Для студентов факультета ветеринарной медицины Составители : Д. А. Васильев в. Ю. Луговцев ульяновск 2005
|
|
Скачать 1.04 Mb.
|
|
Типы и техника постановки РИА Учет и оценка результатов РИА Цель занятия |
|
Необходимым условием для высокой чувствительности РИА является высокая специфическая радиоактивность меченого вещества (Бобров Ю., 1981; Tixhon C., 1978), что может быть достигнуто в основном при использовании изотопов с γ – излучением (Casley D.,1977). Выбор метода йодирования определяется природой и свойствами изучаемого белка и дальнейшим его использованием. Лактопероксидазный метод (Thorell J. et al., 1971) предпочтительнее, когда необходимо сохранить биологическую активность меченого белка при изучении его in vivo. Метод Bolfon A. et al. (1973) нужно применять в тех случаях, когда антиген не может быть помечен другими способами. Большинство белков и полипептидов может быть с успехом йодировано хлораминовым методом без потери их иммунологической специфичности (Hunter W. et al., 1962). Поэтому для РИА во всех случаях, где это возможно, необходимо применять метод метки йодом с использованием хлорамина – Т. Порядок приготовления и контроль радионуклидных конъюгатов заключается в следующем:
Полученные радионуклидные конъюгаты контролируют по удельной радиоактивности, проценту кислотонерастворимой фракции и степени йодирования. Удельную радиоактивность препаратов определяют на гамма-счетчике, а содержание белка – по методу Лоури. При этом пользуются соотношением:  ,которая измеряется в имп./мин на 1 мг белка, либо, с учетом эффективности гамма-счетчика, в мКи на 1 мг белка. Для определения кислоторастворимой фракции брали 0,01 мл полученного конъюгата и помещали в пробирку, затем вносили 1 мл 1 % раствора БСА (бычий сывороточный альбумин) и 0,2 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Содержимое пробирки тщательно встряхивают и оставляют на час при 20-22°С. Смесь центрифугируют в течение 10 минут при 5 тыс. об./мин, измеряют радиоактивность в осадке и надосадочной жидкости. Процент кислотонерастворимой фракции вычисляют по формуле:  , гдеn1 – радиоактивность в пробирке с осадком; n2 – радиоактивность в пробирке с надосадочной жидкостью. Степень йодирования (СИ) определяли в используемом объеме меченого раствора по содержанию белка по Лоури и его радиоактивность по формуле:  , гдеА – радиоактивность белка (имп./мин); А1 – радиоактивность смеси (имп./мин); I – количество взятого для метки йода (мкг); Б – количество белка в пробе (мкг); М – молекулярная масса белка; 127 – молекулярная масса йода. При таком способе метки мы получали препараты с удельной радиоактивностью 2,0 мКи/мг, степень йодирования 2,5 атом/моль и 95 % меченого белка. ^ В классическом варианте РИА используется конкурентный тип постановки реакции. В конкурентную среду вводят известное количество меченого антигена, который конкурирует с определяемым антигеном за места связывания специфических антител (Yalow R. et al.,1960). Основные недостатки конкурентных методов заключаются в том, что для каждого определяемого антигена необходимо разрабатывать методы маркировки и способы получения антигенов высокой степени очистки. В том случае если антиген трудно выделить в чистом виде или провести его метку, наиболее подходящими способами его обнаружения являются варианты с использованием меченых антител. Среди последних наибольшее распространение получил «сандвич» – метод. Исходя из результатов собственных исследований «сандвич» – вариант РИА ставили по следующей схеме: полистироловые пластины сенсибилизировали иммуноглобулинами в концентрации 20-25 мкг/мл в дистиллированной воде в течение 16-18 часов при 20-22°С; остаточные сорбционно-активные центры на полистироле пластин блокировали 1% раствором БСА в 0,02М ФБР рН 7,2 в течение 60 минут при 37°С; исследуемые пробы антигенов наслаивали в ФБР рН 7,4 с 0,05% твина 20 и выдержали 60 мин. при 37°С; специфический конъюгат наслаивали в ФБР рН 7,4 с 0,05 % твина 20 в рабочем разведении 200 тыс. имп/мин и выдержали 60 минут при 37°С. Все компоненты реакции использовали в объеме 0,1 мл. После каждого этапа (наслоения) пластину 3-х кратно отмывали физиологическим раствором рН 7,4 с 0,05 % твина 20. При постановке реакции использовали контроли: контроль конъюгата: в первый ряд лунок сенсибилизированной пластины вместо антигена вносят физиологический раствор рН 7,4 с 0,05% твина 20. Контроль конъюгата выявляет неспецифическое связывание меченых иммуноглобулинов с сенсибилизированной пластиной; положительный контроль: в 2 лунки 2-го ряда сенсибилизированной пластины вносят стандартный специфический антиген; отрицательный контроль: в 2 лунки 2-го ряда сенсибилизированной пластины вместо антигена вносят питательный бульон. В качестве другого варианта РИА, особенно ценного в тех случаях, когда исследователь располагает лишь небольшим количеством антител, предложена непрямая методика, при которой используют антивидовые меченые антитела, направленные к иммуноглобулинам применяемой антисыворотки (Hales C. et al.,1975). ^ Важной стадией разработки РИА является учет и оценка результатов. Данный метод, как и ИФА, предполагает автоматический инструментальный учет, что исключает субъективность оценки и снижает практически до нуля возможность ошибочного толкования полученных результатов. Инструментальный учет результатов проводят просчетом лунок в колодце гамма-счетчика «Гамма-1». Исследуемая проба считается положительной при превышении счета связанной радиоактивности опытных образцов со специфическим антигеном над контролями в 2,5 и более раз. Для визуального учета результатов РИА может быть использована авторадиография на рентгеновской пленке. Сущность этого процесса заключается в том, что на последнем этапе постановке реакции, после отмывания меченого препарата, под пластинку подкладывается свинцовый коллиматор с отверстиями и лист рентгеновской пленки любой марки. Смонтированная система тщательно изолируется от света и оставляется на экспозицию в течение 24-48 часов. Проявление пленки осуществляется согласно наставлению по ее применению, и сравниваются пятна затемнения от радиоактивного излучения положительных проб и контролей. Проба считается положительной при наличии интенсивно черной окраски. Для диагностики инфекционных болезней РИА не получил такого распространения, как ИФА. Причинами этого являются недостатки, очевидные еще на заре разработки всех многочисленных модификаций метода:
Занятие 22. Иммуноферментный анализ (ИФА) . (Материал подготовлен совместно с д в н, профессором Алтайского ГАУ Барышниковым П.И.) ^ : ознакомится с различными вариантами ИФА, применяемимы в вирусологической практике. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям