Для студентов факультета ветеринарной медицины Составители : Д. А. Васильев в. Ю. Луговцев ульяновск 2005
|
|
Скачать 1.04 Mb.
|
|
Основные принципы получения моноклональных антител. Методы иммунизации при получении гибридом. |
|
^
В основу метода наработки МАт положена способность нормальных плазматических клеток иммунного организма сохранять продукцию антител после слияния с перевиваемыми опухолевыми клетками. В результате образуется популяция гибридных клеток (гибридом), которой родительские селезеночные клетки передали способность вырабатывать специфические антитела, а родительские миеломные – способность к неограниченному росту и индукции асцитных и солидных опухолей. В настоящее время предложено несколько модификаций метода получения гибридом, но все они сводятся в целом к проведению следующих этапов (рис.1):
Большое значение при получении гибридом придается опухолевой линии клеток – одному из партнеров, участвующему в гибридизации, – которая должна отвечать определенным требованиям. Существует ряд критериев для выбора опухолевой линии клеток в качестве партнера для слияния.  Во-первых, природа клеток должна быть такова, чтобы объединение их хромосом с хромосомами нормальных лимфоцитов не сопровождалось дисфункциональными расстройствами биосинтеза антител. Этому требованию лучше всего удовлетворяют генетически (т.е. сингенные) и эпигенетически (т.е. клетки того же типа тканевой дифференцировки) родственные клетки.Для В-лимфоцитов таковыми являются плазмацитомы (миеломы), а для Т-лимфоцитов – Т-лимфомы. Во-вторых, они должны легко расти в культуре in vitro, иметь время генерации около 12 часов и, по возможности, пролиферировать на минимальных питательных средах. В-третьих, желательно, чтобы опухолевые клетки-партнеры были способны расти в брюшной полости сингенных животных, обеспечивая по этому признаку хорошую наследственность гибридным клеткам в плане получения асцитов, как источника больших количеств МАт. В-четвертых, они должны обладать высокой гибридизуемостью, обеспечивая частоту гибридизации около 10–2 (т.е. каждая сотая клетка из общей смеси должна давать жизнеспособный гибрид). И, наконец, опухолевые клетки должны быть мутантны по определенным генам, контролирующим экспрессию жизненно-необходимых ферментов, для того, чтобы опухолевый партнер по гибридизации наверняка погибал на специальных селективных средах и не маскировал рост гибридов. Наиболее широко используемый метаболический дефект – отсутствие фермента гипоксантин-гуанини-фосфорибозилтрансфераза (ГГФРТ). В клетках млекопитающих существует два пути синтеза нуклеотидов – основной, при котором нуклеотиды синтезируются de novo из аминокислот и углеводов, и запасной, так называемый метаболический шунт, для которого характерно использование предшественников пуринов – гипоксантина и тимидина. Синтез нуклеотидов по второму пути может происходить лишь в том случае, когда в клетках присутствует фермент ГГФРТ. Этот фермент обеспечивает включение в ДНК и РНК и таких антиметаболитов, как 8-азагуанин или 6-тиогуанин, что приводит клетку к гибели. Поэтому, если опухолевые клетки культивировать на среде, содержащей 8-азагуанин, то смогут выжить только мутанты, у которых отсутствует функционально активная ГГФРТ. Этот простой прием широко используется для получения опухолевых клеточных линий – партнеров для гибридизации. Клетки таких линий способны расти, синтезируя свои нуклеотиды de novo из углеводов и аминокислот. Аналог фолиевой кислоты аминоптерин блокирует синтез de novo. Однако клетки, имеющие ГГФРТ и его субстраты – гипоксантин и тимидин, сохраняют жизнеспособность в присутствии аминоптерина. Поэтому гибридные клетки, вобравшие в себя геном нормального лимфоцита, содержащий нормальный ген ГГФРТ, выживают в отличие от родительских опухолевых клеток на селективной среде, содержащей гипоксантин-аминоптерин-тимидин (НАТ). Второй партнер по гибридизации – лимфоциты, как правило, в культуре не размножаются и отмирают через 7-14 дней. В настоящее время существует множество различных типов маркированных (дефектных по ГГФРТ) миеломных линий клеток лабораторных животных (мышь, крыса) и человека. Наиболее широкое распространение получили мышиные миеломы в основном генотипа ВАLB/с (табл. 2). Большинство из них являются субклонами давно известной миеломной линии Р3-Х63. В 1978 г. Г. Келер с сотрудниками получили несекретирующую иммуноглобулины линию NS1/1Ag4.1, а Шульман с сотрудниками из гибридного клона Sp 2/HLGK, секретирующего МАт к эритроцитам барана, получили линию Sp 2/0-Ag 14.1, обладающую повышенной гибридизуемостью и пролиферативной активностью. В 1979 году исследователями из ФРГ получена миеломная линия P3-X63-Ag8.653, ставшей одной из самых популярных в мире линий, используемых для гибридизаций. В 1983 г. сотрудниками фирмы «Nunclon» Таггортом и Сальмофом получена миелома FOX-NY. Эта линия является дефектной по двум ферментам: ГГФРТ и АФРТ (аденин-фосфорибозилтрансфераза), поэтому при слиянии со спленоцитами от Робертсоновских мышей RB (8.12), у которых активный локус тяжелой цепи IgG на 12-й хромосоме и селективный локус ферментного маркера АФРТ на восьмой генетически связаны, дальнейшая селекция может проводиться как на среде НАТ, так и на среде, содержащей азасерин, который блокирует синтез пуринов de novo в клетках, дефектных по АФРТ. Причем гибридомы, полученные селекцией по АФРТ, более стабильны и в 100% случаев являются антителопродуцентами, поскольку несекретирующие антител гибриды, погибают в селективной среде в связи с транслокацией 8 и 12 хромосом. Правильный выбор и подготовка опухолевой линии клеток для слияния является безусловно ответственным моментом, однако подготовка иммунных лимфоцитов – второго партнера по гибридизации имеет не менее важное значение при получении МАт. . Миеломные линии, используемые для получения гибридом
^ Иммунизацию при получении гибридом проводят с целью выработки у животного – донора спленоцитов, увеличивающейся популяции В-лимфоцитов, продуцирующих антигенспецифичные иммуноглобулины. При этом В-лимфоциты, как один из партнеров для получения гибридом, должны быть способны к слиянию с плазмацитомными клетками и находиться в стадии неполной дифференциировки в зрелые плазматические клетки. Поэтому все процедуры гибридизации предусматривают взятие лимфоцитов у иммунизированного животного в первые шесть дней после введения последней дозы антигена. Лимфоциты многих видов животных способны при слиянии с клетками мышиной миеломы образуют жизнеспособные антителосекретирующие гибридомы, однако использование в качестве источника лимфоцитов мышей линии ВАLb/с открывает гораздо большие перспективы, так как гибридомы «мышь-мышь» более стабильны и секретируют больше антител, чем межвидовые гибриды. Кроме того, мышиные миеломные линии, используемые в качестве партнера при слиянии, несут антигены гистосовместимости BALb/с. Образующиеся в результате слияния с мышиными спленоцитами гибридомы при этом имеют только BALb/c – антигены гистосовместимости, что позволяет выращивать их в брюшной полости мышей этой линии. При этом продукция антител гибридомами превышает продукцию in vitro более, чем в 1000 раз. Для иммунизации мышей необязательно использовать высокоочищенные антигены, поскольку каждая полученная гибридома будет продуцировать антитела лишь к одной антигенной детерминанте (эпитопу). В принципе возможно получение специфических гибридом и без иммунизации: получив несколько сотен гибридов из лимфоцитов интактной мыши, почти наверняка можно обнаружить хотя бы одну гибридому, МАт которой будут связываться с определенным произвольно взятым антигеном. Однако, при таком подходе эффективность гибридизации (процент гибридом, продуцирующих специфические антитела, от общего числа гибридом) – минимальна. С другой стороны показано, что обычные схемы гипериммунизаций, принятые для получения сывороточных иммуноглобулинов, не всегда оптимальны для получения высокой специфической эффективности гибридизации. Существует два основных способа иммунизации при получении гибридом: иммунизация in vivo и иммунизация in vitro. Удовлетворительной считается средняя специфическая эффективность гибридизации, равная 10-15%. Она достигается, например, всего при двукратном введении животным небольших доз белковых антигенов в сопровождении адъюванта Фрейнда с интервалом, превышающим время прохождения пика первичного ответа. Многие исследователи при получении гибридом применяют различные схемы иммунизации, пытаясь повысить количество клеток, образующих антитела и увеличить, в конечном итоге, выход антигенспецифичных гибридом. Обычно это делают, иммунизируя ряд животных и выбирая клетки селезенки тех мышей, у которых самый высокий титр антител. Однако, не смотря на повышение уровня антител в сыворотках крови иммунизированных мышей, не всегда удается существенно повысить эффективность гибридизации. Помимо повышения активности сывороточных антител, предлагаемые методы иммунизации должны давать и хороший абсолютный выход соответствующей селезеночной популяции. В качестве иммуногенов при получении гибридом к вирусным антигенам обычно используют лизаты зараженных клеток, нативные препараты очищенного вируса, высокоочищенный вирус, обработанный детергентами или ультрафиолетом, а также вирусные белки, химически модифицированные и синтетические полипептиды. В последнее время стали интенсивно разрабатываться методы иммунизации in vitro. Особое значение придается иммунизации in vitro в целях получения гибридом на основе лимфоцитов человека, в силу императивного запрета на иммунизацию in vivo. На сегодняшний день опубликован целый ряд работ, в которых достаточно подробно описаны методические подходы по иммунизации спленоцитов in vitro и получению на их основе гибридом. Анализ данных по иммунизации спленоцитов in vitro показывает, что данный метод имеет ряд преимуществ по сравнению с иммунизацией мышей in vivo. Это, во-первых, сокращение сроков иммунизации до четырех – пяти суток. Во-вторых, непосредственный контакт антигена с иммунокомпетентными клетками, минуя все барьеры живого организма, что имеет большое значение для слабых иммуногенов. В-третьих, метод дает возможность контролировать эффективность иммунного ответа. Однако, несмотря на преимущества, иммунизация in vitro имеет ряд недостатков технического плана, которые сдерживают широкое внедрение этого метода в практику. В частности, нужна качественная культуральная среда и посуда, необходимо добавление в культуральную среду биологически активных иммунофакторов, а также необходима стерильность используемого антигена. Поэтому, многие исследователи изыскивают другие методы введения антигена, которые позволяют сократить сроки иммунизации, не снижая при этом выход гибридом заданной специфичности. В этом плане заслуживает внимание внутриселезеночная инъекция антигена, разработанная Spitz M. et al., а затем взятая на вооружение и другими исследователями, которые с успехом применили ее при получении МАт к различным вирусным антигенам. Внутриселезеночная иммунизация не снижает выход вирусспецифических клонов по сравнению с традиционными методами иммунизации, но, как правило, наблюдается образование гибридом, секретирующих МАт к поверхностным антигенам. Тем не менее внутриселезеночная иммунизация не всегда дает высокую эффективность гибридизации и, кроме того, возникает вопрос о стабильности антителопродукции гибридными клетками. Следовательно, при целенаправленном получении МАт к определенному белку необходимо отдавать предпочтение той иммунизации, которая способствовала бы оптимальному выходу нужных клонов. |
||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям