Міністерство охорони здоров’я україни національний фармацевтичний університет грінцова ольга євгенівна
|
|
Скачать 346.77 Kb.
|
|
МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ГРІНЦОВА ОЛЬГА ЄВГЕНІВНАУДК 547.455.623'233.1:616.831–005 ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ВИВЧЕННЯЦЕРЕБРОПРОТЕКТОРНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ ГЛЮКОЗАМІНУ ТА ЙОГО ПОХІДНИХ14.03.05 – фармакологія Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук Харків – 2011 Робота виконана на кафедрі клінічної фармакології з фармацевтичною опікою Національного фармацевтичного університету МОЗ України, м. Харків Науковий консультант: доктор медичних наук, заслужений діяч науки і техніки України, професор ^ Національний фармацевтичний університет, завідувач кафедри клінічної фармакології з фармацевтичною опікою ^ доктор медичних наук, професор ШТРИГОЛЬ Сергій Юрійович, ІПКСФ Національного фармацевтичного університету, МОЗ України, кафедра технології ліків та клінічної фармакології з фармацевтичною опікою доктор біологічних наук, професор ^ Запорізький державний медичний університет, МОЗ України, завідувач кафедри фармакології з медичною рецептурою Захист відбудеться « » 2011 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.64.605.03 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська,53. З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4) Автореферат розісланий « » 2011 р. Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор фармацевтичних наук, доцент Т.С. Сахарова ^ Актуальність теми. Незважаючи на значний прогрес у сучасній медицині, гострі цереброваскулярні розлади, в першу чергу інсульт головного мозку, залишаються глобальною медико-соціальною проблемою, зумовлюючи високий рівень смертності та інвалідизації. Згідно даним ВООЗ, цереброваскулярна патологія посідає друге місце серед неінфекційних причин смерті у світі (Brown D. L., 2007; Mathers C. D. et al., 2008). Окрім смертності, інсульт є причиною помірної та стійкої втрати працездатності, залишаючи значну кількість пацієнтів інвалідами, що потребують допомоги навіть для виконання повсякденних завдань (Tuelsen T. et al., 2001; Gijsen R. et al., 2001). В Україні мозковий інсульт посідає друге місце у структурі смертності. Захворюваність у 2006 р. становила 281,2 випадки на 100000 населення на рік (Міщенко Т. С., 2009), що майже вдвічі перевищує цей показник у розвинених країнах західної Європи та світу (Бурчинський С. Г., 2009). Померло від інсульту в Україні у 2008 році 42 тисячі осіб (Черенько Т. М., 2009). У загальній структурі гострих порушень мозкового кровообігу (ГПМК) у світі на долю ішемічних припадає більше 80% (Ito H. et al., 2008; AHA, 2009). Церебральна ішемія є метаболічним етапом процесу ішемічного інсульту, в основі якого полягають універсальні реакції тканини мозку на пошкоджуючий вплив зовнішніх факторів (Скворцова В. И., 2006). Основними патобіохічічними ланками пошкодження клітин головного мозку при ішемії, згідно сучасних уявлень, є порушення вуглеводно-енергетичного обміну, розвиток лактацидозу та активація вільнорадикального окиснення (ВРО). Неконтрольоване утворення активних форм кисню призводить до перекисного окиснення ліпідів, окисної модифікації білків та змін у циклі окису азоту. Наслідки гострої фокальної ішемії, ступінь її пошкоджувальної дії залежать від тяжкості та тривалості зниження мозкового кровотоку та активності антиоксидантної системи організму (Coleman E. A. et al., 2004). За умов церебральної ішемії важливим фактором ушкодження клітин пенумбри є апоптотична загибель нейроцитів та активація мікроглії. За даними літератури ( Владимирская Е. Б., 2002; Broughton B. R. et al., 2009), більшість апоптотичних клітин локалізуються вздовж внутрішньої межі ішемічного ядра, що віддзеркалює участь апоптозу в розширенні зони інфаркту. Cучасна патогенетична терапія інсультів передбачає застосування нейропротекторних засобів для переривання механізмів апоптозу в зоні пенумбри (Беленичев И. Ф. и др., 2009). До основних напрямків нейропротекції відносять застосування антиоксидантів, метаботропних препаратів, ноотропів, антагоністів кальцію та засобів, що впливають на ГАМК-ергічну систему, а також засобів, що покращують мозковий кровообіг (Суслина З. А., 2000; Cottrell J. E., 2005; Зозуля І. С., 2006). Проте можливості ефективної терапії інсультів все ще обмежені. Як зазначають сучасні вчені, існує необхідність пошуку нових ефективних засобів вторинної нейропротекції (Sincich L. C. et al., 2003; Черній В. І. та ін., 2007; Бєленічев І. Ф. та ін., 2009; Sanchez J. C. et al., 2010). Перспективним є пошук засобів з церебропротекторною активністю серед похідних глюкозаміну. Глюкозамін є одним з найважливіших структурних компонентів організму людини, при багатьох захворюваннях змінюється його вміст у тканинах та метаболізм ( Зупанець І. А та ін., 2005; Vitterlinden E. J., 2008; Зупанець К. О., 2010). Похідні глюкозаміну мають різнопланові фармакологічні властивості, серед яких окремо виділяють мембраностабілізувальні, протизапальні та антиоксидантні (Туляков В. О. та ін., 2009). Похідні глюкозаміну швидко метаболізуються в організмі (Setnikar I., 1993), мають високу біодоступність, а безпечність глюкозаміну підтверджується даними численних клінічних досліджень (Hughes R., 2000; McAlingdon T. et al., 2003; Towheed T. E. et al., 2005). У зв’язку з вищезазначеним, актуальним вважається дослідження церебропротекторних властивостей глюкозаміну та його похідних, а також можливостей застосування цих засобів у терапії цереброваскулярної патології. ^ Дисертація виконана в рамках науково-дослідної програми Національного фармацевтичного університету «Фармакологічні дослідження біологічно-активних речовин і лікарських засобів синтетичного та природного походження, їх застосування в медичній практиці» (№ державної реєстрації 0103U000478). ^ Експериментальнє обгрунтування доцільності застосування похідних глюкозаміну як церебропротекторних засобів для підвищення ефективності терапії хворих із цереброваскулярною патологією. Для досягнення поставленої мети вирішувались наступні задачі:
^ Ішемічні порушення при цереброваскулярной патології. Предмет дослідження. Церебропротекторні властивості похідних глюкозаміну. ^ При виконанні дисертаційної роботи були використані фармакологічні, біохімічні, морфологічні та статистичні методи. Наукова новизна одержаних результатів. Вперше експериментально вивчено та визначено церебропротекторну дію похідних глюкозаміну (патент України № 56015 від 27.12.2010 р. «Застосування похідних глюкозаміну як церебропротекторного засобу»). Встановлено антигіпоксичну активність похідних глюкозаміну – глюкозаміну гідрохлориду та глюкозаміну сульфату на експериментальних моделях гіпобаричної, гемічної гіпоксії та гіперволемічного набряку мозку в тварин, визначена роль ендогенного N-ацетилглюкозаміну у розвитку гіпоксичного ураження головного мозку. Вперше встановлено наявність антиамнестичної активності глюкозаміну гідрохлориду та визначено умовно ефективну дозу – 50 мг/кг. Вперше експериментально досліджено вплив глюкозаміну гідрохлориду на перебіг гострого порушення мозкового кровообігу в гострому та відновлювальному періодах. Визначено позитивний вплив глюкозаміну гідрохлориду на виживаність та ступінь розвитку неврологічного дефіциту при гострому порушенні мозкового кровообігу. Вперше доведено властивості глюкозаміну гідрохлориду гальмувати розвиток реакцій ВРО, а також стимулювати ферменти власної антиоксидантної системи організму за умов церебральної ішемії. Вперше встановлено захисну дію глюкозаміну гідрохлориду на морфологічну структуру головного мозку при гострому порушенні мозкового кровообігу та властивість попереджати явища апоптозу in vitro та in vivo. ^ Результати дисертаційної роботи є фрагментом доклінічного вивчення церебропротекторних властивостей глюкозаміну гідрохлориду та можуть бути використані для подальшого створення засобів з церебропротекторною активністю та розробки схем комбінованої метаболічної терапії на основі глюкозаміну гідрохлориду. Основні результати досліджень впроваджено у практичну діяльність фахівців з експериментальної та клінічної фармакології у вигляді інформаційного листа «Церебропротекторна активність глюкозаміну гідрохлориду (доклінічні дослідження)» (2010 р.). Результати роботи впроваджені в навчальний процес у Національному фармацевтичному університеті (м. Харків), ВДНЗУ «Українська медична стоматологічна академія (м. Полтава), Дніпропетровській медичній академії, Донецькому національному медичному університеті ім. М. Горького, Івано-Франківському державному медичному університеті. ^ Роботу виконано на базі кафедри клінічної фармакології з фармацевтичною опікою НФаУ. Разом з науковим керівником визначено мету та завдання дослідження, розроблено методичні підходи, згідно яким відібрано моделі та методи для виконання експериментальної частини дисертації. Особисто проведено: патентно-інформаційний пошук, експериментальні дослідження, статистична обробка, аналіз та систематизація отриманих результатів, сформульовані висновки дисертації. У наукових працях, опублікованих у співавторстві, дисертантом наведено результати власних експериментальних досліджень, прийнято участь в аналізі та узагальненні отриманих даних, у написанні статей. Морфологічні дослідження зразків тканини мозку експериментальних тварин проведено на базі ЦНДЛ Запорізького державного медичного університету. ^ Основні положення дисертаційної роботи викладені та обговорені на VΙ Всеукраїнській науково-практичній конференції „Клінічна фармація в Україні” (м. Харків, 2007); науково-практичній конференції “Актуальні питання фармакології” (м. Вінниця, 2007); Всеукраїнській науково-практичної конференції студентів та молодих вчених «Клінічна фармація в Україні» (м. Харків, 2007); VII Всеукраїнському конгресі “Сьогодення та майбутнє фармації” (м. Харків, 2008); VΙΙΙ Всеукраїнській науково-практичній конференції «Клінічна фармація в Україні» (м. Харків, 2008); Всеукраїнській науково-практичній конференції студентів та молодих вчених „Актуальні питання створення нових лікарських засобів” (м. Харків, 2009); XXVII Науково-практичної конференції «Ліки – людині» (м. Харків, 2010), Міжнародній науковій конференції студентів «Перший крок у науку – 2010» (м. Вінниця, 2010); XIV Міжнародному науковому конгресі студентів та молодих вчених (м. Тернопіль, 2010); Всеукраїнській науково-практичній конференції студентів та молодих вчених „Актуальні питання створення нових лікарських засобів” (м. Харків, 2010), VI Всеукраїнській науково-практичній конференції «Клінічна та експериментальна фармакологія метаболічних коректорів, органопротекція, доказова медицина» (м. Вінниця, 2010). Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 16 наукових робіт, 5 статей (з них 4 – у спеціалізованих наукових фахових журналах, рекомендованих ВАК України, в тому числі 1 − моноосібна) та 9 тез у матеріалах з'їздів, конгресів, науково-практичних конференцій та симпозіумів, патент України, інформаційний лист. ^ Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, 4-х розділів власних експериментальних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел. Загальний обсяг дисертації складає 190 сторінок друкованого тексту. Робота ілюстрована 25 таблицями та 24 рисунками. Перелік використаних джерел містить 249 найменувань, з яких 114 – кириличною, а 135 – латинською графікою. ^ Матеріали та методи досліджень. В експерименті всього використано 296 щурів та 50 мишів, отриманих із розплідників ЦНДЛ НФаУ та ІФТ АМН України. Усі експериментальні процедури та оперативні втручання проводили відповідно до "Положення про використання тварин у біомедичних дослідженнях". Усі тварини утримувались на стандартному раціоні харчування віварію, у відповідності до санітарно-гігієнічних норм (Кожем'якін Ю. М та ін., 2002). Об'єктами дослідження були обрані похідні глюкозаміну: глюкозаміну гідрохлорид (ГА г/х), глюкозаміну сульфат (ГА сульфат). Основні етапи досліджень наведено на схемі. Етапи фармакологічних досліджень  На першому етапі проведено фармакологічний скринінг антигіпоксичної активності похідних глюкозаміну на декількох моделях. Гіпобаричну гіпоксію в мишей моделювали вакум-аспірацією повітря до рівня, який відповідає підйому на висоту 11 000 м зі швидкістю 30 м/с (Метод. рекоменд., 1990). Дослідження проводили у порівнянні з пірацетамом (200 мг/кг). Гемічну гіпоксію відтворювали шляхом внутрішньоочеревинним введенням 1,5% водного розчину натрію нітриту в летальній дозі (LD100 ) 300 мг/кг (Стефанов А. В. и др., 2002). Дослідження проводили у порівнянні з пірацетамом (200 мг/кг). Гіперволемічний набряк головного мозку моделювали шляхом введення тваринам дистильованої води внутрішньочеревинно в об’ємі, рівному 20% від маси тіла (Квитницкий-Рыжов Ю. Н., 1988). Препаратом порівняння був обраний диклофенак натрію (у дозі 8 мг/кг). На етапі II оцінювали антиамнестичну активність ГА г/х та проводили пошук умовно ефективних доз. Для цього виробляли у тварин умовний рефлекс пасивного уникнення (УРПУ) (Буреш Я. и др., 1991), вводили ГА г/х (у дозах 50 мг/кг, 100 мг/кг та 200 мг/кг). Антероградну амнезію моделювали шляхом введення атропіну в дозі 40 мг/кг внутрішньочеревинно та через 24 години відтворювали УРПУ. На етапі III у двох серіях щурів моделювали гостре порушення мозкового кровообігу шляхом білатеральної оклюзії загальних сонних артерій під тіопентал-натрієвим наркозом (40 мг/кг) (Гацура В. В., 1974). Тварин 1-ї серії виводили з експерименту на 4 добу після ГПМК, а тварин 2-ї серії − на 18 добу. Дослідження проводили у порівнянні з мексидолом (100 мг/кг). Протягом експериментальних досліджень використовували наступні методи визначення біохімічних та морфологічних показників тканини головного мозку щурів. Вміст N-ацетилглюкозаміну (N-ацГА) у печінці та головному мозку визначали за модифікованим методом Ельсона-Моргана (Зупанець І. А. та ін., 2005). Вираженість неврологічного дефіциту оцінювали за шкалою stroke-index McGrow (McGrow C. P., 1977). Рухову активність визначали за тестом «відкрите поле» (Стефанов А. В. и др., 2002). Для біохімічних досліджень використовували лобні долі кори головного мозку експериментальних тварин. Екстракцію ліпідів проводили за методом Кейтса (1974). Стан вуглеводно-енергетичного обміну та окиснення у циклі Кребса у головному мозку оцінювали за рівнем аденілових нуклеотидів (АТФ, АДФ, АМФ), які визначали методом тонкошарової хроматографії ( Захарова Н. Б., 1980). Додатково розраховували показники стану енергетичного обміну у клітинах головного мозку (Лук’янчук В. Д. та ін., 2000). Концентрацію пірувату та лактату визначали за методом Цока-Лампрехта, малату – за методикою Хохорста (Коган В. С. и др., 1988). Концентрацію церебрального ізоензиму ВВ-КФК (мМ/л/год) у сироватці крові визначали за оптичним тестом Варбурга (Allan S. M., 2000). Для оцінки інтенсивності ВРО у тканинах головного мозку визначали ступінь окисної модифікації білків (ОМБ) – альдегідфенілгідразони та кетонфенілгідразони (АФГ, КФГ) за методом Halliwell B (Камышников В. С., 2003). Пероксидне окиснення ліпідів оцінювали за рівнем початкових та кінцевих продуктів цього процесу − ТБК-реактантів, диєнові кон`югати (ДК) та трієнові кон`югати (ТК), вміст яких визначали спектрофотометрично (Коган В. С. и др., 1988). Стан циклу оксиду азоту в головному мозку оцінювали за концентрацією його стабільних метаболітів NO2-, які визначали за якісною реакцію з реактивом Гріса. Активність NO-синтази визначали флюориметрично, а L-аргініну за загальноприйнятою методикою (Горбунов Н. В., 1995). Стан антиоксидантної системи тканини головного мозку оцінювали за активністю супероксиддисмутази (СОД) (Чеварі С. та ін. 1988) та каталази, яку визначали спектрофотометрично після реакції з молібдатом амонію (Королюк М. А., 1989). Для морфологічних досліджень мозок тварин фіксували 24 години у фіксаторі Карнуа та за стандартною схемою заливали у парафінові блоки, з яких готували серійні фронтальні 5-мікронні гістологічні зрізи в області постцентральної звивини (сомато-сенсорної кори). Для вивчення морфо-функціонального стану нейронів IV-V шарів кори зрізи депарафінували за стандартною методикою, фарбували галоціан-хромовими галунами за Ейнарсоном для специфічного виявлення РНК (Прохорова М. И., 1982). Зображення кори отримували на мікроскопі Axioskop (Zeiss, Німеччина) та з допомогою 8-бітної CCD-камери COHU-4922 (COHU Inc., США) вводили у комп’ютерну систему аналізу зображень VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Німеччина). Морфометричний аналіз клітин мозку проводили автоматично (Kolesnik Y. M. et al., 2002). Визначали наступні показники: щільність, площа тіл нейронів та гліальних клітин (кількість клітин на 1мм2) та вміст в них РНК (одиниці оптичної щільності, ЕОП), щільність апоптотичних та деструктивно змінених нейронів (кількість клітин на 1мм2), та їх доля (у %). Для дослідження антиапоптичної активності ГА г/х in vitro використовували збагачені фракції нейронів, та агенти, що ініціюють апоптоз (TNF 0,001 мкг/3 мл суспензії). Суспензію нейронів фарбували флуоресцентним барвником Hoechst 33342 (1% на фосфатному буфері рН 7,4+ акрихін оранжевий 0,5%) (Чекман И. С. и др., 2010) та з допомогою флюоресцентоного мікроскопу Axioskop (Zeiss, Німеччина) підраховували кількість апоптотичних клітин. Статистичну обробку даних проводили за допомогою комп’ютерних програм з використанням критеріїв Фішера-Ст'юденту та непараметричних методів аналізу (Лапач С. Н. и др., 2001; Герасимов А. Н., 2007). ^ Дослідження антигіпоксичної активності похідних глюкозаміну на моделі гіпобаричної гіпоксії показало, що їх застосування достовірно збільшувало тривалість життя тварин порівняно до контролю – у групі ГА г/х більше, ніж у 2 рази. Разом з цим, похідні глюкозаміну ГА г/х та ГА сульфат запобігали набряку-набуханню головного мозку, про що свідчив МКМ, який у цих групах був на 13% та 25% відповідно менше, ніж у групі контролю (рис.1).  Рис. 1. Масовий коефіцієнт мозку щурів за умов гіпобаричної гіпоксії Примітки: 1. * – p≤0,05 відносно групи інтактного контролю; 2. ** – p≤0,05 відносно групи контрольної патології. Вміст ендогенного N-ацетилГА у групах, що отримували ГА г/х та ГА сульфат, був вище за такий у контролі (у групі ГА сульфату – достовірно). ^ Результати досліджень показали збільшення тривалості життя тварин, що отримували похідні глюкозаміну. Так, у групі ГА сульфату тривалість життя була на 20%, а у групі ГА х/л – на 25% більше (табл.1). Таблиця 1 Вплив похідних глюкозаміну на тривалість життя щурів за умов гемічної гіпоксії.
Примітки: 1. *– p≤0,05 відносно групи інтактного контролю; 2. ** – p≤0,05 відносно групи контрольної патології; 3. ● – p≤0,05 відносно групи пірацетаму.  Рис. 2. Вміст ендогенного N-ацетилГА у головному мозку щурів за умов гемічної гіпоксії Примітки: 1. *– p≤0,05 відносно групи інтактного контролю; 2. ** – p≤0,05 відносно групи контрольної патології; 3. ● – p≤0,05 відносно групи пірацетаму. Введення похідних глюкозаміну достовірно збільшувало вміст ендогенного N-ацетилГА у головному мозку щурів, майже у 2 рази за умов введення ГА сульфату, та майже у 4 рази – у групі ГА г/х, порівняно з групою контрольної патології, де цей показник знижувався. Таким чином, на моделі гемічної гіпоксії встановлено захисну, антигіпоксичну дію похідних глюкозаміну, що виявляється у подовженні тривалості життя експериментальних тварин та запобіганні набряку головного мозку. Дещо більш вираженою антигіпоксичною активністю серед похідних глюкозаміну володіє ГА г/х. ^ Результати дослідження свідчать, що введення дослідним тваринам похідних глюкозаміну збільшувало виживаність (табл. 2). Тривалість життя тварин, що загинули, на тлі введення ГА г/х подовжувалась майже вдвічі, а МКМ був достовірно нижчим за такий у групі контрольної патології та в групі диклофенаку натрію. Таблиця 2 Вплив похідних глюкозаміну на перебіг гіперволемічного набряку у щурів
Примітки: 1. * – p≤0,05 відносно групи інтактного контролю;
На тлі введення похідних глюкозаміну вміст ендогенного N-ацетилГА збільшувався, майже у 3 рази в групі ГА г/х та майже вдвічі в групі ГА сульфату, достовірно перебільшуючи аналогічний показник у групі контрольної патології. Концентрація ТБК-реактантів у групах ГА сульфату та ГА г/х була на 40% та майже 60% відповідно менше за таку в групі контрольної патології. Вплив ГА сульфату на перебіг гіперволемічного набряку мозку мав характер тенденції, а ГА г/х забезпечував порівняну з диклофенаком натрію виживаність тварин, та достовірно ефективніше збільшував тривалість життя щурів, знижував МКМ та вміст ТБК-реактантів. Дослідження на трьох моделях виявило, що разом зі збільшенням тривалості життя похідні глюкозаміну збільшували вміст ендогенного N-ацетилГА у головному мозку тварин, що дозволяє припустити його роль у забезпеченні антигіпоксичних властивостей ГА сульфату та ГА г/х. Комплексний аналіз результатів досліджень антигіпоксичних властивостей похідних глюкозаміну дозволив зробити висновок про раціональність подальших досліджень саме ГА г/х. ^ . Результати дослідження антиамнестичної активності ГА г/х у різних дозах (50 мг/кг, 100 мг/кг, 200 мг/кг) свідчать про те, що він обумовив збереження пам’ятного сліду: латентний період (ЛП) входу до темної камери майже в 3 рази перевищував такий у групі контрольної патології (рис. 3). Дещо більшу антиамнестичну активність чинив ГА г/х у дозі 50 мг/кг, у цій групі ЛП відтворення УРПУ був найдовшим. Отримані дані обумовили раціональність подальших досліджень церебропротекторних властивостей ГА г/х у дозі 50 мг/кг.  Рис.3. Латентний період при відтворенні УРПУ після амнезії Примітки: 1.*– p≤0,05 відносно групи інтактного контролю; 2.** – p≤0,05 відносно групи контрольної патології. Дослідження церебропротекторних властивостей глюкозаміну гідрохлориду в гострому та відновлювальному періодах церебральної ішемії, викликаної білатеральною перев’язкою загальних сонних артерій. Результати дослідження свідчать, що розвиток ГПМК супроводжувався високим рівнем смертності та значним ступенем неврологічного дефіциту. На 4 добу ГПМК вижило 30% тварин, а стан тих, що вижили, був тяжким (табл. 3). Застосування ГА г/х супроводжувалось двократним збільшенням виживаності щурів як у гострому (4 доба), так і у відновлювальному періодах (18 доба) церебральної ішемії. Тварини, що отримували ГА г/х, були більш рухливими − кількість перетнутих квадратів у тесті «відкрите поле» достовірно перебільшувала цей показник у групі контрольної патології. Таблиця 3 Вплив ГА г/х на виживаність, розвиток неврологічного дефіциту
Примітки: 1. *– p≤0,05 відносно групи інтактного контролю; 2. ** – p≤0,05 відносно групи контрольної патології; 3. ● – p≤0,05 відносно групи мексидолу. Ефективність ГА г/х була порівняною з такою мексидолу на 4 добу, а на 18-ту добу ГА г/х достовірно перевищив референтний препарат. Енергетичний метаболізм страждав у гострому періоді ішемії, на 4 добу після моделювання ГПМК вміст АТФ, сума аденілових нуклеотидів (САН) та індекс фосфорилування (ІФ) знижувались, розвивалась гіперферментемія ВВ-КФК (табл.4). Таблиця 4 Енергетичний метаболізм та концентрація ВВ-КФК у головному мозку щурів на 4 добу гострого порушення мозкового кровообігу
Примітки (табл.4, рис. 4): 1. *– p≤0,05 відносно групи інтактного контролю; 2. ** – p≤0,05 відносно групи контрольної патології; 3. ● – p≤0,05 відносно групи мексидолу. Введення ГА г/х супруводжувалось достовірно більшим вмістом АТФ, САН перебільшувала таку в групі мексидолу достовірно, а ІФ не відрізнявся достовірно від такого в інтактному контролі. Вміст ВВ-КФК у групі ГА г/х був майже у 3 рази менше за такий у групі контрольної патології та достовірно менше за такий на тлі мексидолу. При введенні щурам з ГПМК досліджуваного ГА г/х рівень лактату був достовірно нижчим, а пірувату – достовірно вищим порівняно до групи контрольної патології та референтного препарату (рис. 4).   Рис. 4. Концентрація лактату та пірувату у тканині головного мозку щурів на 4 добу гострого порушення мозкового кровообігу Введення ГА г/х щурам з ГПМК протягом відновлювального періоду (2-га серія) супроводжувалось гальмуванням процесів ВРО у головному мозку та активізацією власної АОС, про що свідчили показники, наведені у таблиці (табл.5). Таблиця 5 Показники інтенсивності реакцій ВРО та активності АОС у головному мозку щурів на 18 добу гострого порушення мозкового кровообігу
Примітки (табл.5, рис. 5): 1. *– p≤0,05 відносно групи інтактного контролю; 2. ** – p≤0,05 відносно групи контрольної патології; 3. ● – p≤0,05 відносно групи мексидолу. Згідно результатів дослідження біохімічних показників тканини головного мозку у відновлювальному періоді ГПМК, застосування ГА г/х забезпечувало достовірне гальмування процесів ВРО, рівень ТБК-реактантів був майже вдвічі нижчий за такий у групах контрольної патології та мексидолу та не перевищував достовірно показник групи інтактних тварин. При застосуванні ГА г/х майже втричі знижувався показник ОМБ – АФГ, який був достовірно нижче за такий у групі контрольної патології та мексидолу. Відбувалась також стабілізація інтермедіатів циклу окису азоту – зниження активності NOS та концентрації NO2-. Активність ферментів АОС натомість зростали у групі ГА г/х, за впливом на каталазу ГА г/х виявив порівняну до мексидолу ефективність, а за впливом на СОД перевершив препарат порівняння. Результати морфологічного дослідження наведені на рис. 5.   Рис. 5. Щільність нейронів, гліальних клітин, апоптотичних та деструктивно-змінених клітин на 18 добу гострого порушення мозкового кровообігу. Результати морфологічного дослідження тканини мозку щурів на 18 добу ГПМК свідчили, що наприкінці відновлювального періоду кількість нейронів майже на 40%, а гліальних клітин майже на 30% були нижче за такі у інтакті. Разом з явищами некрозу та деструкції клітин нервової тканини головного мозку відбувалась активація апоптозу нейроцитів, щільність апоптотичних та деструктивно змінених клітин в умовах ГПМК зростала, залишаючись досить високою навіть на 18 добу, більше ніж вдвічі перебільшуючи аналогічний показник тварин без ГПМК. Застосування ГА х/л у лікувальному режимі забезпечувало відновлення кількісного складу нервової тканини головного мозку щурів із ГПМК, а також зниження щільності апоптотичних та деструктивно змінених клітин до рівня інтактних тварин, достовірно порівняно до контрольної патології та достовірно ефективніше за препарат порівняння. Функціональні показники клітин тканини головного мозку в умовах церебральної ішемії знижувались. На 18 добу площа тіл нейронів була на 20%, а вміст РНК у нейронах − на 40% нижче за такі в інтактних тварин (табл.6). Таблиця 6 Функціональні показники та доля апоптотичних клітин у тканині головного мозку щурів на 18 добу гострого порушення мозкового кровообігу
Примітки: 1. *– p≤0,05 відносно групи інтактного контролю; 2. ** – p≤0,05 відносно групи контрольної патології; 3. ● – p≤0,05 відносно групи мексидолу. Внаслідок активації процесів відновлення вміст РНК у гліальних клітинах зростав, проте доля апоптотичних клітин залишалась досить високою. Застосування ГА г/х на протязі відновлювального періоду ГПМК забезпечувало нормалізацію площі тіл нейронів та процесів білкового синтезу в головному мозку щурів. Разом з цим знижувалась доля апоптотичних клітин. За впливом на морфологічні та функціональні показники тканини головного мозку ГА г/х достовірно перевершив препарат порівняння мексидол. Для уточнення механізму церебропротекторної дії ГА г/х були проведені дослідження in vitro з використанням фактору, що ініціює апоптоз – TNF-α на виділеній фракції нейронів (табл.7). Таблиця 7 Дослідження антиапоптичної активності ГА г/х in vitro
Примітки: 1. *– p≤0,05 відносно інтактної серії; 2. ** – p≤0,05 відносно контрольної серії; 3. ● – p≤0,05 відносно серії з мексидолом. Результати дослідження дозволяють зробити висновок, що одним з важливих механізмів церебропротекторної дії ГА г/х реалізується через запобігання утворення АФК шляхом гальмування TNF-α. ВИСНОВКИ У дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що виявляється у експериментальному обгрунтуванні застосування похідних глюкозаміну, а саме глюкозаміну гідрохлориду, в якості церебропротекторного засобу.
^
АНОТАЦІЯ Грінцова О. Є. Експериментальне вивчення церебропротекторних властивостей глюкозаміну та його похідних. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 14.03.05 – фармакологія. – Національний фармацевтичний університет, Харків, 2011. Проведено експериментальне дослідження антигіпоксичних властивостей похідних глюкозаміну на моделях гіпобаричної гіпоксії у мишей, гемічної гіпоксії та гіперволемічного набряку головного мозку у щурів. Виявлено антигіпоксичні, антиоксидантні властивості похідних глюкозаміну в умовах церебральної гіпоксії та обгрунтовано вибір найбільш перспективного аміноцукру для подальших досліджень – глюкозаміну гідрохлориду. Досліджено антиамнестичну активність глюкозаміну гідрохлориду та виявлено умовно ефективну дозу – 50 мг/кг. При вивченні фармакологічних властивостей глюкозаміну гідрохлориду при гострому порушенні мозкового кровообігу (у гострому та відновлювальному періодах) встановлено, що досліджувана речовина збільшує виживаність, знижує ступінь неврологічного дефіциту та покращує рухову активність щурів. Також виявлено властивості глюкозаміну гідрохлориду стабілізувати енергетичний метаболізм, гальмувати процеси вільнорадикального окиснення та стимулювати антиоксидантну систему головного мозку щурів. Застосування глюкозаміну гідрохлориду супруводжувалось збереженням морфологічної структури головного мозку, її кількісного та якісного складу, функціональних властивостей, що підтверджує його церебропротекторну дію. Імовірний механізм церебропротекторної дії ГА г/х полягає у гальмуванні процесів утворення АФК та стабілізації біологічних мембран. Одним з важливих аспектів церебропротекторної дії глюкозаміну гідрохлориду є гальмування апоптозу, що доведено дослідженнями in vitro та in vivo. ^ глюкозаміну гідрохлорид, глюкозаміну сульфат, церебропротекторна активність АННОТАЦИЯ Гринцова О. Е. Экспериментальное изучение церебропротекторных свойств глюкозамина и его производных. – Рукопись. Диссертация на соискание научной степени кандидата фармацевтических наук по специальности 14.03.05 – фармакология. – Национальный фармацевтический университет, Харьков, 2011. Проведено экспериментальное исследование антигипоксических свойств производных глюкозамина на моделях гипобарический гипоксии у мышей, гемической гипоксии и гиперволемического отека головного мозга у крыс. Выявлены антигипоксические, антиоксидантные свойства производных глюкозамина при церебральной гипоксии и обоснован выбор наиболее перспективного аминосахара для дальнейших исследований – глюкозамина гидрохлорида. Исследована антиамнестическая активность глюкозамина гидрохлорида и установлена условно эффективная доза – 50 мг/кг. В процессе исследования фармакологических свойств глюкозамина гидрохлорида при остром нарушении мозгового кровообращения (в остром и восстановительном периодах) установлено, что изучаемое вещество увеличивает выживаемость, снижает степень неврологического дефицита и улучшает двигательную активность крыс. Также выявлены свойства глюкозамина гидрохлорида стабилизировать энергетический обмен, тормозить процессы свободнорадикального окисления и стимулировать антиоксидантную систему головного мозку крыс. Применение глюкозамина гидрохлорида сопровождалось сохранностью морфологической структуры головного мозга, ее количественного и качественного состава, функциональных возможностей, что подтверждает его церебропротекторную активность. Предполагаемыми механизмами церебропротекторной активности ГА г/х являются торможение процессов образования АФК и стабилизация биологических мембран. Одним из важных аспектов церебропротекторного действия глюкозамина гидрохлорида является торможение апоптоза, что подтверждается исследованиями in vitro и in vivo. ^ глюкозамина гидрохлорид, глюкозамина сульфат, церебропротекторная активность SUMMARY Grintsova O. E. Experimental investigation of the cerebroprotective activity of glucosamine and its derivatives. The thesis for the scientific degree of candidate of pharmaceutical sciences in speciality 14.03.05 – pharmacology. – National Univetisity of Pharmacy, Kharkiv, 2011. The dissertation work is devoted to the experimental investigation of the cerebroprotective activity of glucosamine and its derivatives. The antihypoxic activity of glucosamine derivatives was investigated using the models of hypobaric hypoxia in mouses, hemic hypoxia and hypervolemic brain oedema in rats. On all three models the use of glucosamine derivatives was associated with the prolongation of the animal’s life time, decrease of the brain mass coeficient and changes of N-acetylglucosamine methabolism in brain and in liver. Glusosamine derivatives have shown antihypoxic and antioxidant activity in the terms of experimental hypoxia. Changes of the N-acetylglucosamine methabolism enable to conclude that it is supporting the antihypoxic activity of glucosamine derivatives. On tha basis of the screening inversigations was done the choice of the most perspective aminosugar for further studies – glucosamine hydrochloridum. The antiamnestic activity of the glucosamine hydrochloridum was investigated using the conditional reflex of passive avoidance for the assessment of the cognitive and mnestic functions. Glucosamine hydrochloridum was given in dosages 50, 100 and 200 mg/kg and 24 hours after amnesia was revealed. The increase of dose was not associated with efficieany improvement, the relative effective dose − 50 mg/kg was detected. Further investigation of the pharmacological properties of glucosamine hydrochloridum was conducted using the model of acute damage of the cerebral blood flow (in acute and in early rehabilitation period). It was determined, that the inverstigated substance increases the survival rate, that was estimated on the level of 70% in the acute period (4th day) and 65% in the early rehabilitaion period (18th day) and was comparable with reference medicine Mexidolum. The administration of glucosamine hydrochloridum was associated with decrease of the level of neurological deficiency (McGrow skale), and increase of the motion activity of rats that on 18th day after acute damage of cerebral blood flow was comparable with the level of healthy rats. The properties of glucosamine hydrochloride to improve the energy and carbohydrate methabolism in the rat’s brain tissue were determined during the study. The adenylic nucleotides sum and phosphorylation index by glucosamine hydrochloridum administration achieved the level of healthy rats on the 18th day of ishemia, meanwhile the lactate level was ca. 40% lower than the control group level. The properties of glucosamine hydrochloridum to inhibit the processes of free-radicals oxidation were detected. The concentration of the primary and secondary products of lipids peroxidation in the glucosamine hydrochloridum group were significantly lower compairing to the control group and reference medicine. On the 18th day of ishemia the TBA-reactants concentrations in the brain had no significant difference in groups of glucosamine hydrochloridum and healthy rats. The administration of the studied substance is also associated with significant lower levels of oxidative proteins modification markers, that at the end of early rehabilitation period decreased to the level of healthy animals. The activation of iNO-synthase that is specific for the ishemic injuries of brain was by glucosamine hydrochloridum use significant lower, that resulted in lower levels of NO-intermediates. The glucosamine hydrochloridum administration was associated also with stimulation of the antioxidant system that resulted in significant higer levels of cyclooxygenase and catalase compairing to the control group and mexidolum group. The morphological investigations showed that glucosamine hydrochloride was saving the morphological structure of the brain, its qualitative and quantitative composition, its functional potential, confirming its cerebroprotective effect. The probable mechanisms of the glucosamine hydrochloridum cerebroprotective activity is based on the inhibition of the active oxigen forms formation and stabilization of the biological membranes. To one of the important aspects of cerebroprotective activity of glucosamine hydrochloridum belongs inhibition of apoptosis, that was proven by investigations in vitro and in vivo. Key words: glucosamine hydrochloride, glucosamine sulfate, cerebral protection |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям