Для студентов факультета ветеринарной медицины Составители : Д. А. Васильев в. Ю. Луговцев ульяновск 2005
|
|
Скачать 1.04 Mb.
|
|
^
Методы гибридизации иммунных спленоцитов с миеломными клетками бывают биологические (с помощью вирусов типа Сендай), химические (с помощью веществ типа лизолецитина или полиэтиленгликоля) и физические (с помощью электрического поля). Гибридизация с помощью вируса Сендай не всегда дает положительные результаты. Некоторые вторы объясняют это тем, что не все клетки мышиной миеломы имеют рецепторы для данного вируса (Кеннет, 1983). Поскольку мембраны клеток заряжены и электропроводны, то, понятно, были предприняты попытки, оказавшиеся весьма удачными, вызвать гибридизацию клеток посредством воздействия внешним электрическим или магнитным полем. Эффективность электрогибридизации, как правило, на один – два порядка выше, чем гибридизация биологическими и химическими методами. Технология электрогибридизации позволяет проводить процесс под визуальным контролем через микроскоп и сразу отделять гибридные клетки от неслившихся, что исключает необходимость метаболической селекции. Однако, данный метод требует дорогостоящего оборудования и высокой квалификации персонала. Поэтому наибольшее распространение в настоящее время получили методы гибридизации с использованием полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой от 1000 до 6000. Первое сообщение о том, что ПЭГ повышает частоту слияния прикрепленных клеточных линий сделали Дэвидсон Р. и Геральд П. в 1976 году. В последующем другие исследователи применили этот метод для клеток миеломы и селезенки. При использовании данного метода частота гибридизации составляет обычно один гибрид на каждые 2´105 клеток селезенки. Данная эффективность гибридизации считается вполне удовлетворительной для сильных иммуногенов, но служит серьезным препятствием для слабых иммуногенов. Это хорошо показано в работе Кеннет (1983) в отношении специфичности МАт к 33-галлотипу Н-2в, который является слабым иммуногеном. Автору в своих исследованиях не удалось получить ни одного стабильного гибрида. Поэтому многие исследователи изыскивают методы и способы гибридизации, чтобы повысить частоту образования гибридов, особенно в отношении слабых иммуногенов. Увеличение частоты образования гибридных клеток пытались решить, изменяя концентрацию ПЭГ, значения рН во время слияния, соотношение селезеночных и миеломных клеток, используя различные партии сывороток и типы питательной среды, тимоциты и другие подкормки, а также разные варианты посева слившихся клеток. Однако, до настоящего времени ни одна из вышеперечисленных попыток, путем манипулирования различных переменных, не привела к существенному повышению абсолютного выхода получаемых гибридов на иммунизированную селезенку. В работах Игнатьевой Г.А. с соавторами, 1989 г., Хаитова с соавторами, 1987 г. и ряда зарубежных авторов описаны различные процедуры гибридизации, которые способствуют получению более легко воспроизводимых результатов. Тем не менее, вопрос о преимуществах той или иной модификации остается открытым. После гибридизации, через 7-14 дней, в лунках вырастают колонии гибридных клеток и возникает необходимость тестирования супернатантов на наличие специфических антител. В зависимости от целей, поставленных исследователями, тестирование может проводиться различными иммунологическими тестами, в том числе, РТГА, НМФА, РСК, РДП. Однако, многие МАт, в отличие от поликлональных сывороток, активны лишь в некоторых серологических реакциях. Это может быть связано как с эпитопной специфичностью МАт, так и с их изотипом, то есть с антигеннезависимыми свойствами молекул МАт. Поэтому при скрининге предпочтительнее использовать методы, основанные на выявлении непосредственного взаимодействия антител с антигеном, а не на выявлении последствий этого взаимодействия (связывание комплемента, агглютинации и т.п.). Наиболее широкое распространение получил иммуноферметный анализ (ИФА), обладающий нанограммовой чувствительностью, максимальной специфичностью и позволяющий обрабатывать сотни проб объемом не более 100 мкл за рабочий день. Реже используется метод иммунофлюорометрического анализа и радиоиммунологического анализа. Идентифицированные гибридомы клонируют. Следует подчеркнуть, что клонирование является тем этапом гибридомной технологии, который лимитирует пропускную способность всего метода. Поэтому очень важно тщательно провести скрининг, отобрать необходимые гибридомы и, во избежание перерастание антителопродуцирующих клеток клетками, потерявшими способность секретировать антитела, как можно скорее провести клонирование. Широко используется два методических подхода: клонирование методом предельных (лимитирующих) разведений и клонирование в полужидком агаре. В первом случае готовят разведения в ростовой среде, содержащей 1-3 клетки на 0,5 мл и рассаживают по 100 мкл в лунки 96-луночных пластин, либо клетки рассеивают из расчета одна клетка на лунку. При клонировании в полужидком агаре гибридные клетки вносят в 0,5% раствор агара, приготовленный на культуральной среде. Клетки при этом способе обычно вносят в агар из расчета 20-40 клеток на лунку 24-х луночной пластины. Через 7-10 дней образовавшиеся клоны переносят в лунки 96-луночных пластин, контролируя все действия на микроскопе. Сформировавшуюся популяцию клеток после клонирования тестируют. При первом клонировании гибридом-продуцентов наблюдается расщепление клонов по способности продуцировать специфические антитела. Одной из основных причин нестабильности гибридом считают элиминацию хромосом, несущих иммуноглобулиновые гены. Однако возможны и иные механизмы (как генотипические, так и фенотипические), в силу которых гибридные клетки перестают синтезировать иммуноглобулины. Позитивные клоны после тестирования подвергаются реклонированию. При повторном тестировании количество позитивных клонов может уменьшиться за счет выявления менее стабильных клонов. Для получения достаточно стабильной линии гибридных клеток требуется 2-3 (иногда больше) клонирования. При таком подходе после второго-третьего клонирования число позитивных клонов оказывается близким к 100%. Для поддержания стабильности линии на достаточно высоком уровне при длительном пассировании в культуре, после пассирования на мышах и при больших сроках хранения клонов в криоконсервированном состоянии необходимо проводить клонирование не реже одного раза в три месяца. После клонирования гибридные клетки могут быть выращены в культуре в значительном количестве. Как правило, концентрация антител в культуральной жидкости достигает 10-100 мкг/мл. Рост гибридом в организме экспериментальных животных (мышей) обеспечивает продукцию МАт на один-два порядка выше. Для культивирования гибридных клеток in vivo и для получения асцитической жидкости, содержащей МАт, мышам, предварительно праймированным пристаном (2,6,10,14 – тетраметилпентадекан) или неполным адъювантом Фрейнда, вводят внутрибрюшинно гибридные клетки в дозе 2-4´107 на животное. Асциты формируются на 7-14 сутки после инокуляции клеток. Полученные МАт подвергаются тщательному анализу с целью определения их свойств и дальнейшего практического использования. Таким образом, технология получения гибридом, секретирующих моноклональные антитела, состоит из множества важных этапов, правильное и качественное выполнение которых обеспечивает успех работы и достижение поставленных целей (схема 1). На сегодняшний день далеко не все теоретические и технические проблемы создания гибридом решены. Особенно важным является решение вопроса о потери хромосом гибридными клетками. ^ Применение метода гибридом и МАт в биологических и медицинских исследованиях вызвало взрывной рост информации и замену наших представлений о структуре вирусов и антител, функции отдельных компонентов вириона (антигена) в развитии иммунных реакций, о структуре и роли различных типов антител в нейтрализации вирусов, о механизмах нейтрализации и т. д. Неудивительно, что все больше и больше исследований проводится с использованием МАт. За последнюю четверть двадцатого века технология получения МАт совершила молниеносный скачок от чисто теоретического направления исследований до биотехнологических компаний по их производству. В своей лекции, посвященной присуждению Нобелевской премии, К. Мильштейн сказал, что быстрое развитие биотехнологии обусловлено использованием биологических механизмов, связанных со способностью иммунной системы генерировать около 106 – 109 различных антител, при очень небольшом количестве генов, контролирующих этот процесс. Основные элементы стратегии и тактики получения гибридом и МАт
Технически этот вопрос решился именно путем гибридизации В-лимфоцитов, секретирующих антитела, с перевиваемыми миеломными клетками, обладающими неограниченной потенцией роста. Соединение этих свойств в одной гибридной клетке дало биологам метод получения «биологически чистых реактивов», которые явились уникальным инструментом познания структуры и функции не только антигенов и антител, но и самих клеток, их продуцирующих. Новый этап развития биотехнологии, связанный с внедрением гибридом и МАт, охарактеризовал себя созданием новых концепций о структуре и функциях изучаемых объектов. Какие же новые концепции превнесены в вирусологию и иммунологию с внедрением метода МАт? 1. Метод МАт обеспечил изучение антигенной структуры микроорганизмов в нативном виде, в их естественной локализации и в их активном функциональном состоянии. Такой возможности не могли представить исследователям ни биохимические методы, ни методы молекулярной биологии, ни генной инженерии. Перечисленные методы требуют для изучения структуры компонентов биологических объектов (вириона), в частности, их локализации, предварительной обработки физическими и химическими факторами, что, как правило, приводит к различного рода повреждениям активных группировок или конформационным изменениям рецепторов. Следовательно, результаты таких взаимодействий не всегда можно контролировать, а учитываемый эффект может быть искажен. Например, при выделении полипептидов детергентами, часть полипептидов денатурирует и их нельзя выявить доступными методами. В отличие от этого, выделение полипептидов с помощью МАт, где происходит специфическое связывание антигена с антителом, последующая элюция не приводит к повреждению структуры антигена. Повреждение или изменение структуры биологических веществ наблюдали при выделении гемагглютинина вируса гриппа ( в мономерной форме) при конструировании химической вакцины, в результате чего антигенная активность его снижалась на 2-3 порядка. Такое же явление исследователи наблюдали при синтезе гамма-глобулинов и интерферона. 2. Метод МАт позволил выявлять активные группы, участки на молекуле антигенов (детерминанты), взаимодействующие с антителами, а также изучить характер этих взаимодействий в количественных соотношениях, т.е. сопоставлять биологические реакции с химическими и расшифровать молекулярные механизмы этих реакций. Использование МАт, обладающих строгой эпитопной специфичностью (комплементарностью к определенному антигенному участку), дает возможность изучить тонкие структурные изменения антигенных детерминант в процессе эволюции и проводить эпитопное картирование вирусных белков. В частности, с помощью МАт на молекуле нуклеопротеина вируса гриппа А птиц (ВГП) установлено наличие трех антигенных сайтов, имеющихся у подавляющего большинства штаммов вируса гриппа А птиц (рис.2). В тоже время, антигенная детерминанта, выявляемая МАт 1С6, имеется практически у всех исследованных штаммов вируса гриппа птиц, лошадей, свиней и человека, за исключением штамма A/equin/Miami/1/63 (H3N8), тогда как антигенная детерминанта, выявляемая МАт 1F8, 5C10, 5E4 и 5F12, имеется лишь у вирусов гриппа птиц и лошадей. Эти исследования позволили сделать предположение о реассортации антигенных детерминант между штаммами ВГП и гриппа лошадей. Данные последних лет, полученные с помощью МАт, показывают, что такого рода реас сортация может наблюдаться также между вирусами гриппа птиц и человека.  Рис 5.Схематическое изображение расположения антигенных детерминант на молекуле нуклеопротеина ВГП. Изучение структуры антигенных детерминант повысило уровень исследований в иммунологии до молекулярного уровня. Высокая специфичность МАт, на уровне химических реактивов, позволила дифференцировать различия в структуре по отдельным аминокислотам, дала возможность вести секвенирование белкового и нуклеиновых компонентов микроорганизмов, клеток животных и далее вести отбор желаемых клонов вируса. Так с помощью МАт были секвенированы клоны вируса бешенства с высокой нейровирулентностью, идентифицированы штаммы вируса бешенства различного происхождения по зонам, выделены клоны вирусов герпеса, венесуэльского энцефаломиелита и др., обладающие высокой иммуногенностью. 3. С помощью МАт были расшифрованы механизмы защитных реакций in vitro и in vivo, что позволило создать новые концепции по функционированию и реализации защитных механизмов. Изучение вопросов по взаимодействию МАт с вирусами, определение валентности антител и роль этого феномена в вирусной нейтрализации позволило создать гипотезу многоударного механизма нейтрализации. Эта гипотеза получила в последующем экспериментальное подтверждение и тем самым была развеяна догма об одноударном механизме нейтрализации. 4. Разработка метода МАт дала совершенно новое направление в создании защитных препаратов, основанное на изучении структуры идиотипических МАт и механизмов идиотип-антиидиотип взаимодействий. При этом антиидиотипические МАт могут быть использованы в качестве иммунизирующего агента, т.е. антигена. В этом направлении уже получены положительные результаты. На модельных животных было показано, что антиидиотипические антитела, несущие «внутренние образы» антигена могут быть использованы в качестве вакцин против инфекционных агентов (Alain L., 1991, Yasmin Th., 1989, Hariharan K.,1991). Более того, антиидиотипические МАт позволили провести углубленный анализ структурно-функциональных взаимоотношений между рецепторами клеток и активными сайтами антигенов. Примером данного направления могут служить многочисленные работы отечественных и зарубежных исследователей, в которых показано получение антиидиотипических МАт к альфа-интерферону человека. Эти антиидиотипические МАт имитировали биологические свойства альфа-интерферона человека. В частности, они обладали антивирусной активностью в отношении некоторых РНК- и ДНК-содержащих вирусов. Данные антиидиотипические МАт с «внутренним образом» альфа-интерферона , меченные флуорохромом или ферментами могут, быть использованы в качестве маркеров для индикации рецепторов на мембранах иммунокомпетентных клеток человека для альфа-интерферона. 5. Метод МАт обеспечил развитие новых направлений биотехнологии при наработке биопрепаратов различного назначения – это МАт для изготовления диагностических и защитных препаратов, киллерных и хелперных клеток определенной специфичности, клеток синтезирующих гормоны роста, вещества, стимулирующие вегетативные процессы и т. д. Особенно бурное развитие и широкое распространение получили МАт используемые для целей диагностики. В настоящее время как за рубежом, так и в нашей стране разработано множество тест-систем на основе МАт для диагностики инфекционных болезней животных и человека различной этиологии. Благодаря строгой эпитопной специфичности и высокой чувствительности МАт потеснили ранее используемые методы идентификации возбудителей на основе поликлональных антител и успешно вписались в общую схему диагностики ряда вирусных и бактериальных инфекций. Использование МАт в серологических реакциях сделало возможным проводить дифференциацию близкородственных вирусов, в отличие от сывороточных антител, которые не всегда позволяют надежно идентифицировать возбудитель и могут обладать перекрестной реактивностью со сходными по антигенной структуре вирусами. Например, вирусы эпизоотической геморрагической болезни оленей (ЭГБО), болезни Ибараки и катаральной лихорадки овец (КЛО) антигенно родственны между собой, то антитела, вырабатываемые животными в ответ на инфицирование хотя бы одним из них, перекрестно реагируют при лабораторном тестировании с другим вирусом, даже если иммунизация проводится высоко очищенным вирусным препаратом. Следовательно, для постановки точного диагноза необходимо тщательно идентифицировать изолированный вирус. Именно МАт к различным антигенным детерминантам этих вирусов позволили решить эту проблему. Разработанная на основе МАт к антигенам вирусов ЭГБО, КЛО и болезни Ибараки диагностическая тест-система позволила дифференцировать эти близкородственные в антигенном отношении вирусы. Кроме того, высокая чувствительность метода ИФА на основе МАт сделала возможным обнаружение вируса КЛО непосредственно в крови больных животных и сократить сроки диагностических исследований. Тем самым это еще раз подтверждает необходимость применения методов на основе МАт в общей схеме диагностики вирусных болезней в качестве сигнальных экспрес-методов. Совершенствование гибридомной технологии и достигнутые успехи в получении продуктов моноклонов в настоящее время привели к созданию нового вида гибридом, названных квадромами, которые секретируют биспецифические МАт (би-МАт), которые оказались весьма перспективными для использования в различных областях иммунохимии, иммунодиагностики и иммунотерапии. Квадромы, полученные путем слияния клеток линий двух гибридом с продукцией моноспецифических MАт к различным антигенным детерминантам, синтезируют иммуноглобулиновые молекулы с двумя активными центрами, направленными к разным антигенам (биспецифические МАт) (рис 3.). На современном этапе развития иммунологии и онкологии всесторонне изучаются возможности использования би-МАт в качестве эффективного инструмента в противоопухолевой иммунотерапии. В настоящее время большое внимание уделяется изучению механизмов клеточной цитотоксичности и разработке на основе этих исследований подходов к лечению больных злокачественными новообразованиями и вирусными инфекциями. В ряде экспериментальных работ показано практическое применение би-МАт в диагностике и терапии различного рода патологий человека и животн  ых, а также при скрининге, анализе и мониторинге субстанций биологического происхождения. Рис.6 Схема применения би-МАт в ИФА для одноэтапного выявления антигена. Таким образом, успехи, достигнутые гибридомной технологией, наглядно свидетельствуют о том, что применение МАт позволило выйти на качественно новый уровень исследований в области ветеринарной медицины и вирусологии. Моноклональные антитела на сегодняшний день представляют собой мощный инструмент для изучения антигенных взаимоотношений, при изучении взаимодействия вирусов с клетками, вопросов иммуногенеза и механизма защитных реакций, а также эффективный инструмент для изготовления диагностических и защитных препаратов, отличающихся высокой чувствительностью, специфичностью и технологичностью. ^ В настоящее время электрофорез является одним из основных методов изучения белков. Электрофорез препаратов очищенных вирионов позволил определить их белковый и полипептидный состав. В сочетании с обработкой детергентами и другими химическими веществами изучается структурная организация вирионов. Стало возможным эффективно контролировать процессы очистки вирусов или отдельных вирусспецифических антигенов, изучать динамику и кинетику синтеза полипептидов, механизмы действия ингибиторов, различных антивирусных соединений, молекулярные фенотипы мутантов и вариантов. Применение радиомаркированных предшественников глико-, сульфо- фосфопротеинов, жирных кислот позволяет идентифицировать интересующие группы белков. В совокупности с методом иммунопреципитации определяются вирусспецифические белки в зараженных клетках, те из них, которые экспрессируются на мембранах; устанавливается специфичность моноклональных антител, вирусспецифических белков, синтезируемых генноинженерными или химическими способами; контролируется иммунный ответ животных на различные антигенные препараты. Для определения полипептидной специфичности антител используют методы радиоиммунопреципитации или иммуноблотинга. При этом следует учитывать, что радиоиммунопреципитацией выявляются антитела к конформационным и линейным детерминантам нативных белков, тогда как иммуноблотингом - только к линейным детерминантам полипептидов. Для разделения полипептидов используют метод диск-электрофореза в присутствии ионного детергента ДСН по Laemmli. При диск-электрофорезе используются буферы с различными рН, что создает прерывистые градиенты электрического потенциала и рН. Система включает крупнопористый концентрирующий гель с низким рН, расположенный над мелкопористым разделяющим гелем с высоким рН. Полипептиды быстро проходят через крупнопористый гель и концентрируются на поверхности разделяющего геля. Это позволяет получить хорошее разделение при использовании относительно больших объемов разведенных белковых растворов. Под действием ДСН в сочетании с восстановителем (2-меркаптоэтанол) и прогревом при 100 °С все белки денатурируются и разделяются на отдельные полипептидные цепи. Так как при электрофорезе в ПААГ с ДСН свободная подвижность комплексов белок - ДСН почти постоянна, молекулярные размеры таких комплексов можно определять по графику зависимости относительной подвижности от логарифма молекулярной массы. Регистрацию полос белков, маркированных 14С, 35S, 125I, осуществляют методом авторадиографии, а 3Н - флюорографии. Перед авторадиографией белков, меченных 14С и 35S; для исключения потерь энергии b-частиц при контакте с фотопленкой гели высушивают. Для регистрации тритированных полипептидов флюорографией в гель вводят сцинтиллятор, свечение которого под действием радиоактивно меченного продукта регистрируется как и при авторадиографии наложенной на высушенный гель рентгеновской фотопленкой. В качестве примера предлагаются методики определения спектров полипептидной специфичности антител в сыворотках вакцинированных собак. Методика Приготовление радиоактивно меченых белков. Двухсуточную культуру клеток CV-1, выращенную в клинских матрасах, заражают ВЧС, штамм ВНИИВВиМ-88, с множественностью 0.01 ТЦД50/клетка. Через двое суток культивирования вносят 14С-уксуснокислый натрий в конечной концентрации 2.5 МБк/см3. Через 4 суток после инфицирования в момент развития синцитиев клетки механически снимают с монослоя и дважды отмывают ФБР, осаждая при 1500 g в течение 20 мин. После однократного замораживания-оттаивания клетки лизируют 1% тритоном Х-100 в 0.02 М трис-НСl буфере с рН 7.4 в 1:100 от исходного объема. Лизат центрифугируют при 50 000 g 20 мин и хранят при минус 70 °C. Иммунопреципитацию проводят следующим образом. По 0.1 см3 протеин А-сефарозы, уравновешенной в лизирующем буфере с добавлением 1мМ фенилметилсульфонилфторида, инкубируют с 0.2 см3 исследуемых сывороток собак в течение 2 ч при (20-25) °С. Затем шестикратно отмывают лизирующим буфером, и инкубируют с (0.1-0.2) см3 радиоактивно меченого антигена в течение 18 ч при 4 °С. После шестикратной отмывки сорбент суспендируют в 0.2 см3 буфера для электрофореза, кипяят на водяной бане 5 мин и элюированные полипептиды электрофоретически разделяют в 10% ПААГ. Электрофорез. Готовят растворы: 30% Т, 2.7% С (58.4 г акриламида + 1.6 г N,N'- метилен -бис-акриламида + Н2О до 200 см3); четырехкратный буфер разделяющего геля - 1.5 М Трис-НСl c рН 8.8 (36.3 г Трис + Н2О до 200 см3, рН доводят соляной кислотой); четырехкратный буфер концентрирующего геля - 0.5 М Трис-НCl c рН 6.8 (3.0 г Трис + Н2О до 50 см3, рН доводят соляной кислотой); 10%-ный раствор ДСН (50 г ДСН + Н2О до 500 см3); инициатор - 10%-ный раствор персульфата аммония (0.1 г персульфата аммония + Н2О до 1 см3); N,N,N',N'-тетраметилендиамин (ТЕМЭД); промывочный раствор разделяющего геля - 0.375 М Трис-НCl c рН 8.8 + 0.1% ДСН (25 см3 1.5 М Трис-НCl + 1 мл 10%-ного раствора ДСН + Н2О до 100 мл); двукратный буфер для проб - 0.125 М Трис-НСl c рН 6.8 + 4% ДСН + 20% глицерина + 10% 2-меркаптоэтанола (2.5 см3 1.5 М раствора Трис-НСl с рН 8.8 + 4.0 см3 10%-ного раствора ДСН + 2.0 см3 глицерина + 1.0 мл 2-меркаптоэтанола + 0.04 см3 бромфенолового синего + Н2О до 10 см3); электродный буфер - 0.025 М Трис c рН 8.3 + 0.192 М глицина + 0.1%-ный ДСН (12 г Трис + 57.6 г глицина + 40 см3 10%-ного раствора ДСН + Н2О до 4.0 дм3); изобутанол; фиксирующий раствор - 12.5%-ный раствор трихлоруксусной (ТХУ) кислоты (125 г ТХУ + Н2О до 1,0 дм3). Компоненты для разных гелей
Концентрирующий (4% Т, 2.7%С) и разделяющий (10% Т, 2.7% С) гели готовят по данным таблицы 4. Для приготовления разделяющего геля смешивают указанные количества растворов мономеров, буфера, ДСН, воды, инициатора, смесь деаэрируют в колбе Бунзена, присоединенной к вакуумному насосу, добавляют 0.05 см3 ТЕМЭД. Смесь заливают между стеклами для формирования пластин геля. Сверху наслаивают 1 см3 изобутанола. Через 30-40 мин (после окончания процесса полимеризации) изобутанол сливают и трижды промывают край разделяющего геля промывочным раствором. Остатки раствора удаляют полосками фильтровальной бумаги. Концентрирующий гель готовят аналогичным образом, наслаивают на разделяющий гель между стеклами и вставляют шаблон в виде "гребешка". После завершения полимеризации (30-40 мин) шаблон вынимают, а камеру помещают в аппарат электрофореза. Исследуемые образцы вносят в "карманы". Электроды соединяют с источником тока, анод подключают к нижнему резервуару с электродным буфером, катод - к верхнему. Электрофорез проводят при постоянном токе (20-30 мА на гель размером 12х19х0.2 см) до тех пор, пока свидетель - бромфеноловый синий не дойдет до нижней границы геля (3-4 ч). ^ Гели с разделенными полипептидами для высушивания переносят на смоченную водой фильтровальную бумагу, укладывают бумажным слоем на пористую пластинку и помещают в аппарат для сушки. В случае отсутствия последнего пористую пластинку с гелем укладывают на перфорированную металлическую пластинку, помещают в полиэтиленовый мешок и присоединяют к вакуумному насосу. При подогревании под лампой гель высыхает за 6-8 ч. Пластинка геля становится тонкой, твердеет и в виде гладкой пленки остается на бумаге. Более простой способ высушивания геля состоит в следующем. Гель на стеклянной пластинке плотно покрывают целлофаном, края которого фиксируют, заливая агаром или парафином, и оставляют на несколько суток при комнатной температуре. Высушенные пластины геля хранят под прессом для предотвращения скручивания и другой деформации. Для получения радиоавтографов на гелевую пластинку накладывают медицинскую рентгеновскую пленку, помещают между двумя стеклянными пластинками и фиксируют зажимами. Экспонируют при комнатной температуре в течение срока, определяемого опытным путем. Полипептиды, радиоактивность которых в смеси составляет (20-50)х103 имп/мин, надежно регистрируются за 24-48 ч. После этого пленку проявляют 6-8 мин и закрепляют 5-10 мин в соответствующих растворах. Для флюорографии гель перед высушиванием фиксируют в 12.5%-ном растворе ТХУ при комнатной температуре 30 мин. Наиболее простой и экономичный способ флюорографии состоит в использовании в качестве сцинтиллятора салицилата натрия, преимущество которого в его водорастворимости. Гель вымачивают в 10 объемах 1 М водного раствора салицилата натрия в течение 30-60 мин при комнатной температуре. В качестве сцинтиллятора применяют также дифенилоксазол. Для импрегнирования этим сцинтиллятором гель вымачивают в течение 1.5 ч в двух сменах ледяной уксусной кислоты, помещают на 1.5 ч в 3-4 объема 20%-ного дифенилоксазола в уксусной кислоте, затем промывают водой. Гель при этом становится белым и непрозрачным. После высушивания гелевую пластинку экспонируют с рентгеновской пленкой при минус 70 °С. Рентгеновскую фотопленку РТ-1 или РТ-2 проявляют в (2.5 г метола + 72.0 г сульфита натрия безводного + 8.8 г гидрохинона + 48.0 г натрия углекислого безводного + 4.0 г калия бромистого + Н2О до 1.0 л); фиксируют в (260.0 г тиосульфата натрия + 50.0 г хлористого аммония + 17.0 г метабисульфита натрия + Н2О до 1.0 л). Учет результатов проводят визуально, регистрируя темные полосы на треках электрофореграмм. Иммуноблотинг. Образцы белков зараженных ВЧС клеток готовят аналогично радиоактивно меченым белкам, но без внесения радиомаркированных предшественников. 2 мг/см3 белков в растворе буферов с низкой молярностью (0.01-0.02 М) и нейтральным рН смешивают с буфером для проб в соотношении 1:1 и инкубируют в кипящей бане 2-5 мин. Электрофоретическое разделение полипептидов проводят как описано выше. Электроперенос полипептидов из полиакрилам геля на нитроцеллюлозную мембрану осуществляют по методу Kyhse-Anderson. Сборку транс-единицы выполняют в аппарате для электропереноса, в котором графитные электроды фиксируют в пластмассовых рамках, по схеме, представленной на рис.4. Размеры листков из фильтровальной бумаги делают на 2-3 мм меньше размеров геля. В процессе сборки транс-единицы тщательно удаляют воздушные пузырьки между слоями. Электроперенос осуществляют при 0.8 mA/см2 в течение 40-60 мин при 20 ОС. Качество переноса и его завершенность каждый раз контролируют путем окрашивания полоски НЦМ с 1-2 треками с маркерами молекулярной массы 0.5.% амидочерным. Иммуноблотинг осуществляют следующим образом. Свободные после электропереноса полипептидов места связывания на НЦМ забивают 5% бычьим сывороточным альбумином на отмывочном буфере (0.02 М трис-НСl, рН 7.2-7.4, 0.05 % твин-20, 0.15 М NaCl ), затем НЦМ инкубируют 2 ч при 37 °С с соответствующей антисывороткой в разведении 1:20-1:30, шестикратно ополаскивают в отмывочном буфере и заливают рабочим разведением конъюгата протеина А с пероксидазой хрена в отмывочном буфере. Через 2 ч НЦМ шестикратно отмывают и инкубируют с раствором субстрата ( 10 мг о-дианизидина, 0.07 см3 30% Н2О2 в 40 мл 0.05 М трис-НСl с рН 7.2 ). Учет результатов проводят визуально, регистрируя темные полосы на треках электрофореграмм. В том случае, если исследуемые образцы характеризуются низкой концентрацией белка, перед электрофорезом их необходимо концентрировать. Для этого применяют лиофилизацию, вакуумный диализ, диализ против высокомолекулярного гидрофильного материала (сефадекс G-100, G-200, декстран Т70), осаждение 10%-ной трихлоруксусной кислотой, ацетоном, сульфатом аммония.  1 2А   В CD E 31Рис.7. Сборка транс-единицы в аппарате для электропереноса. (1) Графитовые электроды (( + и -) фиксированные на пластиковой основе); (2) - шесть слоев фильтровальной бумаги, пропитанной в 0.040 М e-амино-n-капроновой кислоте/0.025 М трис/20% ( объем/объем ) метаноле, рН 9.4; (3) - шесть слоев фильтровальной бумаги, пропитанной в 0.3 М трис/20% ( объем/объем ) метаноле, рН10.4. Транс-единица: (А) - диализная мембрана; (В) - три слоя фильтровальной бумаги, пропитанных в 0.040 М 6 e-амно-n-капроновой кислоте/0.025 М трис/20% (объем/объем) метаноле, рН9.4; (С) - полиакриламидный гель; (D) - нитроцеллюлозная мембрана; (Е) - три слоя фильтровальной бумаги, пропитанных в 0.025 М трис/20% ( объем/объем ) метанола, рН 10.4. Занятие 25. Полимеразная цепная реакция, её возможности в диагностике инфекций. (Материал подготовлен совместно с д б н, профессором, зав лабораторие ВГНКИ Обуховым И.Л.) Цель занятия: изучить суть использования метода ПЦР Краткие теоретические сведения В настоящее время максимально ранняя диагностика возбудителей инфекций является важнейшим принципом контроля за их распространением. Обнаружение и идентификация возбудителей инфекционных заболеваний животных и птиц представляет собой одну из наиболее важных задач ветеринарной бактериологии и вирусологии. Решение этой задачи обеспечивается богатым арсеналом методических приемов, - начиная от клинических методик вирусологического и бактериологического тестирования и кончая иммунохимическими и молекулярно-биологическими методами. В каждом случае характер и сложность диагностических приемов зависят от биологии возбудителя инфекции. В отличие от растений и животных микроорганизмы как правило лишены отличительных морфологических и поведенческих свойств, позволяющих определять их принадлежность к определенным таксонам. Поэтому для идентификации патогенных микроорганизмов широко привлекаются биохимические, серологические и молекулярно-генетические подходы. Биохимический анализ выделенного возбудителя в большинстве случаев дает возможность правильно установить родовую или видовую его принадлежность. Однако существенным недостатком данного подхода является требование предварительного выделения возбудителя в виде чистой культуры. Некультивируемость микроорганизмов - главная причина, по которой культуральный метод все более и более теряет свои позиции по мере появления альтернативных подходов. При этом под некультивируемостью мы понимаем как невозможность на современном уровне развития микробиологии подобрать условия культивирования для большинства микроорганизмов, существующих в природе (по некоторым данным эта цифра может достигать 99%), так и невозможность высеять хорошо культивируемый микроорганизм из какой-либо биологической среды, содержащей ингибиторы его размножения. Кроме того, целый ряд клинически важных бактериальных возбудителей животных может плохо культивироваться из-за широкого применения в современной ветеринарной лечебной практике антибиотиков широкого спектра действия. Помимо этого, для многих возбудителей культуральный метод представляет собой трудоемкую, длительную и дорогостоящую процедуру. В то же время традиционные серологические тесты: РСК, РДП, РГА, а порой и наиболее перспективные методы диагностики - иммуноферментный анализ (ИФА) и иммуноблотинг (ИБ), оказываются фактически неэффективными или принципиально неприемлемыми для выявления инфекционных возбудителей по причине, главным образом, их низкой чувствительности. Поэтому в последнее время все большее распространение получают новейшие методы диагностики, основанные на обнаружении в исследуемых клинических образцах специфических нуклеотидных последовательностей генома микроорганизмов. Генодиагностика — это комплекс методов, которые позволяют обнаруживать гены или последовательности нуклеиновой кислоты, специфичные для определения вида возбудителя инфекционного заболевания. Генодиагностика — относительно новый раздел диагностики, возникший гораздо позже методов, основанных на микробиологических и иммунологических принципах. Поэтому возможности и области применения этого метода еще не так широко известны микробиологам и эпизоотологам. В связи с этим целью данного обзора является рассмотрение как современного состояния генодиагностики, так и областей ее применения. Это, по нашему мнению, позволит показать, что генодиагностика возникла не для того, чтобы потеснить имеющиеся микробиологические и иммунологические методы, а, наоборот, чтобы дополнить их, позволяя решать те задачи диагностики инфекционных заболеваний, которые ранее были не доступны классическим методам. Создание всего нового, в том числе и новых методов диагностики, возможно только на основе фундаментальных разработок. Становление и совершенствование генодиагностики тому яркий пример. Начиная с 1953 г., когда Дж. Уотсон и Ф. Крик опубликовали работу, посвященную структуре ДНК, стало ясно, что основной принцип, лежащий в основе всего живого – принцип комплементарности. Однонитевая цепь ДНК для образования двунитевого комплекса взаимодействует с цепью ДНК, обладающей комплементарной последовательностью. С этих пор данный принцип стал широко и успешно использоваться для решения различных, более частных проблем, в том числе и для диагностики патогенных микроорганизмов. До конца 80-х годов реакция гибридизации ДНК с ДНК была основой генодиагностики. Для проведения этой реакции необходимо было располагать клонированной последовательностью ДНК, которую использовали в качестве молекулярного зонда. Молекулярный зонд должен быть специфичным по отношению к ДНК тестируемого микроорганизма, а также желательно быть частью гена, кодирующего синтез одного из факторов патогенности. При использовании молекулярного зонда, удовлетворяющего этим требованиям, можно не только идентифицировать микроорганизм, но и давать заключение о его вирулентном потенциале и эпидемиологической значимости, что особенно важно при исследовании микроорганизмов, выделяемых из объектов внешней среды. Использование молекулярного зондирования позволило в значительной степени изменить ряд представлений о диагностике инфекционных заболеваний. Было доказано, что тестирование генов факторов патогенности во многих случаях более информативный подход по сравнению с исследованием различных фенотипических свойств, таких как определение серотипа, фаготипа, способности агглютинироваться в присутствии специфических сывороток, которые далеко не всегда отражают корреляционные связи с вирулентностью исследуемого микроба. Однако метод генодиагностики, основанный на реакции гибридизации ДНК с ДНК, не отличается высокой чувствительностью и позволяет обнаруживать 104-105 мишеней (это могут быть бактериальные клетки, вирусные частицы или очищенная нуклеиновая кислота) в пробе. В связи с этим данный подход является мало информативным при диагностике тех инфекционных состоянии, при которых концентрация микробов ниже порога чувствительности метода, а сами микробы в силу тех или иных причин не размножаются в лабораторных условиях. С такими ситуациями микробиологам приходиться сталкиваться повсеместно: например при диагностике хронических инфекционных состоянии, обусловленных персистенцией бактерий или вирусов. Те же трудности приходится преодолевать при идентификации практически всех внутриклеточных паразитов, таких как вирусы, риккетсии, хламидии, микоплазмы, требующих для своего культивирования или очень сложных питательных сред, или же клеточных, или тканевых культур.) Следующим шагом фундаментальной науки — молекулярной биологии гена — было создание способа исследования, получившего название полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющего не только преодолевать вышеперечисленные трудности, но и открывающего новые возможности при лечении и эпидемиологическом анализе инфекционных заболеваний. Принцип ПЦР был описан в 1986 г. К. Мullis, получившим за это Нобелевскую премию в 1993 г. В основе этого метода лежит многократное копирование с помощью фермента ДНК-полимеразы определенного фрагмента ДНК, который является маркерным для данного вида. Механизм копирования таков, что комплементарное достраивание нитей может начаться не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках — коротких двунитевых участках. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют затравки, представляющие собой специально синтезированные in vitro олигонуклеотиды длиной около 20 нуклеотидов, называемые праймерами. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой, протекает только между ними. В результате происходит экспоненциальное увеличение количества копий специфического фрагмента по формуле 2n, где п — число циклов амплификации. Поскольку праймеры входят в состав амплифицируемого фрагмента, его размер определяется числом олигонуклеотидных пар между 5'-концами праймеров. Обычно размер фрагмента составляет несколько сотен нуклеотидных пар. Построение новых ДНК нитей из дезоксирибонуклеотидтрифосфатов осуществляет фермент термостабильная ДНК-полимераза, называемая Таq-полимеразой. Процесс амплификации заключается в повторении циклов амплификации, состоящих из денатурации ДНК (1 мин), отжига праймеров (1—2 мин) и построения фрагмента (1—2 мин). В результате 30—35 циклов амплификации синтезируется 108 копий фрагмента, что делает возможным визуальный учет результатов после электрофореза в агарозном или акриламидном геле. Использование термостабильной ДНК-полимеразы позволило автоматизировать процесс амплификации с помощью специального прибора, называемого термоциклером. Этот прибор автоматически осуществляет смену температур согласно заданной программе и числу циклов амплификации. Таким образом, ПЦР аналогична росту бактерий на искусственных питательных средах — процессу биологической амплификации, при которой одна микробная клетка, образуя видимую колонию, амплифицируется в 105—106 раз, давая возможность определить свойства бактерии, манипулируя уже с целой колонией. Как и питательные среды, которые могут быть селективными, поддерживающими рост только одного микроорганизма, или обогатительными, дающими возможность размножаться широкому кругу микробов, так и праймеры, определяющие специфичность ПЦР, могут быть строго видоспецифичными или с их помощью можно выявить целые роды или семейства микроорганизмов. Но в то же время ПЦР имеет принципиальное преимущество перед культуральными методами. Диагностические потенции ПЦР не ограничены способностью микроба расти на искусственных средах или в культуре клеток. Поэтому основное преимущество ПЦР перед культуральными методами состоит не в высокой чувствительности ПЦР-метода (так как чувствительность этих методов сопоставима), а в способности идентифицировать и определять свойства тех микроорганизмов, которых не удается по тем или иным причинам размножать в лабораторных условиях. Здесь уместно отметить, что идентификационные тест-системы, основанные на ПЦР, разрабатываются для микроорганизмов с известными к данному моменту последовательностями ДНК в интересующих генах. Наивысшая чувствительность ПЦР обычно достигается при работе с чистой культурой микроба или, что еще лучше, с очищенной нуклеиновой кислотой. Эта чувствительность автоматически не трансформируется в чувствительность метода при работе с клиническим материалом. На успех определения при работе с этим материалом влияют такие факторы, как методика приготовления образца, возможное присутствие ингибитора фермента, осуществляющего амплификацию, объем образца при низких концентрациях тестируемых молекул. Наибольшее внимание среди этих методов привлекает полимеразная цепная реакция (ПЦР) в основе которой лежит многократное повторение циклов удвоения (амплификация) специфического участка нуклеотидной последовательности. Главное достоинство метода - очень высокая чувствительность: в результате амплификации концентрация специфической олигонуклеотидной последовательности в реакционной пробе возрастает в десятки миллионов раз. За последние 10 лет достигнут значительный прогресс в изучении молекулярной основы наследственных болезней и в их диагностике с помощью молекулярного анализа ДНК- В первую очередь это относится к болезням, которые вызваны мутацией в одном гене (моногенным). Каждый год увеличивается список наследственных болезней, которые могут быть выявлены методами анализа последовательности нуклеиновых оснований хромосомной ДНК. Появилась возможность с помощью исследования образцов ДНК поставить диагноз наследственного заболевания еще до появления клинических симптомов или в пренатальный период. Это позволяет выявить носителей мутантного гена при аутосомно-рецессивных болезнях, а также распознать фенотипически сходные, но генетически различные заболевания . В настоящее время расширяется сфера применения этих методов. Помимо диагностики болезней с установленным типом наследования, они начинают использоваться для изучения и мультифакториальных заболеваний (коронарная болезнь сердца, сахарный диабет, опухоли и др.), а также для идентификации личности, установления отцовства и др.  Особую диагностическую ценность ДНК-анализ приобретает при тех наследственных болезнях, при которых неизвестен биохимический дефект, лежащий в их основе, и которые поэтому не могут быть выявлены традиционными методами лабораторной диагностики. Кроме того, этот метод практически незаменим в тех случаях, когда патологический ген оказывает свое действие только в тканях, которые недоступны для исследования (мозг, печень).Ключом к расширению клинического применения достижений современной молекулярной генетики являются не только разработка методов рекомбинантной ДНК, но и значительное упрощение технологии проведения ДНК-анализа, повышение чувствительности, быстроты и надежности методов с их последующей автоматизацией. Остановимся теперь более подробно на основных этапах технологии анализа.  ^ Геномную ДНК выделяют с помощью многоступенчатых методов из тканей, содержащих ядерные клетки, в том числе из лимфоцитов периферической крови, лимфобластоидных клеточных линий, а также из амниоцитов и ворсин хориона плода, полученных путем биопсии. Кровь для исследования берут в количестве около 10мл с антикоагулянтом: цитратом, глюкозоцитратным раствором (глюгициром) или ЭДТА. В большинстве лабораторий ДНК выделяют из взятых образцов в тот же день, но их можно и хранить при температуре —20°С . Первым этапом анализа ДНК является ее экстракция из тканей по стандартному методу. Клетки крови (или ворсин хориона) гемолизируют, обрабатывают протеиназой К в течение ночи для расщепления белков, экстрагируют сопутствующие вещества фенолом и хлороформом и осаждают нуклеиновые кислоты этанолом. Методы экстракции ДНК постоянно совершенствуются, разрабатываются различные модификации, направленные на ускорение и повышение эффективности методов, а также использование менее вредных для исследователя реактивов. Количество и чистота препарата ДНК оцениваются спектрофотометрически. Экстрагированная ДНК стабильна и может храниться неопределенно долгое время. Это имеет большое значение, так как образцы от людей с генетическими заболеваниями могут быть собраны и сохранены для будущих сопоставлений при обследовании других членов семьи, а также для проведения повторных исследований после получения ДНК-проб нового поколения. Обычно образцы ДНК дублируются и хранятся раздельно в двух морозильниках. Хранение ДНК обеспечивает возможность ДНК-диагностики в семьях, в которых пожилые или страдавшие наследственными заболеваниями родственники умерли до того, как стало возможным предсказательное тестирование. В случаях, когда пораженные родственники уже умерли и ДНК лейкоцитов недоступна для анализа, оказалось возможным использовать замороженную ткань мозга, взятую на аутопсии. Для радиоизотопного анализа по Саузерну обычно требуется 5—10 мкг геномной ДНК, что составляет около 2-10–18 мол. Такое количество ДНК присутствует приблизительно в 106 ядерных клеток, которые могут быть выделены менее чем из 1 мл крови, а в случае пренатальной диагностики — из биоптата ворсин хориона или из амниоцитов. Еще меньшее, крайне незначительное количество ДНК необходимо в тех случаях, когда анализу предшествует амплификация (умножение) участка ДНК-мишени с помощью недавно разработанного метода, использующего повторные циклы полимеразной цепной реакции (ПЦР). В настоящее время используется несколько способов подготовки образца для проведения ПЦР. Процедура подготовки пробы включает лизис микроба и экстракцию нуклеиновой кислоты. С целью разрушения микробной клетки используют простое кипячение, замораживание—оттаивание в присутствии лизоцима, а также специальные лизирующие буферы, содержащие детергенты и протеиназу. Выбор метода, как правило, диктуется природой микроба, а точнее природой его клеточной стенки. Для экстракции ДНК используют два основных метода. Во-первых, классическую процедуру фенольно-хлороформной экстракции. При этом достигается хорошая очистка ДНК и в первую очередь от ингибиторов Таq-полимеразы, но неизбежны большие потери нуклеиновой кислоты, особенно заметные при работе с образцами небольшого объема с низкой концентрацией инфекционного агента. Другой способ, применяемый для очистки нуклеиновой кислоты, основан на использовании нуклеосорбентов. Подготовка материала с применением нуклеосорбента занимает меньше времени и более проста в исполнении, хотя не всегда может гарантировать удаление возможных ингибиторов. Зная возможности и преимущества этого метода, сформулируем те направления исследований в инфекционной патологии, в решении которых ПЦР начинает играть ведущую роль: — диагностика хронических инфекционных состояний, обусловленных персистенцией бактерий или вирусов, — наиболее очевидная область применения ПЦР в диагностических целях; — ПЦР — незаменимый инструмент при идентификации и молекулярно-генетических исследованиях практически всех внутриклеточных и мембранных паразитов, таких как вирусы, риккетсии, хламидии, микоплазмы; — ПЦР является наиболее эффективным способом выявления и изучения возбудителей сапронозов, которые, находясь во внешней среде в "некультивируемом" состоянии, способны там сохраняться, переживая неблагоприятные внешние условия в межэпидемические периоды; — ПЦР позволяет проводить определение антибиотикорезистентности у медленно растущих и труднокультивируемых бактерий; — технология ПЦР коренным образом изменила способы маркирования штаммов для целей эпидемиологического анализа, тем самым расширив его возможности. Теперь обратимся к конкретным примерам, которые показывают, как технология ПЦР позволяет решать перечисленные выше задачи. На настоящий момент преимущество ПЦР-анализа перед "золотым стандартом" (так красиво называют культуральный метод выявления бактерий и вирусов) состоит в следующем: 1) более высокая частота обнаружения микроба, превышающая культуральный метод на 6— 7%. Эти различия объясняются возможной гибелью микроба при хранении и транспортировке, тогда как ПЦР способна обнаруживать и нежизнеспособные формы микроорганизма; 2) время, необходимое для обнаружения микроба культуральным методом, составляет около 4-6 сут., тогда как при использовании ПЦР через 4—5 ч; 3) использование технологии ПЦР позволяет проводить определение инфекционного агента в образцах, взятых неинвазивным путем. Одной из наиболее интересных сфер приложения ПЦР в эпидемиологии является использование этой технологии для мониторинга объектов внешней среды. Помимо решения чисто прикладных задач (усовершенствование методик обнаружения возбудителей в пробах воды, почвы и т. д.) в этой области, ПЦР является важным инструментом для получения фундаментальной информации о способах поддержания жизнеспособности микроорганизмов вне связи с организмом животного или человека. За последние 5—7 лет накоплен достаточно обширный материал, свидетельствующий о способности многих видов патогенных бактерий переходить в так называемое некультивируемое состояние. Формирование некультивируемых форм бактерий сопровождается глубокими перестройками метаболизма и изменением морфологии бактериальной клетки. В результате клетки бактерий, сохраняя жизнеспособность, перестают делиться и, будучи перенесены на плотную питательную среду, не формируют колоний. Однако переход в некультивируемое состояние не является необратимым, и под воздействием изменяющихся условий внешней среды некультивируемые клетки бактерий могут восстанавливать способность к пролиферации. Очевидно, что некультивируемые формы бактерий нельзя выявить традиционными микробиологическими приемами, включающими посевы из исследуемых образцов на плотные питательные среды. Микроскопия с использованием витальных красителей в данном случае может служить лишь инструментом изучения формирования некультивируемых форм в лабораторном эксперименте. Показано, что переходить в некультивируемое состояние могут возбудители многих заболеваний человека. Переход в некультивируемое состояние представляет собой способ поддержания жизнеспособности в неоптимальных для активного роста условиях. Эта способность обнаруживается в первую очередь у патогенных бактерий—сапрофитов. Диагностика заболеваний, вызванных многими из подобных инфекционных агентов, успешно обеспечивается традиционными методами. Однако единственным в настоящее время методическим подходом, способным доказать присутствие в образце некультивируемых форм возбудителя, является ПЦР. При использовании такого подхода продемонстрировано, что эндемичность ряда природных очагов объясняется способностью возбудителей сапронозов сохраняться в объектах внешней среды в некультивируемом состоянии. Это положение, по нашему мнению, чрезвычайно важно для всей системы эпизоотоологического надзора, так как дает возможность, используя технологию ПЦР, выявлять потенциально опасные штаммы возбудителей сапронозов раньше, чем они попали в человеческую популяцию и вызвали эпидемиологическое осложнение. Большое значение приобретает метод ПЦР при контроле продуктов питания. Таким образом, технология ПЦР является мощным инструментом, обеспечивающим возможность фундаментального изучения хронических инфекционных процессов и экологии возбудителей инфекционных заболеваний. ПЦР — это метод амплификации in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определенную последовательность ДНК в количестве, превышающем исходную в 108 раз. При амплификации с помощью ПЦР используют два олигонуклеотидных праймера (затравки), фланкирующие участок ДНК, специфический для определяемого возбудителя, процесс амплификации заключается в повторяющихся циклах температурной денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и последующей достройки полинуклеотидных цепей с этих праймеров ДНК-полимеразы. Праймеры ориентированы таким образом, что синтез с помощью полимеразы протекает только между ними, удваивая количество копий этого участка ДНК. Амплифицированный участок именуют "ампликоном". В результате происходит экспоненциальное увеличение количества специфического фрагмента приблизительно по формуле 2n, где n — число прошедших циклов амплификации. Поскольку праймеры физически включаются в концы продуктов застройки, они детерминируют сам продукт реакции — фрагмент ДНК, равный по длине расстоянию между 5-концами праймеров на исследуемом участке ДНК. Процесс амплификации идет эффективно, если использовать термостабильную ДНК-полимеразу, выделенную из бактерии Thermus aquaticus (Tag). К достоинствам указанной полимеразы относится то, что нет необходимости ее замены после каждого цикла, а также сравнительно высокий температурный оптимум детерминируемой ею реакции (70— 75°С). Праймеры для ПЦР обычно имеют длину, как правило, около 20 нуклеотидов. Рассмотрим основные характеристики ПЦР-анализа. Надежность — защищенность анализа от ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Ложноположительный результат анализа является следствием заражения образца или реактивов ДНК исследуемого образца или, что бывает чаще, амплификатом. В связи с этим необходимо пространственное разделение диагностической лаборатории как минимум на три блока: в одном из них проводить приготовления ДНК-образца, в другом — постановку амплификации и в третьем — электрофорез и индикацию. Перенос реактивов и оборудования между блоками должен быть исключен. Достаточным контролем является отсутствие сигнала для образца с заведомо отсутствующей ДНК исследуемого образца. Ложноотрицательный результат может быть вызван тривиальными причинами: недостаточной чувствительностью реакции, ошибками оператора в выделении ДНК и проведении амплификации и др. Поэтому в каждой серии анализов присутствует положительный контроль — образец с заведомо присутствующей матрицей для данных праймеров, например хромосомная ДНК искомого возбудителя инфекции. Кроме того, причиной ложноотрицательного результата может быть присутствие в образце ингибиторов реакции. При использовании всех указанных контролей, надежного оборудования и жестко стандартизованных реактивов метод ПЦР высоконадежен. Чувствительность анализа характеризуется очень низкой концентрацией клеток или вирусных частиц в пробе, дающей положительный результат анализа, и определяется эффективностью методики выделения ДНК возбудителя, чувствительностью собственно ПЦР и чувствительностью выбранного метода индикации. Метод выделения ДНК должен быть еще дешевым и простым. ПЦР при оптимальных условиях крайне чувствительна: в модельной системе в сочетании с блотгибридизацией с радиоактивно меченным ДНК-зондом удается зарегистрировать 3—5 копий генома цитомегаловируса в пробе. Достигаются оптимальные условия подбором температурно-временного режима, концентрации ионов магния, праймеров и фермента в реакционной смеси, применением при необходимости "горячего старта" — добавления фермента в реакционную смесь, уже прогретую до температуры плавления ДНК. Достигнуть предельно высокой чувствительности при самых простых методах индикации позволяет и четырехпраймерная амплификация (ЧПА). ЧПА реализует принцип "русской матрешки": вначале пара "внешних" праймеров запускает синтез первого ампликона, затем после нескольких циклов пара праймеров, комплементарных внутренним последовательностям первого ампликона, запускает синтез второго, меньшей длины. В модельных системах при диагностике цитомегаловируса ЧПА в сочетании с электрофорезом в ПААГ и окрашиванием бромистым этидием дает возможность уверенно регистрировать порядка 10 геномов в пробе. Предел чувствительности ПЦР-диагностикума инфекционных заболеваний (при условии использования 100 мкл клинического образца) в 100—1000 возбудителей в 1 мл. Такой чувствительности могут достигать только культуральные методы диагностики. Важным параметром является избирательность анализа — способность диагностикума выявлять возбудителей инфекции конкретного вида на фоне любых других микроорганизмов, вирусов и клеток организма хозяина. С этой точки зрения возможности ПЦР-диагно-стикумов уникальны: соответствующим образом выбранная последовательность ДНК мишени (выбор праймеров) позволяет в зависимости от целей диагностикума выявлять вид и отдельные штаммы микроорганизмов. Уникальность метода обусловлена тем, что он обладает самой высокой чувствительностью и специфичностью, превосходящими получаемые культуральным методом. Учитывая продолжительность и трудоемкость процедуры выращивания культуры клеток (до месяцев), преимущества ПЦР (5—8 ч) очевидны. Специалистами фирмы проведена сравнительная оценка эффективности метода ПЦР по сравнению с традиционными методами, показаны преимущества и ограничения применения метода в клинической практике. Так, проведено сравнение результатов ПЦР-анализа и нерадиоизотопного гибридизационного анализа клинических образцов на содержание хламидия трахоматис и уреаплазма уреалитикум с использованием в качестве метки комплексов платины и показано хорошее совпадение результатов, полученных указанными методами ДНК-диагностики. Исследованиями в ряде ведущих лабораторий мира на примере обнаружения в биологических пробах хламидия трахоматис показано, что методом ПЦР или лигазной цепной реакции определяют на 10—20% больше положительных проб, чем культуральным методом или подтверждающими некультуральными методиками. Методом ПЦР в клиническом материале (соскоб клеток эпителия) нами обнаружено наличие двух биоваров уреаплазма уреалитикум. Важным параметром является избирательность анализа — способность диагностикума выявлять возбудителей инфекции конкретного вида на фоне любых других микроорганизмов, вирусов и клеток организма хозяина. С этой точки зрения возможности ПЦР-диагностикумов уникальны: соответствующим образом выбранная последовательность ДНК мишени (выбор праймеров) позволяет в зависимости от целей диагностикума выявлять вид и отдельные штаммы микроорганизмов. ^ Как правило, это соскоб эпителиальных клеток со слизистой цервикального канала или уретры, могут использоваться слюна, выделения, моча, у детей — соскоб с миндалин. Собранный биоматериал желательно сразу использовать для анализа. Хранить биоматериал можно при —20°С не более 0,5 мес. Соскоб из цервикального канала желательно брать в середине менструального цикла. У лиц, принимающих антибиотики, уросептики, наркотические вещества, взятие биологического материала для анализа следует производить через 14 сут после их отмены. ЗАО "ВСМ" производит набор лабораторных изделий и поставляет "под ключ" диагностические центры для ПЦР-диагностики, обеспечивает гарантийное и постгарантийное обслуживание оборудования, проводит обучение методу. Минимальный набор состоит из следующих приборов: 1. Термостат, программмируемый для проведения ПЦР-анализа "ВСМ" (рекомендован к применению в медицинской практике Минздравом РФ), — прибор для проведения амплификации (умножения) детектируемого участка генома возбудителя заболеваний. Прибор рассчитан на одновременный анализ 24 образцов (из которых один положительный и один отрицательный контроль) клинического материала. 2. Термостат 2Т001 ("ВСМ") — предназначен для термостатирования биологических проб. 3. Настольная миницентрифуга (Элми) — предназначена для подготовки проб исследуемого клинического материала. Обеспечивает максимальную частоту вращения ротора 14 000 об/мин. 4. Микроцентрифуга-вортекс МВ01 ("ВСМ") — предназначена для низкооборотного центрифугирования и ресуспендирования биологических проб. 5. Источник питания низковольтный "ИП-01" ("ВСМ") — предназначен для серийного анализа биологических образцов при помощи электрофореза при двух фиксированных значениях напряжения. 6. Камера для электрофореза КЭ-01 ("ВСМ") — предназначена для проведения исследования биомедицинских проб методом электрофореза в агарозном геле. 7. Трансиллюминатор ТР-01 ("ВСМ") — источник ультрафиолетового излучения, предназначен для исследования люминесцирующих следов в жидкостях и гелях. В состав набора входят микродозаторы, подставки и коробочки для пробирок типа Эппендорф. Возможно комплектование диагностических центров любым отечественным и зарубежным оборудованием, программируемый термостат может снабжаться стабилизатором, а трансиллюминатор фотоаппаратом или монитором, компьютером для архивации результатов. ЗАО "ВСМ" обеспечит Ваших специалистов необходимыми методическими материалами, проводит консультирование по лицензированию и интерпретации полученных результатов. Одной из основных задач мы видим в пропаганде возможностей метода, внедрение его в сегодняшних непростых условиях в медицинскую практику. В России и странах СНГ уже работают десятки лабораторий, поставленных ЗАО "ВСМ". Суммируя преимущества использования тест-систем на основе метода ПЦР, необходимо отметить: 1. Метод позволяет обнаруживать патогенные для человека бактерии и вирусы в тех случаях, когда другими способами это сделать невозможно. 2. Для диагностики практически всех известных в настоящее время заболеваний может быть использован один набор приборов и незначительно отличающиеся для разных инфекций наборы реактивов, что обусловлено химическим сродством нуклеиновых кислот. Появляется возможность создания для многих биологических жидкостей и возбудителей создания универсальной процедуры приготовления пробы, выделения ДНК и постановки реакции. 3. Отпадает необходимость в средах, клеточных культурах, узкой специализации медицинского персонала. ПЦР-диагностикумы дают возможность избежать проблем, связанных с перекрестно реагирующими антигенами. 4. Возможен анализ серонегативных пациентов на самых ранних стадиях инфекционного процесса, когда лечение наиболее эффективно. 5. Легко определяются патогенные возбудители, для которых не разработаны или затруднены методы культивирования, а также для персистирующих форм патогенных бактерий. 6. Метод позволяет поставить надежный диагноз в течение рабочего дня, т. е. за 6—8 ч. 7. Метод обладает высокой чувствительностью (до 1—5 копий возбудителя в пробе) и специфичностью (различают серологические штаммы). 8. Проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы: обычно несколько микролитров. 9. Возможна одновременная диагностика нескольких возбудителей заболеваний в одной пробе. 10. Стоимость одного анализа при использовании отечественных приборов и реактивов сопоставима со стоимостью одного анализа иммуноферментным методом. В настоящее время ученые разных стран мира прилагают усилия для дальнейшего развития метода ПЦР: упрощения и автоматизации анализа, возможности синтеза больших фрагментов нуклеиновых кислот, расширения приложений метода. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) имеет крайне высокую аналитическую чувствительность и позволяет идентифицировать патогенные микроорганизмы на любом филогенетическом уровне. Это обусловило его широкое применение в диагностике возбудителей инфекционных заболеваний с/х животных. В то же время высокая 'чувствительность метода при неправильном его использовании может привести к снижению специфичности ПЦР-анализа. Главной проблемой здесь является случайный перенос (контаминация) следовых количеств ДНК активной в ПЦР (специфических продуктов амплификации ДНК - «ампликонов», положительного контрольного образца, ДНК клинического образца, содержащего возбудитель) в реакционную пробирку, не содержащую возбудитель и как следствие появление ложноположительных результатов ПЦР. Сотрудники практической ПЦР-лаборатории в своей работе сталкиваются с двумя основными видами контаминации: 1) перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложно-положительных результатов; 2) контаминация продуктами амплификации (ампликонами), имеющая наибольшее значение, поскольку в процессе ПЦР ампликоны накапливаются в огромных количествах и являются идеальными продуктами для реамплификации. Необходимо также указать еще на две, часто встречающиеся, Причины контаминации. Одна из них связана с тем, что вблизи или даже в самом помещении, предназначенном для ПЦР, производится параллельная микробиологическая диагностика одноименных возбудителей инфекций или оба вида анализа выполняются одними и теми же сотрудниками. При этом контаминирущим материалом может стать ДНК, получаемых в больших количествах в процессе микробиологического наращивания возбудителей. В научно-исследовательских учреждениях, занятых в разработке ПЦР-методик или организациях производящих ПЦР-тест-системы к вышеперечисленным источникам контаминации, может добавится контаминация рекомбинантными плазмидами, содержащими фрагменты генов мишеней для ПЦР, изготовляемых в качестве положительных контрольных образцов. Среди всех вариантов контаминации наиболее часто встречающимся является контаминация «ампликонами» посуды, автоматических пипеток и лабораторного оборудования, поверхностей лабораторных столов или поверхности кожи сотрудников лаборатории, что приводит к появлению систематических ложноположительных результатов. Как правило, выявление ; источника контаминации представляет, собой трудоемкую задачу, требующую- затрат времени и средств. Накопленный к настоящему моменту опыт работы ведущих лабораторий ПЦР-дигностики инфекций позволяет сформулировать основные требования к планировке помещений и правила проведения самих анализов. Строгое соблюдение данных требований значительно снижает риск контаминации и получения ложноположительных результатов. Планировка помещений и основные принципы организации работы ПЦР-диагностичвских лабораторий 1). Лаборатория должна быть разделена на зоны или комнаты для каждой из стадий ПЦР-диагностики. Следует иметь не менее двух комнат: - ПЦР-помещение, где выделяются Зона 1 - для проведения обработки клинических образцов и Зона 2 - для приготовления реакционной ПЦР-смеси и внесения выделенных проб ДНК (при наличии условий Зону 1 и Зону 2 рекомендуется организовать в разных комнатах); - в ПЦР-помещений запрещается проводить все другие виды работ с инфекционными агентами (микробиологический анализ, ИФА, и т.д.), ПЦР-диагностика которых проводится в данной лаборатории. - пост-ПЦР-помещение, где проводится детекция продуктов амплификации; - в пост-ПЦР-помещении допускается использовать другие методы детекции инфекций, диагностика которых проводится в данной лаборатории. 2). Комнату детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение) следует располагать как можно дальше от ПЦР-помещений. 3). Следует исключить движение воздушного потока из пост-ПЦР в ПЦР-помещения. 4). Обработка клинических образцов должна производиться в ламинарном шкафу или настольном ПЦР-боксе, снабженном ультрафиолетовыми лампами. 5). Работа в лаборатории должна быть организована в одном направлении: ПЦР-помещений к пост-ПЦР-помещению. 6). Каждое помещение ПЦР-диагностической лаборатории должно иметь свой набор реагентов, автоматических пипеток, наконечников, пластиковой и стеклянной посуды, лабораторного оборудования, халатов и перчаток, используемых только в данном помещении и не выносящиеся в другие ПЦР-помещения. Оборудование, материалы и инвентарь в каждой комнате должны иметь соответствующую маркировку. 7). Следует однократно использовать перчатки как в комнате обработки клинических образцов, так и в комнате приготовления реакционной смеси и постановки ПЦР. 8). Необходимо однократно использовать пробирки и наконечники для автоматических пипеток. Обязательно менять наконечники при переходе от одной пробы к другой с целью предотвращения перекрестной контаминации в процессе выделения ДНК или при раскапывании реакционной смеси. 9). Целесообразно использовать наконечники для автоматических пипеток аэрозольным барьером (или наконечники с ватными фильтрами, приготовленными в помещении, в котором не ведутся работы с ДНК) при обработке клинических образцов, а также при внесении выделенной ДНК в реакционную пробирку. 10). Каждый сотрудник лаборатории должен иметь персональный набор автоматических пипеток и реагентов. 11). Клинические образцы должны храниться отдельно от реагентов. 12). Не следует использовать водяные бани, так как заполняющая их вода, просачиваясь в недостаточно плотно закрытые пробирки, может стать источников контаминации; следует использовать суховоздушные термостаты. 13). При исследовании материала зараженного или подозрительного на зараженность возбудителями инфекционных заболеваний I-IV групп, работа должна проводиться с соблюдением "Санитарных правил СП 1.2.011-94 (Безопасность работы с микроорганизмами 1-II групп патогенности)" и "Положения о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактерийных токсинов, ядов биологического происхождения", М.,1980. 14). Необходимо постоянно поддерживать чистоту на рабочем месте: - каждое помещение должно иметь свой отдельный набор инвентаря для обработки и уборки рабочего места (ватно-марлевые тампоны, пинцет, дезинфицирующий раствор и т.д.), и источники ультрафиолетового излучения, которые эффективно инактивируют ДНК-матрицы. - при манипуляциях с клиническим материалом рабочую поверхность до и после исследования обрабатывают дезинфицирующим раствором (указанным для данного возбудителя). - следует обрабатывать рабочую поверхность в комнате приготовления реакционной смеси до работы с целью борьбы с пылью. 15). Следует полностью исключить проведение в ПЦР-диагностической лаборатории работ, связанных с получением (клонированием) и выделением рекомбинантных плазмид, содержащих последовательности ДНК или фрагментов генов возбудителей которые диагностируются данной лаборатории. 16). Персонал, работающий в ПЦР-диагностической лаборатории должен пройти соответствующее обучение. ^ Обработка клинических образцов 1). Забор клинических образцов необходимо производить только одноразовые стерильные пластиковые пробирки или в стеклянные пробив предварительно обработанные в течение 1 часа хромовой смесью, тщател промытые дистиллированной водой и прокаленные. 2). Работать только в одноразовых перчатках. 3). Необходимо использовать одноразовые наконечники для автоматичес пипеток с аэрозольным барьером. 4). Обязательно менять наконечники при перехода от одной пробы к другой 5). Использованные пробирки и наконечники повторно не используются, должны сбрасываться в одноразовые контейнеры или в специальную емкость с раствором соляной кислоты. Постановка ПЦР 1). Работать только в одноразовых перчатках. 2). Следует готовить смесь реактивов для ПЦР, рассчитанную на все прс включая контрольные, и затём - раскапывать ее по пробиркам. 3). Использовать автоматические пипетки с переменным объемов/ одноразовые наконечники. 4). В каждый данный момент работать только, с одной пробиркой. 5). Во всех случаях постановки ПЦР следует обязательно примеь • отрицательные и положительные контроли в соответствии с методическ указаниями или инструкцией по применению диагностических наборов. 6). Подготовленные к ПЦР исследуемые образцы должны добавлятьс реакционные смеси одноразовыми наконечниками с аэрозольным барьеро! последнюю очередь. Использованные наконечники следует сбрасывать в емкое 1 М раствором НС1. Детекция продуктов амплификации 1). Анализ продуктов ПЦР должен производиться в изолированной ком» сотрудником лаборатории. 3). Оборудование, реактивы, халаты, перчатки, а также инвентарь, используемые в комнате детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение), •должны находиться только в этой комнате и не должны попадать в ПЦР-помещения. Использование физических и химических методов борьбы с контаминацией 1). Рабочие поверхности, оборудование и материалы следует облучать ультрафиолетом с максимумом излучения в области 260 нм. Облучение необходимо проводить в течение 45 мин. до начала работы и в течение 45 мин. после окончания работы. 2). Использованные наконечники для автоматических пипеток, пробирки и другие загрязненные ДНК материалы необходимо обрабатывать реагентами, вызывающими деградацию ДНК (1 М НС1, 10% типохлоритом натрия или 10% хлорной известью). Оценка качества работы ПЦР-диагностической лаборатории Для оценки качества работы ПЦР-диагностической лаборатории следует периодически применять зашифрованные внутрилабораторные контрольные положительные и отрицательные образцы, охарактеризованные не только с помощью полимеразной цепной реакции, но и другими методами диагностики данной инфекции. ^ ПЦР – полимеразная цепная реакция дцРНК – двухцепочечная РНК дцДНК – двухцепочечная ДНК ИФА (ЭЛИСА) – иммуноферментный анализ ИБ – иммуноблотинг ИФ – иммунофлюоресцентный анализ HPLC – жидкостная хромотография высокого давления ОП ПЦР – обратная транскрипция с последующей полимеразной цепной реакцией ПДРФ – полиморфизм длин фрагментов рестрикции РН – реакция нейтрализации Э/Фв ПААГ – электрофорез в полиакриламидном геле НК – нуклеиновые кислоты ГА – гибридизационный анализ Тад – термостабильная ДНК-полимераза, выделенная из бактерии Thermus aquqticus "Горячий старт" – добавление фермента в реакционную смесь, уже прогретую до температуры плавления ДНК ЧПА – четырехпраймерная амплификация "Затравка" – два олигонуклеотидных праймера фланкирующих участок ДНК, специфический для определяемого возбудителя, длиной около 20 нуклеотидов "Ампликон" – амплифицированный (захваченный) участок с помощью специфических праймеров "Золотой стандарт" – культуральный метод выявления инфекционного агента, бактерий, вирусов, простейших и т.д. ВГС – вирус гепатита С Биот – отпечаток фрагмента ДНК, перенесенный с геля на мембрану Инсерт-ДНК – проба, выделенная путем расщепления ее рестриктазой, чтобы высвободить необходимую последовательность внедренного фрагмента Информативность – гетерозиготность по маркеру Термоциклер - устройство, позволяющее одновременно применять метод ПЦР, для 48 проб, увеличивая количество индивидуальных ДНК-сегментов в миллион раз в течение 4 часов. Полимераза Кленова – фрагмент ДНК-полимеразы IE.coli, имеющий оптимум синтетической активности при 37С. ТТ-ДНК – полимераза, выделенная из Termus Termophilus, обладает сходными свойствами с Тад-полимеразой Паттерн – картина амплифицированованной ДНК в геле Тох+ - токсигенные штаммы н.п – нуклеотидные пары "Гнездовая ПЦР" – модифицированный метод ПЦР, позволяющий избежать стадии ДНК-гибридизации при подтверждении специфичности полученного продукта ПЦР. Литература.Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г., Болтовская М.Н. Гибридомы и моноклональные антитела в биотехнологии и медицине/ Биотехнология.- 1989, 20: 138 Моноклональные антитела. Гибридомы: новый уровень биологического анализа: Пер. с англ./ Под ред. Кеннета Р.Г., Маккерна Т.Д., Бехтол К.Б. – М.: «Медицина», 1983. – 416.: Петров Р.В. Иммунология. – М., «Медицина», 1982 Рингерц Н., Сэвидж Р. Гибридные клетки. М., Мир, 1979. Новые методы иммуноанализа. Под редакцией У.П. Коллинза. М. «Мир.» 1991. Гринин А., Рыбаков С., Радиоиммунологический анализ. –М. Энергоатомиздат., 1984., с 3. Ткачева Г., Балабокин М., Ларичева И. Радиоиммунохимичские методы исследования. –М. Медицина, 1983, с. 72 -75. Чард Т. Радиоиммунологические методы. –М., 1981. Иммунологические методы, под редакцией Фримеля, –М., 1975, с.432 – 434. Ванеева Л., Цветкова Н. Иммуноферментный метод, его настоящее и будущее.// Иммунология.,1980, №2, с. 13-19. Воллер А., Бидуелл Д. Иммуноферментные реакции в диагностической медицине. /Теория и практика// Бюлл. ВОЗ, 1977, т.53, N:1, с. 38-48. Гаврилова Е. Гомогенный иммуноферментный анализ – новое направление иммунохимии //Ж. Всес. хим. о-ва., 1982, т. 27, N:4, с.450-457. Дзантиев Б., Егоров А. Современное состояние и перспективы развития иммуноферментного анализа, //Ж. Всес. хим. о-ва, 1982,Т. 27, N:4, с.442-449. Дзантиев Б. Гетерогенные методы иммуноферментного анализа.// Бюлл. ВИЭВ, 1985,с. 10-22. Иммуноферментный анализ. //М., Мир, 1988. Манолов А. Твердофазные радиоиммунные методы для количественного экспресс-анализа в микробиологии //ЖМЭИ, 1985, N:4, с.100-107. Коромыслов Г., Авилов В. Иммуноферментный анализ и его применение в ветеринарии // Бюлл. ВИЕВ, 1985, вып. 58, с. 6-9. Покровский В., Ермолин Г., Шабалина С. Настоящее и будущее иммуно-ферментных методов исследования в инфекционной патологии //Ж. микроб., эпидем. и иммунологии, 1983, N:8, с.3-7. Орлов А. Характеристика иммуноферментного метода и оценка его возможностей с позиций экспресс-диагностики // Препараты для экспрес-с-диагностики, Л., 1981, с. 55-59. Яковлев А., Зыкин Л.Ф., Рыбкин В. Иммуноферментный анализ в микробиологии. Саратов.,1990. Зыкин Л.Ф., Яковлев А.Т. Очерки по лабораторной диагностике опасных инфекций. Саратов, 1993, с.7-29. 1 А.Ф. Зыкин (1993) считает, что поскольку стоимость счетчика радиоактивности (основного прибора, необходимого для РИА) не превышает стоимости люминесцентного микроскопа, то эта причина несущественна. 2 В тех лабораториях, что не проводят метку, радиационная опасность сведена к минимуму. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям