Фармакологическая регуляция функционального состояния макрофагов при иммунном ответе 14. 03. 06 фармакология, клиническая фармакология
|
|
Скачать 0.71 Mb.
|
|
^
Животные. В экспериментах использовали мышей линий BALВ/c(H-2b), С57ВL/6J(H-2d), аутбредных мышей (всего 1527) обоего пола в возрасте 8-12 недель, а также аутбредных крыс-самцов (12 голов) в возрасте 4 мес, полученных из отдела экспериментальных биомоделей НИИ фармакологии СО РАМН (1 категории согласно сертификату). ^ были выделены на кафедре химии СибГМУ (г. Томск) по стандартной методике [Методы исследования углеводов, 1975] из фармакопейного растительного сырья – корневищ аира болотного (Acorus calamus L.) и девясила высокого (Inula helenium L.), листьев берёзы повислой (Betula pendula Roth.) и мать-и-мачехи обыкновенной (Tussilago farfara L.), цветов календулы лекарственной (Calendula officinalis L.), надземной части клевера лугового (Trifolium pratense L.) и полыни горькой (Artemisia absintium L.). Полученные образцы ПС были стандартизованы по содержанию углеводов (спектрофотометрический метод [Dubois M. et. аl., 1956]), белка (метод Брэдфорда [Bradford M.M., 1976]) и нуклеиновых кислот [Спирин А.С., 1958] (табл. 1). Таблица 1 Характеристика образцов полисахаридов (%), (Х±m)
Компонентный состав и молекулярно-массовое распределение исследуемых образцов определялись методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе Agilent 1100 со спектрофотометрическим детектором (детекция при длине волны 190 нм), разделение проводилось на эксклюзионной колонке TSK-gel GMPXL 300x7.8mm («Supelco»), подвижная фаза – вода, 1,0 мл/мин. Молекулярная масса полисахаридов, входящих в состав исследуемых образцов, определялась по времени удерживания, в соответствии с калибровочными значениями, определенными по стандартным образцам декстранов с молекулярной массой 15-20 кДа, 40 кДа, 60-90 кДа, 110 кДа, 250 кДа и 500 кДа («Sigma-Aldrich», США). На спектре ВЭЖХ образца из корневищ аира болотного обнаружено 5 пиков, соответствующих молекулярной массе 720, 460, 370, 290 и 40 кДа; из листьев берёзы повислой – 3 пика 680, 260 и 170 кДа; из корней девясила высокого – 2 пика 540 и 390 кДа; из цветков календулы лекарственной – 2 пика 490 и 310 кДа; из надземной части клевера лугового – 2 пика 700 и 320 кДа; из листьев мать-и-мачехи обыкновенной – 2 пика 690 и 350 кДа; из надземной части полыни горькой – 2 пика 510 и 305 кДа. ^ . Из суммы ПС берёзы повислой методом ионообменной хроматографии в институте физиологии Коми НЦ УрО РАН (г. Сыктывкар) были выделены две фракции: PS-B1-AG и PS-B2-RG. Главной цепью обеих фракций ПС является (1-4)-галактуронан, состоящий из остатков галактуроновой кислоты, соединенных 1-4-гликозидной связью. Боковые цепи фракции PS-B1-AG построены из остатков арабинозы (Ara – 3%) и галактозы (Gal – 6%), а боковые цепи ПС фракции PS-B2-RG – из рамнозы (Rha – 32%) и галактозы (Gal – 7%). Фракции ПС клевера лугового были получены на кафедре химии СибГМУ (г. Томск). Сумма ПС клевера также была разделена на 2 фракции: PS-62-N300 – нейтральный полисахарид с молекулярной массой больше 300 кДа и PS-62-Ас100 – кислый с молекулярной массой от 100 до 300 кДа. ^ получали из коммерческого альгината натрия, выделенного из бурых водорослей («Kelko», США), в Институте биологии моря им А.В. Жирмунского ДВО РАН (г. Владивосток). Содержание кальция в альгинате определяли атомно-абсорбционным методом, уроновых кислот – дифениловым методом и выражали в процентах [Blumenkrantz S., Asboe-Haunsen G., 1973]. Характеристическую вязкость определяли в вискозиметре Уббелоде. Молекулярную массу вычисляли, используя уравнение Марка-Хоуинка [Kravtchenko T.P., Pilnik A.A., 1990]. Исследуемый образец альгината кальция имел характеристическую вязкость 1270 мл/г, молекулярную массу – 403 кДа, уроновых кислот – 77,3%, кальция – 72,5%, карбоксильных групп в виде кальциевой соли – 82,5%. В работе использовали ^ («Sigma», США). Перед использованием in vitro или in vivo pН раствора доводили до физиологических показателей 3М раствором NaOH (рН 7,6). Выделение макрофагов. Перитонеальные макрофаги получали прилипанием к пластику клеток перитонеального экссудата. ^ . Из цельной периферической крови здоровых доноров, взятой утром натощак из локтевой вены и стабилизированной раствором гепарина (10 ЕД/мл), собирали лейкоцитарную взвесь методом сепарации клеток с использованием жидкости «Histopaque-1077» («Sigma-Aldrich», США). ^ . Клетки культивировали при 37°С в атмосфере с 5% СО2 и абсолютной влажности в среде следующего состава: RPMI 1640 («Sigma», США) с добавлением 10% ЭТС («Hyclone», Великобритания), 20 мМ HEPES («Sigma», США), 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола («Sigma», США), 50 мкг/мл гентамицина (РУП «Борисовский завод медицинских препаратов», Россия) и 2 мМ L-глютамина («Sigma», США). ^ . Полученные макрофаги (Мф) мышей или мононуклеары (Мн) периферической крови человека культивировали в 96-луночных планшетах в присутствии полисахаридов в концентрациях 10 и 20 мкг/мл; глюкуроновой кислоты 10 и 100 мкМ; липополисахарида (ЛПС) E.coli (серотип О111:В4, «Sigma», США) 1 мкг/мл; мурамилдипептида (N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглютамин, «Calbiochem», США) 5 и 10 мкг/мл; галавита (ЗАО «ЦСМ «Медикор»», Россия) 10 и 100 мкг/мл; глутоксима (ЗАО «Фарма ВАМ», Россия) 10 и 20 мкг/мл. ^ . Продукцию оксида азота (NO) оценивали по содержанию нитритов в супернатантах при помощи реактива Грейса через 24 и 48 ч [Green L.C. et al., 1982]. Реактив смешивали с эквивалентным объемом надосадка, абсорбцию замеряли с использованием многоканального спектрофотометра Titertek Multiskan® MCC («Labsystems», Финляндия) при длине волны 540 нм. Концентрацию нитритов определяли по калибровочной кривой, построенной с использованием стандартных растворов нитрита натрия. ^ . Активность аргиназы определяли по методике [Munder M. et al., 1998] в нашей модификации. Для этого в клеточном лизате замеряли концентрацию мочевины с помощью тест-системы «Мочевина-450» («Био-ЛА-Тест», Чехия) согласно приложенному к тест-системе протоколу с использованием спектрофотометра (длина волны 540 нм). За 1 единицу активности фермента принимали количество аргиназы, катализирующей образование 1 мкМ мочевины в минуту. ^ проводили при инкубации исследуемых образцов полисахаридов или ЛПС и полимиксина В («InvivoGen», США), с последующим определением концентрации нитритов в надосадке. ^ проводили по методике [Heasman S.J. et al., 2004] в нашей модификации. Для этого на монослой перитонеальных Мф в 96-луночных плоскодонных планшетах наслаивали 1% раствора туши или предварительно приготовленных апоптотических тимоцитов. Степень окраски оценивали на спектрофотометре при длине волны 540 нм. ^ CD169) и рецептора к эритробластам (CD163) использовали лиганды к данным рецепторам – эритроциты барана и эритробласты эмбриональной печени мышей, соответственно, которые инкубировали с суспензией клеток костного мозга мышей. Препараты окрашивали и микроскопировали, принимая за розетку макрофаг, окруженный не менее чем 5 клетками-лигандами [Crocker P.R., Gordon S., 1985; Crocker P.R. et al., 1988]. ^ IL-10, IL-12 макрофагами мышей. Количественное определение цитокинов в исследуемых супернатантах осуществляли твердофазным иммуноферментным методом при помощи тест-систем («R&D Systems», США) согласно прилагаемым к ним протоколам. ^ TNF-α и IL-10 мононуклеарами крови человека. Количественное определение цитокинов в супернатантах мононуклеаров осуществляли твердофазным иммуноферментным методом при помощи тест-систем («Вектор-Бэст», Россия) согласно прилагаемым к ним протоколам. ^ . Содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови мышей измеряли иммуноферментным методом с использованием соответствующих тест-систем («Immunology Consultants Lab.», США) согласно прилагаемым к ним протоколам. ^ IL-2 Т-лимфоцитами осуществляли в функциональном тесте по способности их супернатанта стимулировать пролиферацию IL-2-зависимых спленоцитов [Moore S.C. et al., 1992]. Пролиферацию клеток оценивали колориметрическим методом. ^ IFN-γ Т-лимфоцитами в функциональном тесте осуществляли по способности супернатанта спленоцитов индуцировать выработку NO миелокариоцитами сингенных животных [Moore S.C. et al., 1992]. ^ [Mosmann T., 1983]. За 4 ч до окончания культивирования спленоцитов в лунки с клетками вносили раствор MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide, «Sigma», США), в конечной концентрации 200 мкг/мл. Осадок растворяли диметилсульфоксидом (Димексид, «Татхимфармпрепараты», Россия). Абсорбцию полученных растворов замеряли при помощи многоканального спектрофотометра при длине волны 540 нм. ^ . Мф культивировали 48 ч с ингибиторами сигнальных молекул p38 MAP киназы – SB203580 (10 мкМ), PI3 киназы – LY294002 (100 мкМ), МАРК ЕRК1/2 – PD 98059 (100 мкМ) (все «InvivoGen», США), а также ингибиторами цАМФ – 2′,5′-дидеоксиаденозин (30 мкМ) и NF-B – ауротиомалат (50 мкМ) (оба «Calbiochem», США) в указанных выше условиях, после чего оценивали продукцию макрофагами оксида азота. ^ у мышей проводили иммунизацией вакциной BCG или эритроцитами барана [Kawamura I., 1992; Ravn P., 1997]. Мышам линии BALB/c внутрикожно (в основание хвоста) вводили по 100 мкг вакцины туберкулезной («Предприятие по производству бакпрепаратов НИИЭМ им. акад. Н.Ф. Гамалеи РАМН», Россия) в 0,1 мл неполного адъюванта Фрейнда («Difco», США). Контрольной группе животных соответственно вводили по 0,1 мл ФР. Повторные иммунизации проводили с интервалом в 14 суток. В экспериментах использовали одно-, дву- и трёхкратно иммунизированные модели. Суспензию эритроцитов барана 1108 клеток («ЭКОлаб», Россия) вводили внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл. Контрольным животным вводили 0,2 мл ФР аналогичным способом. В некоторых экспериментах иммунизацию повторяли трижды с интервалом 7 суток между инъекциями эритроцитов барана. Развитие Th2-зависимого иммунного ответа моделировали у мышей линии BALB/c введением под кожу бедра 100 мкг овальбумина (OVA) и 5 мг гидроокиси алюминия (оба «Sigma», США) в качестве адъюванта в 0,1 мл ФР [Hsieh C.S. et al., 1995; Oshiba A. et al., 1997]. При многократных иммунизациях интервал между инъекциями составлял 14 суток. Мышам контрольной группы аналогично вводили по 0,1 мл ФР. ^ . На 6-е сутки после иммунизации эритроцитами барана животным проводили вторую (разрешающую) инъекцию эритроцитов барана в подушечку задней лапы – «опытная лапа». В контрлатеральную лапу вводили ФР («контрольная лапа»). Местную воспалительную реакцию оценивали через 24 ч. Величину реакции оценивали как разницу массы между контрольной и опытной лапой и выражали в миллиграммах. ^ . Данную реакцию вызывали у интактных животных, которым вводили под апоневротическую пластинку опытной лапы сингенные спленоциты, полученные от трёхкратно иммунизированных туберкулёзной вакциной BCG или овальбумином (OVA) мышей, в смеси с соответствующим антигеном (BCG или OVA); в противоположную (контрольную) лапу вводили аналогичное количество сингенных спленоцитов, полученных от интактных мышей, в смеси с теми же количествами антигена. Опытной группе животных кроме спленоцитов и антигена в обе лапы вводили ПС. Воспалительную реакцию оценивали через 24 ч. ^ ) в селезенке определяли методом локального гемолиза [Ierne N.K., Nordin A.A.,1963]. Определение титра антител в сыворотке крови оценивали в реакции гемагглютинации [Хаитов Р.М. и др., 1999]. Титр выражали величиной log2. ^ осуществляли внутривенным (в ретроорбитальный синус) введением OVA на 7-й дней после последней иммунизации. В результате развившейся анафилактической реакции часть животных погибала в течение 2-4 ч. ^ оценивали по методике [Емельяненко И.Н., Душкин В.А., 1971] в нашей модификации. На 7 день после последней иммунизации в подушечку задней лапы вводили OVA – опытная лапа, в контрлатеральную лапу (контрольную) – ФР. Местную воспалительную реакцию оценивали через 4 ч. ^ [Алексеева О.Г., Дуева Л.А., 1978; Радунская С.Ф., 1982]. Сыворотку крови мышей, полученную через 7 суток после второго введения овальбумина, инкубировали с тучными клетками, полученными из брюшной полости интактных крыс. Показатель дегрануляции тучных клеток (ПДТК) подсчитывали по формуле:
^ IgЕ и IgG1 в реакции пассивной кожной анафилаксии (ПКА) [Хаитов Р.М. и др., 1999]. Титры IgG1 антител, специфических к OVA, определяли на аутбредных мышах-самцах, и IgE антител – на аутбредных крысах-самцах. Сыворотку крови иммунизированных мышей вводили внутрикожно в различных разведениях, начиная с 1/4. Разрешающую дозу OVA с раствором синего Эванса вводили мышам в ретроорбитальный синус через 2 ч и крысам в хвостовую вену через 24 ч после пассивной сенсибилизации кожи. Интенсивность ПКА оценивали через 30 мин по площади окрашенных участков кожи в мм2. ^ in vivo. Схема введения и оптимальные суточные дозы исследуемых веществ (растительных полисахаридов и альгината – 10 мг/кг массы тела, глюкуроновой кислоты – 50 мг/кг) были подобраны в предварительных экспериментах [Лопатина К.А., 2007]. В качестве положительного контроля в экспериментах in vivo использовали ликопид – 2 мг/кг, галавит – 1,5 мг/кг; глутоксим – 0,5 мг/кг, которые вводили по той же схеме. Препараты вводили внутрибрюшинной инъекцией в 0,1 мл ФР. Для изучения влияния исследуемых веществ на иммунный ответ, индуцированный эритроцитами барана, использовали две схемы введения. «Профилактическая схема» – мышам вводили растворы образцов 1 раз в сутки, начиная за 5 дней до иммунизации, всего 10 дней. «Терапевтическая схема» – исследуемые вещества вводили курсом 1 раз в сутки 5 дней, начиная со дня иммунизации эритроцитами барана. На 5-е сутки после иммунизации осуществляли забор материала. Введение исследуемых веществ на фоне иммунизации OVA проводили по двум схемам. При двукратной иммунизации животные опытной группы получали тестируемые вещества за 5 дней до первого введения OVA и в течение 5 дней после каждого последующего, всего 15 введений. При однократной иммунизации исследуемые вещества вводили 10 раз, начиная за 5 дней до инъекции антигена. Через 5 дней после последней иммунизации забирали материал для исследования. ^ . Для всех выборок проверена гипотеза нормальности распределения по величине коэффициента асимметрии и коэффициента эксцесса [Гмурман В.Е., 2001]. Для каждой выборки вычисляли среднее значение величины признака X и стандартную ошибку средней m. Проверка гипотезы о различиях средних проводилась с использованием t-критерия Стьюдента. Связь между количественными параметрами оценивали с помощью метода хи-квадрат. Различия частот встречаемости признаков в группах анализировали с помощью метода сравнения долей (z-преобразования Фишера). Допустимым уровнем значимости принималось p<0,05. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям