 1. Схема подготовки образцов препаратов крови при валидации тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg». При валидации тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» была проведена аналогичная процедура искусственной контаминации ОСО-HBsAg препаратов крови, разведенных Реагентом 1, в концентрациях 0,04; 0,02 и 0,01 МЕ/мл. Для этого готовились последовательные двукратные (путем «переката») разведения ОСО-HBsAg. В 2,0 мл образца препарата крови, разведенного Реагентом 1, вносили 4 мкл исходного раствора ОСО-HBsAg (20 МЕ/мл) и получали разведение ОСО-HBsAg, равное 0,04 МЕ/мл. Тщательно перемешивали, отбирали 1,0 мл из флакона с полученным разведением, вносили его во второй флакон с разведенным Реагентом 1 препаратом крови и получали разведение ОСО-HBsAg, равное 0,02 МЕ/мл. Аналогично готовили разведение ОСО-HBsAg с концентрацией 0,01 МЕ/мл, смешивая 1,0 мл предыдущего разведения 0,02 МЕ/мл с 1,0 мл разведенного препарата крови (Рис. 2). Препарат крови Реагент 1 2,5 мл + 1:1 2,5 мл     5 мл       Контроль 2 мл 1 мл 1 мл 1 мл ОСО-HBsAg 20 МЕ/мл    1 мл 1 мл ОПк+0,060  ОП крит. 4 мкл  0,04 МЕ/мл 0,02 МЕ/мл 0,01 МЕ/мл Рис. 2. Схема подготовки образцов препаратов крови при валидации тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg-0,01». Выявление HBsAg осуществлялось в тест-системах «ДС-ИФА-HBsAg» и «ДС-ИФА-HBsAg-0,01». В обоих тестах оптическая плотность (ОП) критическая для каждого препарата рассчитывалась путем сложения коэффициента, определяемого методом статистической обработки результатов постановки ИФА на предприятии-изготовителе, и ОП препарата крови, разведенного Реагентом 1, без добавления ОСО-HBsAg. Во всех образцах с препаратами крови выявлялось внесенное количество HBsAg. В качестве контроля использовались образцы ОСО-HBsAg с аналогичными концентрациями антигена, разведенного на Реагенте 1, без добавления препарата крови. По показателям отклонения оптической плотности образцов в присутствии препаратов крови в сравнении с контролем по всем концентрациям HBsAg находится средняя величина отклонения. По методике А.В. Карякина она не должна превышать 15%. В целях изучения влияния разных серий одного и того же препарата крови на результаты валидации тест систем «ДС-ИФА-HBsAg» и «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» была воспроизведена методика валидации А.В. Карякина c использованием 27 серий альбумина, 21 серий инфузамина и 7 серий криопреципитата. Вычислялся средний процент отклонения оптической плотности образцов препарата крови каждой серии, разведенного Реагентом 1, содержащих HBsAg в различных концентрациях, от контроля (Табл. 2). Таблица 2 Результаты валидации тест-систем для выявления HВsAg при тестировании разных серий альбумина, инфузамина и крипреципитата
Как видно из данных таблицы, разные серии препаратов крови характеризуются значительным разбросом степени отклонения оптической плотности образцов, содержащих HBsAg, от контроля. Это может быть связано как с существенной разнородностью разных серий одного и того же препарата крови по способности неспецифически связывать HBsAg, так и с конструкцией тест-систем. Часть серий препаратов крови, контаминированных HBsAg, отличается по оптической плотности от контроля больше, чем допускает методика А.В. Карякина (свыше 15%). Однако, по нашему мнению, это не является критическим условием, определяющим пригодность тест-систем «ДС-ИФА-HBsAg» и «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» для тестирования препаратов крови на отсутствие HBsAg. Основными критериями пригодности тест-системы при выявлении HBsAg в препаратах крови являются чувствительность и специфичность тест-системы в отношении препаратов крови, т.е. минимальная определяемая концентрация HBsAg не должна быть выше регламентированной величины (0,1 МЕ/мл или 0,01 МЕ/мл), а значение оптической плотности самого препарата крови не должно превышать ОП критическую. Если оптическая плотность препарата превышает критическую величину, необходимо подтвердить полученный результат в реакции нейтрализации с подтверждающим тестом. Для решения третьего вопроса в препараты иммуноглобулинов для внутримышечного (в/м) (n=2) и внутривенного (в/в) введения (n=6) добавлялась сыворотка, содержащая HBsAg в концентрации примерно 100 МЕ/мл. Количество HBsAg определялось с помощью ОСО-HBsAg путем титрования сыворотки. В качестве контроля использовался иммуноглобулин, выделенный из сыворотки, не содержащей анти-HBs, и доведенный до концентрации 100 мг/мл. Формирование комплекса происходило в течение часа. Как показали эксперименты, далеко не весь НВsAg связывается с антителами после попадания в иммуноглобулин. Остается свободным некоторое его количество, достаточное для детекции с помощью современных иммуноферментных тестов. Иммуноглобулин для в/м введения обладает большей нейтрализующей способностью по сравнению с иммуноглобулином для в/в введения. Степень нейтрализации НВsAg зависит от содержания анти-HBs в разных препаратах иммуноглобулинов. Минимальное количество антигена, которое может быть обнаружено в тест-системе «ДС-ИФА-HBsAg» после нейтрализации анти-HBs, составило 0,75-4 МЕ/мл после добавления его к раствору иммуноглобулина для в/в и 5-12 МЕ/мл после добавления его к иммуноглобулину для в/м введения. Тест-система c повышенным уровнем чувствительности «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» позволяет выявлять минимальную концентрацию HBsAg, равную 0,09-2 МЕ/мл, в иммуноглобулине для в/в введения и 0,6-3 МЕ/мл в иммуноглобулине для в/м введения после нейтрализации его анти-HBs. Таким образом, HBsAg, попавший в иммуноглобулины далеко не полностью связывается с имеющимися в них антителами. Часть его остается в свободном состоянии и может быть выявлена с помощью тест-систем «ДС-ИФА-HBsAg» и «ДС-ИФА-HBsAg-0,01». Резюмируя вышеизложенное, можно заключить, что тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg» и «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» способны выявлять HBsAg в малой концентрации не только в сыворотке (плазме), но и в препаратах крови и иммуноглобулинах и поэтому применимы для тестирования готовых препаратов крови и иммуноглобулинов на отсутствие HВsAg. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям