Сахарный диабет 1 типа и латентный аутоиммунный диабет взрослых (lada): клинические, иммуно-генетические и гормонально-метаболические аспекты (14. 01. 02 эндокринология)

Материалы и методы исследования

Клиническая характеристика больных

В исследование были включены 684 человека (382 мужчины, 302 женщины), которые были разделены на 3 основные и 2 контрольные группы.

Три основные группы:

• 1 группа — 387 пациентов (223 мужчины (57,6%), 164 женщины (42,4%)) с «классическим» дебютом СД 1; с различной длительностью заболевания, (149 чел.– с впервые выявленным СД (1-й год заболевания); 104– с длительностью СД от 1 года до 5 лет;76– с длительностью СД от 5 до 10 лет;58– с длительностью СД свыше 10 лет).

• 2 группа — 143 пациента (97 мужчин (68,5%), 46 женщин (31,5%)) с латентным аутоиммунным диабетом взрослых (LADA), с различной длительностью заболевания (52 чел.– с длительностью до 1 года; 49– с длительностью СД от 1 года до 5 лет;35– с длительностью СД от 5 до 10 лет;7– с длительностью СД свыше 10 лет).

• 3 группа — 33 человека (10 мужчин, 23 женщины), составили лица с положительными аутоантителами, ассоциированными с развитием СД 1 (GADA, IA-2A, ICA, IAA) (случайная выборка), группа была условно названа группой риска.

В качестве контроля были обследованы 2 группы (56 человек — контрольная группа здоровых лиц, 65 человек – контрольная группа пациентов с СД 2).

Диагноз СД устанавливался на основании клинической картины и данных лабораторного обследования в соответствии с критериями Всемирной Организации Здравоохранения [World Health Organization, 1999]. «Классический» вариант СД 1 диагностировался при наличии яркой клинической картины (полидипсия, полиурия, значительная потеря массы тела), кетонурии, низких значений С-пептида. Диагноз LADA, ставился пациентам с дебютом заболевания в возрасте старше 30 лет, постепенным началом, положительными аутоантителами к аутоантигенам β-клетки и/или инсулину, отсутствием кетонурии, нормальными значениями базальной концентрации С-пептида в сыворотке крови [P. Zimmet, 1994]. Во 2-ю группу (LADA) были включены 117 пациентов с первичным диагнозом СД 2 (что составило 82,8% от всей группы), с положительными титрами аутоантител, ассоциированных с СД, получавшие в течение не менее чем 6 мес. сахароснижающие пероральные препараты в качестве моно- или комбинированной терапии без значимого клинического эффекта и 26 пациентов, которым был сразу поставлен диагноз LADA.

Критериями исключения из исследования была вакцинация и приём иммуномодулирующих препаратов в течение предшествующего года, и наличие других аутоиммунных заболеваний (тиреоидит, астма и др.) при первичном обследовании.

Основные клинико-лабораторные показатели больных СД в исследуемых группах на момент дебюта представлены в таблице 1.

ИРИ у больных СД 1 в дебюте представлен для пациентов, не получавших инсулин на момент обследования.

У 13 человек (8,7%) (8 мужчин и 5женщин) из группы с впервые выявленным СД1 была отмечена ремиссия заболевания, из них у десяти (6,7%) - частичная (снижение потребности в экзогенном инсулине ≤0,4 Ед/кг/сут. на фоне компенсации СД), у трех (2%) – полная ремиссия заболевания (восстановление нормогликемии без инсулинотерапии на срок более 2 недель) по критериям, утвержденным IDIG (International Diabetic Immunotherapy Group).

В третью группу (группу риска развития СД 1) вошли лица с положительными результатами повторного определения аутоантител, ассоциированных с развитием СД 1 (GADA, IA-2A, ICA, IAA). Обследуемые были в возрасте 28,5 лет [21,5; 35,5], с индексом массы тела (ИМТ) 26,03 кг/м² [22,77; 30,15], HbA_1c 5,6 % [5,4; 5,7], базальным уровнем C-пептида в крови 1,7 нг/мл [1,2; 4,1], инсулина - 7,2 мкЕд/мл [5,4; 8,6]. У 3 человек из группы риска родственники первой степени родства болели СД 1.

Первую контрольную группу составили 56 практически здоровых лиц (30 мужчин и 26 женщин), в возрасте 34 года [24; 53], ИМТ составил 21,34 кг/м² [18,90; 30,67], HbA_1c 5,4 % [4,8; 5,5], базальный уровень C-пептида в крови 2,3 нг/мл [1,5; 4,5], инсулина 7,3 мкЕд/мл [4,2; 9,2].

Критериями включения в контрольную группу были: отсутствие нарушений углеводного обмена и отрицательные аутоантитела к антигенам β-клетки (GADA, IA-2A, ICA, IAA).

Вторую контрольную группу составили 65 больных СД 2 (22 мужчин и 43 женщин), в возрасте 44,0 года [39,5; 51,0], ИМТ пациентов составил 30,68 кг/м² [25,95; 35,08], HbA_1c 8,7 % [7,3; 10,8], базальный уровень C-пептида в крови 3,1 нг/мл [1,8; 4,0], инсулина - 17,9 мкЕд/мл [7,2; 22,0].

Иммуно-генетическое обследование

Количественное определение ICA, GADA, IAA и IA-2A в сыворотке крови осуществляли методом иммуноферментного анализа с использованием наборов “Isletest-ICA, GADA, IAA” (“Biomerica”, Германия) и “Medizym” (“Medipan GMBH”, Германия).

Определение экспрессии поверхностных молекул на лимфоцитах периферической крови проводили на проточном цитометре “FACSCalibur” по стандартной методике с использованием моноклональных антител (одинарной и двойной меткой) к CD3, CD4, CD8, CD16, CD20, CD25, CD38, HLA-DR (“Becton Dickinson”, США) и CD95, CD95L (“Immunotech”, Франция). При этом оценивали процентное содержание субпопуляций лимфоидных клеток, экспрессию дифференцировочных антигенов и абсолютное количество указанных субпопуляций лимфоидных клеток.

Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови проводили с помощью наборов пробоподготовки “DNA prep”. В настоящей работе ДНК-типирование выполнялось методом мультипраймерной полимеразной цепной реакции по аллельным вариантам трех генов HLA класса II: DRB1 (14 специфичностей), DQA1 (8 аллелей) и DQB1 (13 аллелей). Для определения полиморфных аллелей данных генов применялись коммерческие наборы производства ЗАО “НПФ ДНК-Технология” (Россия). Полимеразная цепная реакция проводилась согласно регламенту, указанному производителем. Амплификацию проводили на амплификаторе “Терцик” (Россия). Гаплотипы составлялись на основе известных таблиц сцепления. Исследования выполнены в лаборатории генетики и клинической иммунологии ФГУ ЭНЦ (заведующий — к.м.н. Прокофьев С.А.).

Амплификацию полиморфного микросателитного маркера R620W гена PTPN 22 и полиморфного участка –23НрhI гена INS проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме “реального времени” на термоциклере “Dyad” (Bio-Rad). Обозначения полиморфных маркеров даны в соответствии с базой данных dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/). Анализ генотипов полиморфных маркеров ряда генов проводили методом детекции флуоресценции «по конечной точке» на термоциклере “ABI 7500 Fast” (Applied Biosystems) с помощью встроенных средств программного обеспечения SDS версии 1.4. Для исследования ассоциации полиморфных маркеров генов-кандидатов у пациентов с заболеванием LADA в сравнении с “классическим” СД 1 использовался подход «случай-контроль». Контрольная группа (206 чел.) представляла собой случайную выборку. Выборки были этнически однородны, составлены из русских (на основании паспортных данных), проживающих в г. Москве и не являющихся родственниками. В нашей работе распределение частот генотипов всех полиморфных маркеров исследуемых генов в группе здоровых индивидов соответствовало распределению Харди-Вайнберга, существенных отличий от частот аллелей и генотипов в европейских популяциях обнаружено не было (данные о частотах в европейской популяции взяты из проекта HapMap, http:// hapmap.org).

Исследования выполнены в ФГУП «ГосНИИ генетика», г. Москва (директор – к.б.н. М.Ю. Бебуров, зав. лабораторией молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии – д.б.н., проф. В.В. Носиков).

Для определения интенсивности экспрессии гена FOXP3 проводилось выделение тотальной РНК из образцов крови данных групп пациентов при помощи набора для выделения РНК Yellow Solve (Клоноген, Санкт-Петербург). Концентрацию выделенной РНК определяли спектрофотометрически при помощи NanoDrop ND-1000 UV/VIS NanoDrop Technologies USA. Обратную транскрипцию проводили с использованием в качестве затравки случайных гексамеров и набора для обратной транскрипции ImProm - III^M Reverse Transcription (Promega, США).

Количественное определение экспрессии генов осуществляли с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) на приборе Step One Plus фирмы Applied Biosystems (США). Каждое измерение проводили трехкратно. Для проведения ПЦР-РВ были синтезированы праймеры и отработаны оптимальные условия амплификации. В качестве эндогенного контроля использовали ген GAPDH. Для определения диапазона нормальных показателей интенсивности экспрессии гена FOXP3 было обследовано 85 здоровых доноров.

Исследования выполнены в Медико-генетическом научном центре Российской академии медицинских наук, Москва (директор — академик РАМН Гинтер Е.К., зав. лабораторией молекулярной генетики сложно наследуемых заболеваний – д.б.н. Карпухин А.В.).

Биохимическое обследование

Содержание уровня HbA_1c определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) на аппарате D-10 (“Bio-Rad”, Франция) по стандартной методике производителя. Исследование выполнено в лаборатории клинической биохимии ФГУ ЭНЦ (заведующий — Ильин А.В.).

Определение концентрации С-пептида и инсулина проводили иммунохемолюминисцентным методом на аппарате “Elecsys 2010” (“Roche”, Германия).

Для оценки функциональной возможности β- клеток был проведен тест ММТТ—(mixed meal tolerance test) с приёмом стандартного количества жидкой смешанной пищи (Ensure Plus). Определение базальной секреции происходило путём измерения концентрации С-пептида после длительного голодания (в течение 10 часов); определение выраженности секреторного ответа проводилось путём определения концентрации С-пептида через 30, 60, 90, 120, 180 минут в ходе ММТТ. Оценивался суммарный секреторный ответ в виде площади под кривой значений концентрации С-пептида. Для характеристики общей функциональной активности β-клеток использовался относительный показатель – HOMA-F-индекс.

HOMA (homeostasis model assessment) – эмпирическая, математически обработанная модель, предназначенная для характеристики общей функциональной активности β-клеток и инсулинорезистентности на основании только базальных показателей глюкозы плазмы и инсулина, что доступно для выполнения и широко используется в исследованиях. Условно в норме функция β-клеток составляет 100%. Общая функциональная активность β-клеток = 20×ИРИ0 (мкЕд/мл) / (ГПН (ммоль/л) – 3,5). HOMA-IR-индекс – относительный параметр, характеризующий общую периферическую инсулинорезистентность. Индекс инсулинорезистентности = ИРИ0 (мкЕд/мл)×ГПН (ммоль/л) / 22,5. По HOMA-модели условно инсулиноре-зистентность у здорового человека соответствует 1 баллу.

Исследования выполнены в гормональной лаборатории ФГУ ЭНЦ (заведующий — проф., д.м.н. Гончаров Н.П.).

Статистическая обработка полученных данных

Проведена с использованием пакета прикладных программ statistica (StatSoft Inc. США, версия 6.0). Для анализа вида распределений применялись критерии Шапиро-Уилка и Лиллиефорса, дисперсии распределений признаков оценивались с помощью F-критерия в процедуре дисперсионного анализа ANOVA. Сравнение групп по количественным признакам осуществлялось непараметрическим методом с использованием U-критерия Манна-Уитни. Сравнение групп по качественным признакам осуществлялось непараметрическим методом путем анализа таблиц сопряженности с использованием двухстороннего точного критерия Фишера для несвязанных групп и критерия МакНемара для связанных групп. Статистически значимыми считали различия при p < 0,05. Анализ связи (корреляции) двух количественных признаков осуществлялся непараметрическим методом ранговой корреляции по Спирмену. Для сравнения частот аллелей и генотипов исследуемых полиморфных маркеров в группах с наличием и отсутствием заболевания нами использовался критерий χ². Значимыми считали различия при p < 0,05.

Результаты исследований, обработанные статистически и представленные в виде таблиц или диаграмм, дают возможность судить о динамике медианы параметра, достоверности и интерквартильном отрезке, а также связи с изменениями других параметров в соответствии с современными требованиями.