Для студентов факультета ветеринарной медицины Составители : Д. А. Васильев в. Ю. Луговцев ульяновск 2005
|
|
Скачать 1.04 Mb.
|
|
^
В целях повышения чувствительности, ускорения постановки и учета реакции были разработаны и предложены еще несколько усовершенствованных модификаций ИФА: энзимрадиоиммунный анализ: Основан на комбинации иммуноферментного и радиоиммунного анализов; что позволяет повысить чувствительность реакции в 1000 и более раз (Harris C.et al.,1979); иммуноферментный флуоресцентный метод: предполагает использование флуорогенного субстрата, что повышает чувствительность реакции в 10-100 раз, обладает лучшими экономическими показателями (Crum I.et al.,1980; Von Aert A. et al.,1984); термометрическая модификация: основана на измерении температуры, возникающей в процессе взаимодействия фермента с субстратом, продолжительность анализа при этом сокращается до 10 минут, а чувствительность достигает 10–10 моль (Muttia Sou B.,etal.,1977); Следует отметить, что упомянутые методы, а также и некоторые другие, довольно трудоемки в техническом отношении, далеки от автоматизации и поэтому не смогут составить конкуренцию обычным модификациям ИФА для целей экспресс – диагностики. Детальное описание и схемы постановки многочисленных методов твердофазного ИФА приведены в книге «Иммуноферментный анализ» под ред. Т.Т.Нго и Г.Ленхоффа, М., Мир, 1988. ^ В последние годы преобладает стремление к снижению стоимости диагностических процедур и использованию метода не требующего дорогого оборудования. В связи с этим разработан более простой и достаточно дешевый вариант ИФА. Такую модификацию назвали dot-ИФА (dot-Elisa-точечный твердофазный иммуноферментный анализ). В dot-ИФА минимальные объемы растворов антигена или антител наносят на нитроцеллюлозную подложку (мембрану) в виде серии точек, что позволяет выполнить гораздо большее число анализов с тем же количеством реагентов. Субстраты, дающие нерастворимые продукты ферментативной реакции, на белом нитроцеллюлозном фильтре образуют легко различимые цветные пятна, в результате чего отпадает нужда в дорогих фотометрах. Белый цвет подложки вокруг пятен помогает контролировать реакции неспецифического связывания (или неспецифической адсорбции). Фильтры с результатами анализа можно хранить в темноте в течении многих лет без потери интенсивности окраски. Кроме того, простота постановки и малые расходы антигена и других компонентов, необходимых для проведения реакции, позволяет ее использовать в полевых или домашних условиях. В таблице даны сравнительные показатели dot-ИФА и ИФА (М. Pappas,1988). Сравнительная характеристика dot-ИФА и ИФА.
Принцип метода аналогичен с ИФА. Поэтому остановимся на особенностях постановки реакции. Антигены В dot-ИФА можно применять различные типы антигенов, как виде живых вирусов и бактерий, так и полученные в результате разрушения бактерий или вирусов. Для уменьшения потерь антигенов на стадии промывки детергентом связанные белковые антигены можно фиксировать ковалентно с помощью глютарового альдегида. Данная методика постановки реакции способствует сохранению антигенности препаратов и позволяет проводить большее количество анализов с ограниченным количеством антигена. Антиген наносят на твердую подложку в объеме от 0,1 до 3 мкл. Удобнее пользоваться стеклянными гамильтоновскими шприцами объемом до 10 мкл и ценой деления 0,1 мкл. При использовании солюбилизированных антигенов лучше использовать мембраны с малым диаметром пор, так как на них белки связываются в основном с поверхностью. При применении целых клеток простейших, размером 5 – 10 мкм, величина пор не играет большой роли. Схема постановки Метод dot-ИФА позволяет определять как антигены, так и антитела. Все стадии инкубации и промывки выполняются при комнатной температуре. В начале диски с антигеном обрабатывают блокирующим раствором. Для этого лучше всего подходит 3-5% раствор очищенного бычьего сыво-роточного альбумина в триэтаноламиновом буферном растворе (БСА-СТБ), но можно применять и цельную лошадиную сыворотку или 1 %-й раствор нормальной сыворотки кролика в фосфатном буферном растворе NaCl (СФБ) при обнаружении антител. 50 мкл сыворотки пациента в 1%-ном растворе БСА-СТБ инкубируют на диске, антитела связываются с антигеном, сорбированном на диске. Далее диск трехкратно промывают в растворе детергента. Для этого можно использовать 0,05%-ный раствор нонидета Р-40 в СТБ, который является мягким неионным поверхностно активным веществом. Используют и 0,05 % раствор твин 20 в солевом растворе трис HCl. После промывания диски инкубируют с 50 мкл конъюгата афинно очищенных антивидовых антител с ферментом. При данном иммуноанализе широко используют конъюгаты антител с пероксидазой,так как молекулы этого фермента меньше по размерам молекул щелочной фосфатазы и их избыток легче вымывается из пор нитроцеллюлозной мембраны. Но нельзя забывать, что пероксидаза инактивируется азидом натрия, часто используемым в качестве консерванта, а также ароматическими хлорсодержащими углеводородами присутствующими в деионизированной воде, если для ее получения использовали полистирольные смолы. Конъюгаты с щелочной фосфатазой в меньшей степени подвержены действию различных веществ, но из-за большого размера молекулы фермента они дают более высокий фоновый сигнал. После того как провели отмывку несвязавшегося материала добавляют хромогенный субстрат, дающий нерастворимый продукт ферментативной реакции. При окислении субстрата ферментом в присутствии перекиси водорода образуется четко окрашенное пятно. При использовании пероксидазы в качестве субстрата используют 4-хлор-1-нафтол (4ХН), дающий голубую окраску пятен, или диаминобензидин, образующий коричневое окрашивание. При применении щелочной фосфатазы в dot-ИФА применяют 5-бром-4-хлориндолил-3-фосфат (БХИФ), образующий голубое пятно. Во всех случаях интенсивность окраски пропорциональна количеству связавшихся антител. При определении антигенов пробы наносят непосредственно на подложку, после чего проводят иммунологическую реакцию или со специфическими антителами и затем с конъюгатом вторичных антител с ферментом и хромогенным субстратом, или с конъюгатом специфических антител с ферментом-маркером и субстратом. Последний способ дает более четкую положительную реакцию даже при минимальной концентрации антигена. В двухсайтовом dot-ИФА при определении антигенов вначале на подложку наносят специфические антитела. Антигены в пробе связываются этими антителами. Потом добавляют меченые специфические антитела против другого эпитопа антигена и проводят реакцию с субстратом. Для таких методик характерна высокая специфичность,так как при промывании удаляются несвязавшиеся, мешающие определению, антигены. Зыкин Л.Ф., Яковлев А.Т.(1993) приводят следующую схему постановки dot-ИФА, используемую для диагностики сапа, мелоидоза, чумы, туляремии. Определяемый антиген, разведенный 0,1М трис-HСl буфером, наносят в объеме 2 мкл на нитроцеллюлозный мембранный фильтр (НМФ) (размеры пор 0,22-0,45 мкм, использовали мембраны фирм «Millipor»(США), «Schleicher-Schull» (ФРГ), «Synpor» (Чехия)), антиген инкубировали на фильтре при 56°С в течение 30 мин. Затем наносили 5 % раствор БСА и помещали в термостат на 30 мин. при 37°С. Фильтр дважды по 5 мин промывали раствором 0,15М NaCl c твином 20 в кювете на аппарате для встряхивания. После этого НЦМ заливали иммунопероксидазным конъюгатом (ИПК) в рабочем разведении, инкубировали 30-60 мин.при 37°С. Заключительное промывание проводили четырех-пятикратно по пять минут. Далее для проведения реакции НЦМ погружали в рабочий раствор субстрата на 10-15 мин. и проводили учет. При положительном результате на НЦМ проявлялись коричневые точки (пятна), в отрицательном варианте поверхность была бесцветна. Для определения антител использовали следующую схему. На МЦМ наносили взвесь микроорганизмов в концентрации 108, оставляли на 18 часов при температуре +7°С, подсушивали, обрабатывали БСА, отмывали, а потом исследуемую сыворотку наносили на мембрану. Фильтр (НЦМ) двукратно промывали, погружали в антивидовой пероксидазный конъюгат на 1 час при 37°С, четырехкратно промывали и погружали в раствор субстрата с последующим учетом реакции. По наблюдениям авторов специфичность данного метода не уступает классическому ИФА, а чувствительность ниже только на один порядок. Чувствительность, специфичность метода. Хорошие результаты в этом направлении впервые были продемонстрированы при диагностике висцерального лейшманиоза у людей. Специфические антитела в пробе выявляли в количестве от 0,1 нг и выше (Pappas M., 1983). Специфичность метода составила 98 %. Перекрестные реакции с 9 вирусными, бактериальными и паразитарными инфекциями, схожими по клинике с лейшманиозом, отсутствовали. Показатели воспроизводимости результатов при использовании dot-ИФА была чуть выше по сравнению с обычным ИФА и значительно лучше, чем при использовании РСК. Сравнительные исследования показали, что чувствительность и специфичность dot-ИФА и ИФА равноценна. Специфичность и чувствительность метода практически не зависели от сроков хранения сенсибилизированной мембраны. Если мембраны с нанесенными антигенами хранились при комнатой температуре (22°C) в течение 60 дней, то наблюдали снижение титра на 2 разведения. При хранении при температуре 4°С (холодильник бытовой) понижение титра на 1 разведение наблюдали через 3 дня. Хранение при –20°С даже через 270 дней не приводило к уменьшению их реакционной способности. Подвергли проверке и конъюгированные с пероксидазой антитела и субстраты, хранившиеся при 4°С до 28 дней. Указанные условия и сроки хранения не приводили к снижению титра. Кроме того, титры в dot-ИФА не изменяются и после нескольких циклов замораживания – размораживания контрольной сыворотки. Оборудование Для данного метода предложено использовать 96 луночные микропланшеты, в дно лунок которых вплавлены пористые нитроцеллюлозные мембраны. Papas et al. предложили применять полоски нитроцеллюлозных мембран на пластиковой подложке (дипстики). Их удобнее использовать в полевых условиях. Однако необходимо учитывать, что полоски легко ло-маются и очень не прочны. Поэтому предложено, чтобы эти нитроцеллю-лоидные фильтры после нанесения антигена наклеивали на гибкие пласти-ковые полоски. Сейчас используют мультиантигенные дипстики – с четырьмя разными антигенами. Экспериментально доказано, что этот вид дипстиков обладает диагностической чувствительностью. Третий вид экспериментального оформления dot-ИФА разработан специально для экспресс-диагностики. Антиген наносится на непрозрачные пластиковые карточки в виде точек расположенных так же, как и на обычном микротитровальном планшете. Эту карточку можно обрезать, если использовано небольшое количество проб. Результаты dot-ИФА на карточках в 97 % случаев согласуется с результатами анализа при использовании коммерческого набора. Таким образом, основным преимуществом dot-ИФА является возможность его использования в различных условиях и для различных количеств исследуемых образцов. Все модификации этого метода отличаются экономичым расходом реагентов, не требуют приборов с электропитанием, наборы очень компактны. По-видимому, в ближайшее время этот метод найдет широкое применение. ^ 1. Ознакомить студентов с наборами для проведения РИА, ИФА. 2. Обнаружить и идентифицировать вирусспецифический антиген с помощью иммунопероксидазной реакции. 3. Провести учет реакции. Примерный план занятия (2 ч) 1. Контрольный опрос. 2. Объяснения преподавателя. 3. Демонстрация наборов для проведения ИФА; постановки и учета ИФА. 4. Самостоятельная работа студентов. 5. Подведение итогов занятия. 6. Задание к следующему занятию Методические указания Время данного занятия целесообразно распределить так, чтобы студенты смогли провести самостоятельную работу. Для ее проведения желательно взять препарат-отпечаток, иммунную сыворотку, содержащую антитела к предполагаемому вирусу, антивидовой противовирусный конъюгат и субстрат. Вопросы домашнего задания 1. Вирусы европейской и африканской чумы свиней. ^ (Материалы подготовленны совместно с зав лабораторией ВНИИВВиМ Малоголовкиным С.) ^ : изучить суть использования моноклональных антител Краткие теоретические сведения Вторая половина двадцатого века характеризуется появлением в человеческой цивилизации нового, доселе отсутствующего, фактора получившего название научно - технической революции. В данное понятие входит и биологическая революция, имея в виду довольно широкий круг открытий в области молекулярной генетики, цитологии, иммунологии и т.д. Однако кардинальным событием последней четверти нашего столетия стало то, что экспериментальные работы в разных областях биологии привели к развитию качественно нового направления – гибридомной технологии. Работы по созданию гибридом, секретирующих моноклональные антитела (МАт), были сделаны не на «пустом» месте. О возможности возникновения гибридов между соматическими клетками в организме животных и человека, например при вирусных и бактериальных болезнях, знали еще задолго до открытия гибридомной технологии. В 1960 году Барски с сотрудниками сообщили о выделении линии гибридных клеток в культуре ткани. Гибридная клетка – это клетка, образовавшаяся при слиянии двух или большего числа соматических клеток, в результате которого происходит обобществление клеточных мембран, цитоплазмы и, главное, хромосомных аппаратов – носителей генетической программы жизнедеятельности клеток. Уникальность данного феномена состоит в том, что гибридные клетки оказываются не «уродами», неспособными к нормальной жизнедеятельности, а наоборот, они унаследуют и объединяют в себе свойства обеих родительских клеток, в том числе способность к делению и специфическим биосинтезам. Хронология основных событий, последовавших за первой работой по выделению гибридных клеток в культуре тканей, прекрасно представлена в книге Н.Рингерца и Р.Сэвиджа, опубликованной в Нью-Йорке в 1976 г. и переведенной на русский язык в 1979 г. Исследования различных гибридных клеток животных и растений сделали неоценимый вклад во многие области биологии, особенно генетики. Достаточно отметить такие достижения, как картирование генов в хромосомах человека и обнаружение ряда фундаментальных закономерностей фенотипического выражения (экспрессии) генов в соматических клетках. Тем не менее, о гибридных клетках, как о методологическом направлении биотехнологии, стали думать и писать тогда, когда в качестве одного из партнеров для гибридизации стали использовать иммунокомпетентные клетки, т.е. лимфоциты, а в качестве второго – бесконечно пролиферирующие опухолевые клетки, как бы «увековечивающие» продуктивную деятельность лимфоцитов. Первые сообщения о гибридных клетках, продуцирующих антитела к известным антигенам, были сделаны в 1969 году С. Синковицем из отдела клинической вирусологии и иммунологии университета в Техасе. В своих исследованиях автор наблюдал спонтанное образование гибридных клеток между лимфоцитами и плазматическими клетками лейкозных мышей. Эти гибридные клетки неограниченно делились и продуцировали антитела к антигенам вируса лейкоза мышей. В 1971 году Б.Мохит опубликовал в журналах «PNAS» и «Science» работы по продукции иммуноглобулинов в клетках-гибридах между клетками миеломы и лимфомы мышей. Однако ни один из этих авторов не пришел к выводу о возможности целенаправленного получения линий гибридных клеток, продуцирующих антитела заданной специфичности. Поэтому гибридомы как метод получения моноклональных антител открыли именно Г.Келер и Ц.Мильштейн, работавшие в то время в лаборатории молекулярной генетики иммуноглобулинов в Кембридже. В их работе «Длительно живущие культуры гибридных клеток, секретирующие антитела предопределенной специфичности», опубликованной в «Nature» в 1975г., показан тот уровень обобщения идеи, который необходим и достаточен для начала нового направления в науке и народном хозяйстве – иммунобиотехнологии и, в частности, гибридомной технологии. Суть их открытия одновременно является сутью метода гибридомной технологии. Авторы применили существовавший уже метод гибридизации соматических клеток к иммуноцитам. Они слили лимфоциты от иммунизированной эритроцитами барана мыши с сингенной и гистогенетически близкородственной опухолевой клеткой перевиваемой in vitro плазмоцитомы. В результате получились жизнеспособные гибридные клетки, которые неограниченно делились как один из родителей и продуцировали специфические антитела как второй из родителей. Такие искусственно созданные специализированные линии клеток назвали гибридомами. От опухолевой клетки гибридомы наследуют способность спонтанно размножаться, начиная от одной единственной клетки. Поэтому гибридомные клетки могут быть физически разделены in vitro по одной, каждая из которых, делясь митозом, превращается в клон – популяцию генетически идентичных клеток. Антитела, продуцируемые одним клоном гибридных клеток, стали называть моноклональными (МАт) за их происхождение. Понятие моноклональности существовало в иммунологии давно. Идея о клонально-селекционной организации иммунной системы была сформулирована еще Ф. Бернетом. Основным положением этой идеи было то, что одна клетка иммунной системы продуцирует антитела только против одного антигена, т.е. иммунная система клонирована по антигену. Блестящим экспериментальным подтверждением клонально-селекционной теории иммунитета и явился метод получения моноклональных антител. Моноклональность гибридомных антител (т.е. физическая моноклональность) в подавляющем большинстве случаев совпадает с моноклональностью в понимании Бернета (антитела, продуцируемые одним клоном гибридных клеток, все одинаковы). Предложенный английскими исследователями метод создания гибридом был взят на вооружение во всех странах мира, где есть экспериментальная биология. Гибридомная технология, ставшая основой создания МАт, буквально пропитала теоретическую и прикладную иммунологию, проникла во многие разделы вирусологии, микробиологии и медицины. В настоящее время создана, можно сказать, гибридомная промышленность, и на рынок поступают сотни вариантов МАт. Гибридомная технология является не только примером быстрого внедрения науки в практику, но и примером продолжающегося одновременного развития фундаментальных научных исследований, причем на качественно новом уровне, так как гибридомы – наиболее эффективный и мощный инструмент современной биологической науки. Глоссарий терминов используемых в гибридомной технологии
|
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям