Комплексный подход к молекулярной диагностике ряда социально значимых заболеваний 14. 03. 10 клиническая лабораторная диагностика
|
|
Скачать 0.69 Mb.
|
|
На правах рукописи Пальцева Екатерина Михайловна КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД К МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ РЯДА СОЦИАЛЬНО ЗНАЧИМЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 14.03.10 – клиническая лабораторная диагностика Авторефератдиссертации на соискание ученой степенидоктора медицинских наукМосква – 2010 Работа выполнена в Первом Московском государственном медицинском университете им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития РФ НАУЧНЫЕ КОНСУЛЬТАНТЫ - член-корреспондент РАМН, доктор химических наук, профессор Северин Сергей Евгеньевич - доктор биологических наук, профессор Залетаев Дмитрий Владимирович ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ - член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Кушлинский Николай Евгеньевич - член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Дурнев Андрей Дмитриевич - доктор медицинских наук Кишкун Алексей Алексеевич ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ФГУ «Учебно-научный медицинский центр» Управления делами Президента РФ Защита состоится « 23» марта 2011 г. в 10.00 на заседании Диссертационного Совета Д 208.071.04 в ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» (123995, Москва, Ул. Баррикадная, д. 2/1) Автореферат разослан « » февраля 2011 г. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования по адресу: 123445, Москва, ул. Беломорская, д.19. Ученый секретарь Диссертационного Совета Д 208.071.04 доктор медицинских наук, профессор Морозова В.Т. Актуальность проблемы В настоящее время все большую актуальность приобретает диагностика различных заболеваний на основе биологических маркеров. Набор известных биомаркеров на уровне клеток и субклеточных структур пополняется таковыми на уровне генома. Создание комплекса новых биохимических и молекулярно-генетических маркеров должно дать мощный импульс для развития диагностики, позволяющей прогнозировать риски развития заболеваний, обнаружения заболеваний на ранних стадиях, а также прогнозировать течение болезни. Усилия ученых направлены на идентификацию и характеристику молекулярных биомаркеров и разработку соответствующих тест-систем и методов оценки. Это одна из актуальных задач, решаемых молекулярной медициной. Определение комплекса биомаркеров позволяет выявить молекулярные механизмы возникновения заболеваний, а также находит применение в клинической практике для диагностики широко распространенных социально значимых мультифакториальных заболеваний, таких как онкологические и сердечно-сосудистые заболевания. Ранняя диагностика сердечно-сосудистых заболеваний и необходимость создания систем быстрого определения риска их развития приобретают в последнее время все большую актуальность. Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ), в частности ишемическая болезнь сердца (ИБС) и ее осложнение – инфаркт миокарда (ИМ), продолжают оставаться главной причиной смертности мужчин и женщин экономически развитых стран Европы и США (Рагино Ю.И. и соавт., 2008; Шевченко О.П., Мишнев О.Д., 2005; Tsimikas S., Mooser V., 2004). Ежегодно в странах Западной Европы они становятся причиной смерти у 4 млн. человек. У половины, или почти у 2 млн. человек, смерть наступает в результате ИБС (Шевченко О.П., Мишнев О.Д., 2005). Болезнь коронарных сосудов – ведущая причина смертности среди населения США, составляющая более 25% смертей людей старше 35 лет (Kannel W.B., 2005). В Российской Федерации в 90-е гг. в целом заболеваемость ИБС возросла на 24%, заболеваемость стенокардией – на 41%, острым инфарктом миокарда – почти на 16%. Ежегодно в России от ССЗ умирает более 1 млн. человек. По данным ВОЗ, в структуре смертности от ССЗ на долю ИБС приходится 47% (Щепин О.П. и соавт., 2009). Многочисленные исследования в последние годы ознаменовались определенными достижениями в изучении механизмов развития и прогрессирования ИБС. Создание новых групп фармацевтических препаратов и внедрение их в клиническую практику позволили снизить риск развития острой кардиоваскулярной патологии. Тем не менее, ИБС и прогрессирование коронарного атеросклероза остаются главными причинами смертности и инвалидизации населения. Современная стратегия ведения пациентов с ИБС включает в себя раннюю и точную диагностику заболевания, стратификацию риска и прогноза, что требует поиска новых биологических маркеров и оценки их ассоциации с заболеванием. Наиболее важным представляется поиск ранних чувствительных и специфичных маркеров развития нестабильности атеросклеротических бляшек, изменение уровня которых можно обнаружить до или в отсутствие повреждения клеток миокарда (Bayes-Genis A. et al., 2001). Частота онкологических заболеваний неуклонно растет и начинает теснить сердечно-сосудистые. Так, показатель заболеваемости злокачественными новообразованиями на 100 тыс. населения в Российской Федерации в 2001 г. составил 312,3 чел., в 2006 г. – 332,2 чел. (Щепин О.П. и соавт., 2009). Исследование молекулярно-биологических причин возникновения рака - одна из наиболее актуальных проблем современной молекулярной медицины. Основной причиной злокачественной трансформации клетки являются генетические факторы. Молекулярно-генетические исследования генома злокачественной опухоли представляют собой фундаментальную проблему, разрешения которой требует клиническая практика. В связи с тем, что частота онкопатологии постоянно растет, а возраст манифестации заболевания уменьшается, большую актуальность приобретает проспективная диагностика онкопатологии в рамках ежегодных диспансеризаций и в группах риска. Поиск и характеристика молекулярной патологии в злокачественных опухолях является самостоятельным и очень важным направлением в молекулярной диагностике, так как позволяет расшифровать механизмы канцерогенеза, определить прогноз заболевания, тактику лечения и осуществлять мониторинг рецидивирования. Разработка методов обнаружения молекулярных маркеров дает возможность создавать эффективные диагностические системы. Нами разработаны и описаны в данной работе системы молекулярных маркеров для диагностики рака почки, предстательной железы, цервикальной интраэпителиальной неоплазии и рака шейки матки, увеальной меланомы. Злокачественная трансформация клетки является процессом многоступенчатым, включающим накопление структурных и функциональных изменений в геноме клетки. К структурным, или генетическим маркерам относят все нарушения, которые изменяют структуру ДНК. В первую очередь, это крупные аномалии, такие как делеции целых хромосомных районов, содержащих гены-супрессоры опухолевого роста и дупликации или амплификации районов, содержащих клеточные протоонкогены, факторы роста и др.; транслокации и инверсии хромосомного материала, в результате которых могут образовываться химерные гены, имеющие онкогенные функции. Другим результатом структурных перестроек может оказаться ситуация, когда клеточный протоонкоген получает дополнительные активирующие регуляторные элементы и начинает гиперэкспрессироваться. И, наконец, к структурным аномалиям относят различные типы мутаций, которые могут активировать протоонкогены или инактивировать гены-супрессоры (Залетаев Д.В. и соавт., 2009). К функциональным маркерам относят все нарушения, которые не связаны с изменениями структуры ДНК, но приводят к изменениям в уровне экспрессии генов, участвующих в процессах канцерогенеза. Профиль экспрессии генов в опухоли кардинально изменен по сравнению с нормальной тканью, поэтому определенные сочетания генов, теряющих свою экспрессию, или, наоборот, гиперэкспрессирующихся в определенном типе опухоли, могут являться диагностическими и прогностическими маркерами. Изменения в экспрессии гена без изменения его нуклеотидной структуры относятся к эпигенетической регуляции. К таким функциональным нарушениям в первую очередь относят метилирование регуляторных районов генов-супрессоров опухолевого роста, что приводит к их полной инактивации (Залетаев Д.В. и соавт., 2009). Каждая конкретная опухоль уникальна по набору патологических изменений, так же как и геном каждого конкретного пациента. Для каждой опухоли существуют наиболее характерные пути регуляции и молекулярные маркеры, которые специфичны для начала заболевания, его прогрессии и терминальных стадий. Молекулярные маркеры позволяют четко определить стадию злокачественного процесса и проследить молекулярную эволюцию опухолевого процесса. Для опухолей различных тканей и органов такие маркеры могут значительно отличаться. Мониторинг молекулярных маркеров, которые обнаруживаются задолго до клинических проявлений, позволяет вовремя начать более тщательную диагностику и превентивную терапию. Определенные биологические и молекулярно-генетические маркеры или их сочетание позволяют определить начальные стадии, прогноз развития заболевания, подобрать оптимальную тактику лечения и разработать таргетные терапевтические средства. Поэтому важнейшей практической задачей является разработка алгоритма исследования диагностических маркеров социально значимых заболеваний. ^ Поиск и характеристика ключевых молекулярных маркеров сердечно-сосудистых и некоторых онкологических заболеваний с целью разработки лабораторно-диагностических систем для ранней диагностики, прогноза развития и оценки эффективности терапии этих заболеваний. ^
^ Важное значение имеют впервые полученные методом проточной цитофлуориметрии данные о характере изменения уровня экспрессии PAI-1 в моноцитах периферической крови больных ИБС, так как одним из патогенетических факторов ИБС является снижение фибринолитической активности крови. Впервые разработан метод определения молекулярно-генетических маркеров для оценки прогрессии первичной опухоли при светлоклеточном раке почки, а также метод выявления среди пациентов с метастатическим светлоклеточным раком почки лиц, в отношении которых наиболее эффективно назначение таргетных препаратов, действие которых связано с VHL-зависимыми патогенетическими механизмами. Нами предложена молекулярно-генетическая методика выявления среди пациентов с различными заболеваниями предстательной железы лиц с РПЖ, а также прогноза гистологически подтвержденного РПЖ. Методика основана на определении потери гетерозиготности и микросателлитной нестабильности хромосомных районов 13q14 и 16q23 в ткани ПЖ. Впервые продемонстрировано, что при раке предстательной железы наличие химерного онкогена TMPRSS2/ERG4 является частым, опухолеспецифическим событием, коррелирует с более агрессивными стадиями заболевания и может служить молекулярным маркером этого рака, а также маркером андрогенчувствительности опухолевых клеток и оценки ответа опухоли на гормональную терапию. Нами предложен способ определения экспрессии химерного онкогена TMPRSS2/ERG4 методом ОТ-ПЦР с использованием специфических праймеров. Впервые предложены методики определения молекулярных маркеров метилирования при ряде онкологических заболеваний. Нами разработана система ДНК-маркеров (маркеры метилирования генов р16, MLH1 и N33) для ранней диагностики рака шейки матки (РШМ), имеющая высокую чувствительность и специфичность. Полученные результаты позволяют считать, что исследование гиперметилирования генов-супрессоров вместе с цитологическим исследованием и тестированием вируса папилломы человека может служить основой для мониторинга женщин с высоким риском развития рака шейки матки. Разработан метод определения метилирования генов N33 и GSTP1 при аденокарциномах предстательной железы, что может помочь в диагностике данного заболевания. Нами разработан метод выявления специфических молекулярных маркеров при увеальной меланоме, который может использоваться для верификации диагноза «увеальная меланома», а также метод оценки прогрессии первичной опухоли при данном заболевании. Впервые продемонстрирована молекулярно-генетическая внутриопухолевая гетерогенность колоректальных аденокарцином. Работа по определению молекулярно-генетических маркеров перечисленных онкологических заболеваний удостоена премии Правительства РФ 2009 года в области науки и техники для молодых ученых («Разработка и внедрение методов ДНК-диагностики для раннего определения и прогноза некоторых онкологических заболеваний»). ^ Настоящая работа представляет практический интерес для диагностики и оценки прогноза таких социально значимых заболеваний, как ИБС и ряд злокачественных новообразований. Проведенное исследование позволило на основании полученных данных выделить маркер развития острого коронарного синдрома, который можно определить в моноцитах периферической крови, а также биомаркеры, которые можно использовать для дополнительной оценки степени тяжести воспалительного процесса у больных со стабильным течением ИБС. Это позволяет предложить более тщательную программу диагностических мероприятий и своевременно скорректировать проводимую терапию. Исследование аллельных делеций генов-супрессоров опухолевого роста, расположенных в коротком плече хромосомы 3, и метилирование гена CDH1 представляет собой метод оценки прогрессии и способности к метастазированию первичной опухоли при светлоклеточном раке почки. Полученные результаты легли в основу новой медицинской технологии. Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2008/150. Разработанная нами медицинская ДНК-технология позволяет выделять VHL-зависимые и VHL-независимые группы пациентов со светлоклеточным раком почки и, соответственно, оптимизировать тактику и эффективность лечения таргетными препаратами, действие которых связано с VHL-зависимыми патогенетическими механизмами. Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2008/152. Для выявления пациентов с начальными стадиями РПЖ, а также для прогноза гистологически подтвержденного РПЖ в целях подбора наиболее оптимальных вариантов терапии нами разработана медицинская ДНК-технология, направленная на определение делеций хромосомных районов 13q14 и 16q23 в биопсийных образцах больных. Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2008/151. При РПЖ разработанная методика позволяет определять наличие химерного онкогена в ткани опухоли. Поскольку он служит маркером неблагоприятного прогноза и андрогенчувствительности опухоли, появляется возможность оптимизировать тактику и эффективность лечения рака предстательной железы. Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2008/153. Молекулярные маркеры метилирования (при раке шейки матки, раке предстательной железы) позволяют выявить начальные стадии злокачественного процесса еще до того, как обнаруживаются морфологические изменения. Это позволяет начать терапию заболевания на ранних сроках и избежать высокодозной химиотерапии, тяжелой инвалидизации и летального исхода. Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2008/154 (ранняя диагностика рака шейки матки). При увеальной меланоме разработанный метод исследования аллельных делеций в хромосоме 3 позволяет выявлять специфические молекулярные маркеры для верификации диагноза «увеальная меланома» в дополнение к применяемым в настоящее время диагностическим методам. Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2009/319. Описанное в данной работе исследование потери гетерозиготности в хромосомах 3 и 1р36 представляет собой метод оценки прогрессии первичной опухоли при увеальной меланоме. Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2009/318. ^ Автором проведен подбор возможных молекулярных маркеров для диагностики и прогноза исследуемых онкологических заболеваний и ишемической болезни сердца. Автором осуществлены лабораторные исследования с использованием иммуноцитохимического, иммуногистохимического, цитофлуориметрического и иммуноферментного методов определения биомаркеров ишемической болезни сердца. Проведена статистическая обработка всех полученных данных. Автором проанализированы полученные результаты исследования ключевых молекулярных маркеров ишемической болезни сердца и ряда онкологических заболеваний; сформулированы выводы и практические рекомендации. ^ Результаты исследования внедрены в клинико-диагностическую работу в Московском научно-исследовательском онкологическом институте им. П.А. Герцена, Российском научном центре хирургии им. акад. Б.В. Петровского РАМН. Полученные практические и теоретические выводы применяются в учебном процессе кафедры биохимии Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М.Сеченова, кафедры биохимии МГУ им. М.В. Ломоносова, кафедры клинической лабораторной диагностики Российской медицинской академии последипломного образования. ^ Апробация диссертации проведена 18 ноября 2010 г. на совместном заседании кафедры клинической лабораторной диагностики, кафедры биохимии ГОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава, кафедры биохимии, лаборатории молекулярной генетики человека НИИ молекулярной медицины ГОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития РФ, лаборатории эпигенетики ГУ Медико-генетический научный центр РАМН (протокол № 19). Материалы диссертации доложены на 20-м Европейском Конгрессе Патологии (Париж, Франция, 2005 г.), Российском медицинском форуме (Москва, 2007), Конференции для молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике (Киев, Украина, 2007), на съездах Европейского общества генетиков человека ESHG (Ницца, Франция, 2007 г. и Барселона, Испания, 2008 г.), 7-м Международном симпозиуме по множественным факторам риска сердечно-сосудистых заболеваний (Венеция, Италия, 2008 г.), 6-м Конгрессе по метаболическому синдрому, диабету II типа и атеросклерозу (Берлин, Германия, 2009 г.), 6-й международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009). Публикации По теме диссертационной работы опубликовано 25 печатных работ. Из них - 12 статей и 11 тезисов, глава в книге «Системы генетических и эпигенетических маркеров в диагностике онкологических заболеваний», глава в книге «Введение в молекулярную диагностику». Получено 7 разрешений на применение новых медицинских технологий (ФС №2008/150, ФС №2008/152, ФС №2008/151, ФС №2008/153, ФС №2008/154, ФС №2009/319, ФС №2009/318). Работа «Разработка и внедрение методов ДНК-диагностики для раннего определения и прогноза некоторых онкологических заболеваний» отмечена премией Правительства РФ 2009 года в области науки и техники для молодых ученых (распоряжение Правительства Российской Федерации от 1 марта 2010 года № 248-р г.Москва). ^ Диссертация изложена на 235 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 2 глав результатов собственных исследований и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы. Текст иллюстрирован 24 таблицами и 34 рисунками. Указатель литературы содержит 289 источников, из них 26 - отечественных. ^
^ Биомаркеры в диагностике и определении прогноза ишемической болезни сердца. Было обследовано 162 пациента с ИБС в возрасте от 38 до 87 лет (62.5 ± 34.6 лет), находившихся на стационарном лечении в Клинике кардиологии Первого МГМУ им. И.М.Сеченова с апреля 2006 г. по апрель 2008 г. С учетом цели и задач исследования пациенты были разделены на три основные группы. Группы сравнения составили 31 больной с ОКС (из которых 8 – с инфарктом миокарда (ИМ), остальные больные – с нестабильной стенокардией) и 131 больной со стабильным течением ИБС. Во второй группе (больных со стабильным течением ИБС) были объединены пациенты со стабильной стенокардией. В зависимости от наличия или отсутствия сахарного диабета II типа и ожирения группы сравнения были поделены на две подгруппы. В третью (контрольную) группу включили 20 пациентов, которые в целом не отличались по возрасту от больных и у которых диагноз ИБС был отвергнут на основании данных стационарного обследования. Критериями исключения из исследования были злокачественные новообразования, воспалительные заболевания в стадии обострения, признаки острого или обострения хронического инфекционного заболевания. Клиническое исследование включало изучение анамнеза и данных объективного исследования с использованием лабораторно-инструментальных методов. Все пациенты проходили обследование по схеме поэтапного ведения пациентов с возможной ишемической болезнью сердца, включающей в себя: общий анализ крови и мочи, биохимический анализ крови, анализ липидного спектра, анализ активности кардиоспецифических ферментов, а также электрокардиографию покоя, эхокардиографическое исследование, суточное мониторирование ЭКГ по Холтеру, нагрузочный тест (тредмил тест или велоэргометрия), сцинтиграфию миокарда (по показаниям), дуплексное сканирование артерий, коронароангиографию (по показаниям). Диагноз острого ИМ и нестабильной стенокардии ставили на основании жалоб пациента, данных клинического обследования, характерных изменений на ЭКГ, ЭхоКГ, определения уровня маркеров некроза миокарда в крови. У всех обследуемых пациентов однократно при госпитализации производили взятие венозной крови в рамках стандартного исследования крови при поступлении в стационар. Общее содержание глюкозы, холестерина и триглицеридов в плазме крови определяли ферментативными методами. Помимо общеклинических исследований, у каждого пациента получали фракцию мононуклеарных лейкоцитов периферической крови (МЛПК), а также определяли уровень биологических маркеров (С-реактивного белка и адипонектина) в сыворотке крови иммуноферментным методом (ИФА). Получение моноцитов из венозной крови. Фракцию МЛПК получали с помощью градиентного центрифугирования цельной крови в растворе фиколл-пак (Pharmacia). Далее клетки фиксировали 4% параформальдегидом (ПФ) и исследовали уровень экспрессии ингибитора активатора плазминогена 1 типа и активатора плазминогена урокиназного типа в моноцитах с помощью метода проточной цитофлуориметрии. Для исследования содержания белков PAI-1 и uPA в моноцитах методом иммуноцитохимии, полученную фракцию МЛПК культивировали в течение суток, затем отделяли от поверхности чашек Петри с помощью раствора Версена (раствор натриевой соли этилендиаминотетрауксусной кислоты) и проводили иммуноцитохимическое окрашивание. Исследование экспрессии PAI-1 и uPA в моноцитах человека с помощью иммуноцитохимического метода. Иммуноцитохимическое окрашивание проводили с использованием моноклональных антител мыши к белку PAI-1 (Santa Cruz Biotechnology, клон С-9) и поликлональных антител кролика к белку uPA (Santa Cruz Biotechnology, клон H-140) в разведении 1:50. Затем клетки инкубировали с FITC-конъюгированными вторичными антителами. Препараты исследовали с помощью флуоресцентной микроскопии. Стекла с контрольными клетками окрашивали с использованием системы визуализации Super Sensitive Polymer-HRP IHC Detection Sysytem/DAB (BioGenex). В качестве первичных антител использовали моноклональные мышиные антитела к CD68 (DAKO Cytomation, клон PG-M1, разведение 1:700). Исследование экспрессии PAI-1 и uPA в моноцитах человека с помощью метода проточной цитофлуориметрии. Окрашивание проводили с использованием первичных моноклональных антител мыши к белку PAI-1 и поликлональных антител кролика к uPA в разведении 1:20. Затем добавляли к суспензии клеток FITC-конъюгат козьих антител к IgG мыши и FITC-конъюгат антител козы к IgG кролика (Santa Cruz Biotechnology) в разведении 1:500; инкубировали с моноклональными антителами мыши к CD14, меченными фикоэритрином (CD14-РЕ) ("Сорбент"). Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточного цитофлуориметра EPICS-XL (Вeckman Coulter). Исследование экспрессии PAI-1 и uPA в атеросклеротических бляшках (АСБ) коронарных артерий с помощью иммуногистохимического метода и в моноцитах крови с помощью метода проточной цитофлуориметрии. Было обследовано 7 пациентов с ИБС в возрасте от 47 до 72 лет, находившихся на стационарном лечении в отделении кардиохирургии Клиники сердечно-сосудистой и общей хирургии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова с марта 2009 г. по май 2010 г. Группы сравнения составили 4 пациента со стабильным течением ИБС (стенокардия напряжения) и 3 пациента с ОКС (2 из них – с острым ИМ, 1 – с нестабильной стенокардией). У всех пациентов, за исключением одного из группы ОКС+, отмечался в анамнезе ИМ. Взятие венозной крови производился перед операцией в стандартных условиях утром через 12-14 часов после приёма пищи. Выделение моноцитов и исследование экспрессии PAI-1 и uPA проводили с помощью метода проточной цитофлуориметрии по описанной выше методике. Фрагменты коронарных артерий, полученных во время операции маммарокоронарного шунтирования/аортокоронарного шунтирования, фиксировали в 10% забуференном формалине в течение суток. В качестве контроля взяли фрагмент лучевой артерии одного из пациентов, полученный также во время операции. ^ проводили на срезах толщиной 3-4 мкм, окрашенных гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием системы визуализации Super Sensitive Polymer-HRP IHC Detection Sysytem/DAB (BioGenex) в соответствии с прилагаемой инструкцией. В качестве первичных антител использовали кроличьи поликлональные антитела к урокиназе (abcam, разведение 1:50) и мышиные моноклональные антитела к PAI-1 (Santa Cruz, клон TJA6, разведение 1:50). Определение биохимических маркеров атерогенеза в сыворотке крови методом ИФА. В работе для сэндвич-ИФА использовали наборы «ИФА СРБ» и «ИФА Адипонектин» на основе антител, полученных в совместных исследованиях Московским НИИ Медицинской Экологии, МГУ им. М.В. Ломоносова и лабораторией электронной микроскопии и иммуногистохимии Централизованного патологоанатомического отделения Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова. Статистическая обработка данных. Статистическая обработка результатов проводилась с помощью компьютерной обработки данных в программах STATISTICA 6.0 и SPSS statistics 17.0. Статистические различия выборок оценивали по критерию Манна-Уитни (Mann-Whitney U-test). ROC-анализ проводили с помощью программы "SPSS statistics 17.0". Получали графические изображения характеристических кривых (ROC-curves, Receiver-Operator Characteristic curve) и площадь под кривой - AUC (Area Under Curve). Качество модели (диагностическая эффективность показателя) оценивалась по общепринятой экспертной шкале для значений AUC. ^ Клинический материал. С целью оценки прогрессии первичной опухоли при светлоклеточном раке почки исследованы аллельные делеции генов VHL, RASSF1, FHIT и CDH1 на материале 94 парных образцов (опухоль-норма) светлоклеточного рака почки, полученных от пациентов, проходивших лечение в Клинике урологии им. Р.М. Фронштейна Первого МГМУ им. И.М.Сеченова; а также аномальное метилирование генов-супрессоров на материале 98 парных образцов светлоклеточных карцином и 29 парафиновых блоков СРП, полученных от пациентов, проходивших лечение в той же клинике. Для разработки молекулярно-генетической методики определения эффективности таргетной терапии при светлоклеточном раке почки использовали материал 123 удаленных первичных опухолей, полученных от пациентов, проходивших лечение в той же клинике. Для анализа полиморфных вариантов генов ABCB1, TGFBR1, IL10 и VDR в норме и при спорадическом раке почки исследовано 98 парных образцов рака почки (РП) (опухоль-норма), предоставленных Медицинским радиологическим научным центром РАМН и Клиникой урологии им. Р.М. Фронштейна Первого МГМУ им. И.М.Сеченова. В качестве популяционного контроля использовали 151 образец крови здоровых доноров, предоставленный донорским пунктом Первого МГМУ им. И.М.Сеченова. Для определения потери гетерозиготности и микросателлитной нестабильности хромосомных районов 13q14 и 16q23 у пациентов с подозрением на рак предстательной железы исследован 51 микродиссекционный образец больных с аденокарциномой предстательной железы (АКПЖ), 25 – с простатической интраэпителиальной неоплазией (ПИН), и 24 – с доброкачественной гиперплазией предстательной железы (ДГПЖ). Для исследования экспрессии химерного гена TMPRSS2/EGR4 при раке предстательной железы образцы ткани предстательной железы (ПЖ) были получены от 63 пациентов с диагнозом «рак предстательной железы», подвергшихся радикальной простатэктомии. Также 10 образцов ПЖ были получены от пациентов с диагнозом «ДГПЖ». Образцы ткани предстательной железы для определения маркеров метилирования представляли собой операционный материал больных с аденокарциномой, ПИН и ДГПЖ, а также был получен аутопсийный материал нормальной ПЖ. Все пациенты проходили лечение в отделении онкоурологии Московского научно-исследовательского онкологического центра им. П.А. Герцена. Для определения аномального метилирования генов при раке шейки матки были исследованы образцы дисплазий шейки матки (97 образцов), морфологически неизмененных тканей, прилегающих к дисплазии (51 образец), и образцы крови больных. Цервикальные мазки здоровых женщин (35 образцов) и женщин с фоновыми заболеваниями, которые представлены эрозией шейки матки и цервикальной эктопией с выраженным воспалительным процессом (93 образца), были взяты в женской консультации. С целью выявления специфических молекулярных маркеров и оценки прогрессии первичной опухоли при увеальной меланоме были исследованы 107 парных образцов (норма-опухоль), полученных при операции энуклеации, и 17 образцов биоптатов, взятых методом тонкоигольной аспирационной биопсии (ТИАБ), с соответствующими образцами периферической крови. Образцы получены от пациентов, проходивших обследование и лечение в Московском НИИ глазных болезней им. Гельмгольца. Для молекулярно-генетического анализа клональной внутриопухолевой гетерогенности в колоректальных карциномах образцы опухолей получены от 11 пациентов отделения колопроктологии Научного центра хирургии им. Б.В. Петровского РАМН. Все пациенты с первичными опухолями толстой кишки, представленными аденокарциномами без гематогенных метастазов, не получавших ранее химиотерапевтического и лучевого лечения, без других онкологических заболеваний в анамнезе. Все опухоли после морфологического исследования классифицированы по TNM в зависимости от глубины инвазии опухоли и наличия пораженных лимфатических узлов. Также для генетического анализа дополнительно брали венозную кровь больных. Методы выделения ДНК и РНК. Выделение ДНК из парафиновых блоков проводили с гистологических срезов, полученных с помощью микротома. Проводили их депарафинизацию, опухолевые клетки и строму инкубировали с экстракционным буфером. Полученный лизат клеток, содержащий геномную ДНК, использовали для постановки ПЦР. Данную методику использовали для оценки прогрессии первичной опухоли и разработки молекулярно-генетической методики определения эффективности таргетной терапии при СРП, а также исследования клональной внутриопухолевой гетерогенности колоректальных карцином. Выделение ДНК из свежего операционного и биопсийного материала, а также МЛПК проводили при исследовании спорадического рака почки, увеальной меланомы, РШМ (только биоптаты и соскобы). Геномную ДНК из МЛПК и замороженных тканей выделяли методом обработки образцов протеиназой К с последующей фенол-хлороформной экстракцией. Лазерную микродиссекцию проводили на ткани рака предстательной железы для определения потери гетерозиготности и микросателлитной нестабильности хромосомных районов 13q14 и 16q23, а также определения маркеров метилирования, с помощью системы лазерной микродиссекции ASLMD (Leica microsystems, Германия). Клетки, полученные с помощью микродиссекции, обрабатывали буфером, содержащим протеиназу К. Полученный после инкубации раствор использовали для ПЦР. Выделение РНК из операционного материала выполняли на ткани рака предстательной железы для исследования экспрессии химерного гена TMPRSS2/EGR4. Выделение РНК проводили методом кислофенольной экстракции с использованием набора “РИБО-золь-А” (фирма АмплиСенс, Россия) по протоколу фирмы-производителя. Потерю гетерозиготности в опухолевом материале определяли методом микросателлитного анализа. При исследовании ПГ в образцах СРП использовали по два динуклеотидных микросателлита на каждый из анализируемых генов: делеции VHL выявляли с помощью STR-маркеров D3S1317 и D3S1038, RASSF1 – D3S1568 и D3S966, FHIT – D3S1300 и D3S1234. При исследовании РПЖ для идентификации ПГ и МН в хромосомных районах 13q14 и 16q23 использовали 3 высокополиморфных маркера: RB20int (внутригенный маркер RB1), D16S534, D16S422. Для выявления специфических молекулярных маркеров и оценки прогрессии первичной опухоли при увеальной меланоме проводили ПЦР микросателлитных маркеров D1S3669, D1S407, D1S1635, D1S2145, D1S243, D3S2398, D3S3520, 16xTG_3q26.31, D3S2459, D3S1234, D3S1300, D3S966, D3S1568, D3S1317, D3S1038. При исследовании колоректального рака определяли ПГ локусов 9p21 (D9S942), 13p14 (RB1int20), 10q23 (D10S1761) и 17p13 (PT53). Методы анализа мутаций. Для оценки эффективности таргетной терапии при СРП анализ мутаций в кодирующей части гена VHL проводили с помощью SSCP-анализа (анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК) ПЦР-продуктов и секвенирования. Мутации гена K-RAS при исследовании колоректального рака определяли аналогично. Секвенирование ПЦР-продуктов проводили с использованием набора BigDye® Terminator v 3.1. Cycle Sequencing Kit фирмы “Applied Biosystems”. с последующим анализом на генетическом анализаторе ABI PRISM 3100 по протоколам фирмы “Applied Biosystems”, США. Исследование полиморфных вариантов генов. Мультилокусную ПЦР полиморфизмов генов ABCB1, TGFBR1, IL10 и VDR при спорадическом РП проводили с использованием праймеров, фланкирующих исследуемые однонуклеотидные полиморфизмы (SNP - single nucleotide polymorphism) в каждом из генов. Определение SNP проводили методом мини-секвенирования. Методы анализа химерных генов. Для исследования экспрессии химерного гена TMPRSS2/EGR4 при РПЖ образцы РНК, растворенные в РНК-элюэнте (АмплиСенс, Россия), обрабатывали ДНКазой. Обратную транскрипцию РНК проводили методом случайного праймирования с использованием High-Capacity cDNA Archive kit (Applied Biosystems, США) по протоколу фирмы-производителя в термоциклере GeneAmp2700. Затем проводили ПЦР и прямое секвенирование для определения химерных генов. Методы анализа метилирования. При СРП для анализа метилирования промоторов генов CDH1 и VHL проводили обработку геномной ДНК метилчувствительной рестриктазой BstHHI («СибЭнзим», Новосибирск), которая служила матрицей для метилчувствительной ПЦР (МЧ-ПЦР). При РШМ для анализа метилирования промоторных областей генов Р16, MLH1 и N33 проводили обработку геномной ДНК метилчувствительной рестриктазой HpaII. Метилирование генов определяли с помощью МЧ-ПЦР. Электрофорез ПЦР-продуктов в 8%-ном полиакриламидном геле (ПААГ). Разделение ПЦР-продуктов по молекулярному весу при анализе метилирования проводили с помощью вертикального электрофореза в 8%-ном ПААГ. ПГ определяли с помощью электрофореза в 10%-ом денатурирующем ПААГ. Визуальный контроль миграции ПЦР-продуктов осуществляли относительно положения красителей бромфенолового синего и ксиленцианола. Затем проводили окрашивание ПААГ нитратом серебра. Статистическая обработка данных. Статистическую обработку данных проводили при помощи программы Graph Pad Instant 3.05. Уровень значимости α был принят равным 0,05. Многофакторный регрессионный анализ проводили с помощью программы Statistica v. 6.0. Для анализа клинических ассоциаций химерного гена с прогрессией РПЖ были выбраны следующие критерии: степень дифференцировки опухоли по классификации Глисона, стадия процесса и наличие гормонального лечения перед простатэктомией. Пациентов делили на три группы по выбранному критерию и сравнивали в этих группах частоты химерного гена с помощью критерия Фишера. Для изучения возможной связи между метилированием каждого из исследуемых генов и гистологическим критерием (степень диспластического процесса шейки матки; РПЖ, простатическая интраэпителиальная неоплазия или ДГПЖ) использовали сравнение групп с помощью критерия χ2. Чувствительность маркера рассчитывали как отношение истинно положительных результатов к сумме истинно положительных и ложноотрицательных результатов. Специфичность маркера рассчитывали по формуле: отношение истинно отрицательных результатов к сумме ложноположительных и истинно отрицательных результатов. ^ БИОМАРКЕРЫ В ДИАГНОСТИКЕ И ПРОГНОЗИРОВАНИИ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА. Сравнительная характеристика больных ИБС с ОКС и без ОКС по основным метаболическим параметрам. В группах больных ИБС с ОКС (n=31) и без ОКС (n=131) было проведено сопоставление основных метаболических параметров (табл. 1). Таблица 1. Характеристика и основные метаболические параметры больных ИБС.
|
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям