Сахарный диабет 1 типа и латентный аутоиммунный диабет взрослых (lada): клинические, иммуно-генетические и гормонально-метаболические аспекты (14. 01. 02 эндокринология)

Результаты исследования и их обсуждение

Учитывая аутоиммунный характер СД и выраженную генетическую ассоциацию заболевания с генами (DRB1, DQA1, DQB1) локуса HLA класса II нами были определены и проанализированы ряд генетических и иммунологических характеристик при СД 1 и LADA.

HLA-генотипирование было проведено всем обследуемым. Контрольная группа (149 чел.) представляла собой случайную выборку. Выборка была этнически однородна, составлена из русских (на основании паспортных данных), проживающих в г. Москве и не являющихся родственниками. Анализировали частоту встречаемости различных генотипов и комбинаций гаплотипов HLA у пациентов с СД 1, LADA и в контрольной группе (табл. 2).

При сравнительном анализе распределения генотипов HLA класса II у пациентов с СД 1, LADA и в контрольной группе наблюдались выраженные отличия по частоте как высоко предрасполагающих, так и протективных генотипов и гаплотипов.

В группе пациентов с СД 1 частота генотипов с двумя предрасполагающими гаплотипами оказалась значительно выше (55,7%), чем с одним предрасполагающим гаплотипом в сочетании с протективным или нейтральным (31,3%). Напротив, в группе пациентов с LADA, в отличие от СД 1, частота генотипов с двумя предрасполагающими гаплотипами значительно ниже (28,7%) (р<0,001), чем с одним предрасполагающим гаплотипом в сочетании с протективным или нейтральным (51,0%) (р<0,001). В контрольной группе преобладали генотипы с комбинацией протективных и нейтральных гаплотипов, частота генотипов с двумя предрасполагающими гаплотипами была статистически значимо ниже по сравнению с СД 1 и LADA. Таким образом, подтверждена ассоциация HLA класса II с развитием как LADA, так и СД 1. Вероятно, именно наличие только одного предрасполагающего гаплотипа в сочетании с протективным или нейтральным в генотипе больных LADA обуславливает менее агрессивное течение заболевания и может являться одной из характеристик LADA.

При HLA-типировании в группе риска развития СД 1 были получены результаты преобладания частот протективных и нейтральных гаплотипов и генотипов по сравнению с классическими предрасполагающими. Поскольку исследование было проведено на малой выборке, полученные данные требуют дальнейшего анализа.

Область предрасположенности IDDM2 содержит собственно ген INS и полиморфный минисателлит, расположенный в 5’-концевой части этого гена (5’-VNTR) в промоторной области. Он состоит из тандемно повторяющихся единиц размером 14-15 п.н. Генетический риск ассоциирован с разным числом повторов минисателлитного маркера VNTR. В зависимости от их числа аллели VNTR подразделяют на 3 класса. Аллели класса I содержат от 26 до 63 повторяющихся единиц, тогда как аллели класса III включают от 141 до 209 звеньев. Промежуточный по длине класс II редко встречается у европеоидов и состоит из аллелей, содержащих около 80 тандемных повторов. Аллели класса I гена инсулина были ассоциированы с предрасположенностью к СД1; в то время как аллели класса III ассоциированы с пониженным риском развития этого заболевания [Bennett S.T. 1995]. Накоплено достаточно данных о корреляции между аллелями VNTR гена INS, уровнем синтеза мРНК проинсулина и секрецией продукта этого гена в клетках поджелудочной железы и тимуса [Vafiadis P., 1997]. У носителей аллелей класса I уровень мРНК проинсулина в клетках поджелудочной железы в 1,5 – 2 раза выше, чем у носителей аллелей класса III. Противоположная ситуация наблюдается в клетках тимуса. У носителей аллелей класса III уровень мРНК проинсулина в 2 – 3 раза выше, чем у носителей аллелей класса I. Предполагается, что более высокие уровни экспрессии гена INS в тимусе способствуют развитию центральной толерантности, что может объяснять защитную роль этого полиморфного маркера. Во многих исследованиях для идентификации аллелей VNTR использовался сцепленный с ним полиморфный маркер
–23HphI (rs689) гена INS. Для русской популяции подобное исследование показало высокий уровень ассоциации этого полиморфного маркера с СД 1 [Лаврикова Е.Ю. и соавт., 2010]. В настоящем исследовании изучалась ассоциация полиморфного маркера
–23HphI гена INS у пациентов с заболеванием LADA в сравнении с “классическим” СД 1 с использованием подхода «случай-контроль». Результаты представлены в таблицах 3-5.

Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера -23HphI гена INS в группе с СД1 и контрольной группе, а также в группе с LADA и контрольной группе показал наличие достоверных отличий. Достоверное увеличение частоты аллеля А в группе больных СД1 и LADA говорит об ассоциации аллеля А и генотипа АА с повышенным риском развития как СД1, так и LADA. В то же время установлена ассоциация аллеля Т и генотипа ТТ с пониженным риском развития СД1 и LADA. Достоверной разницы в распределении частот в группах LADA и СД1 обнаружено не было. Таким образом, полиморфный маркер -23HphI гена INS достоверно ассоциирован как с СД 1, так и с LADA.

Ген PTPN22, расположенный в хромосомной области 1p13.3-p13.1, входит в число наиболее значимых генов, предрасполагающих не только к развитию СД 1, но и к ревматоидному артриту, системной красной волчанке и ряду других аутоиммунных заболеваний [Lee, .2007, Gregersen, 2006, Criswell, 2005]. Тирозиновая фосфатаза лимфоидных клеток (LYP), которая кодируется геном PTPN22, – внутриклеточный белок, специфичный для клеток иммунной системы [Cohen, 1999]. Тирозиновые фосфатазы Т-лимфоцитов осуществляют дефосфорилирование соответствующих белков, передающих сигнал от антигенных рецепторов Т-клеток и рецепторов цитокинов. В 2004 г. обнаружена ассоциация полиморфного маркера C1858T гена PTPN22 с СД 1 [Bottini N., 2004]. Однонуклеотидному полиморфизму C1858T соответствует аминокислотный полиморфизм R/W в положении 620 аминокислотной последовательности тирозиновой фосфатазы Т-лимфоцитов (R620W). Так как вклад полиморфного маркера C1858T гена PTPN22 в формирование предрасположенности к СД 1 подтвердился в нескольких геномных анализах с использованием микрочипов высокой плотности [Todd, 2007, Cooper, 2008], мы изучили ассоциацию этого полиморфного маркера с заболеванием LADA в сравнении с СД 1 (табл. 6-8).

При сравнительном анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера R620W гена PTPN22 в группах с СД1 и контрольной группой, а также в группе LADA и СД1 получены достоверные отличия, в то время как между группой LADA и контрольной группой достоверной разницы обнаружено не было. Достоверное увеличение частоты аллеля Т (ОR=1,7 p=0,01) и генотипа СТ (ОR=1,7 p=0,04) в группе больных СД1 говорит об их ассоциации с повышенным риском развития данной патологии. В то же время была установлена ассоциация аллеля С (ОR=0,59 p=0,01) и генотипа СС (ОR=0,55 p=0,04) с пониженным риском развития СД1. Таким образом, обнаружена ассоциация полиморфного маркера R620W гена PTPN22 с развитием СД1, однако, ассоциации с развитием LADA в нашей выборке не установлено. Поскольку исследование было проведено на малой выборке больных, полученные данные требуют дальнейшего анализа.

Аутоантитела к антигенам β-клетки являются маркёрами аутоиммунного процесса. Вид аутоантител, их комбинации и титры а в группах LADA и СД1 были различны. У пациентов с LADA наиболее часто определялись антитела к GAD: 53,1% по сравнению с 22,1% при СД 1 (р <0,05). Также отмечена большая частота встречаемости комбинации GADA+IA-2A у пациентов с СД 1 (19% - при длительности заболевания до 6 мес., 26,3% - до 12 мес.) по сравнению с LADA (отсутствие - до 6 мес., 10% - до 12 мес.) (р <0,01), и большая частота встречаемости комбинации GADA+ICA у пациентов с LADA (21,4% - при длительности заболевания до 6 мес., 25,% - до 12 мес.) по сравнению с СД 1 (9,5% - до 6 мес., 5,3% - до 12 мес.) (р <0,01). Взаимосвязи предрасполагающих и протективных HLA гаплотипов с аутоантителами не обнаружено ни в группе пациентов с СД1, ни в группе с LADA.

Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов, естественных регуляторных Т-клеток и их молекулярного маркера - гена FOXP3

Деструкция β-клеток при СД1 опосредована клеточным иммунным ответом, что доказывается фактами обнаружения эффекторных Т-клеток в островках при инсулите, замедлением прогрессирования заболевания иммуносупрессивными препаратами, направленными непосредственно против Т-клеток, определением аутореактивных Т-клеток в крови у пациентов в дебюте СД1. В нормальных условиях защитные механизмы предотвращают избыточную активацию клеток иммунной системы [McClymont S.A., 2011]. К фундаментальным защитным механизмам относится иммунологическая толерантность. У здоровых людей периферическая аутотолерантность поддерживается с помощью ряда регуляторных механизмов, включая популяцию естественных регуляторных Т-клеток. Способность Тreg подавлять аутоиммунный ответ непосредственно зависит от уровня экспрессии гена FOXP3.

Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов, естественных регуляторных Т-клеток и их молекулярного маркера – гена FOXP3 проводилось в выборке из 116 больных (67 мужчин, 49 женщин) СД 1, выборке из 74 больных LADA (51 мужчина,23 женщины), а также у лиц группы риска развития СД1 в сравнении с контрольными группами. Больные СД 1 и LADA были разделены на подгруппы в зависимости от длительности заболевания: (табл. 9, 10).

В группе больных с СД 1, как с впервые выявленным, так и при продолжительном течении заболевания, количество регуляторных Т-лимфоцитов не отличалось от такового в группе контроля (p >0,05) (рис. 1.)

Однако их функциональная активность (интенсивность экспрессии гена FOXP3) была достоверно ниже, чем в контроле. Низкая интенсивность экспрессии гена FOXP3 в сравнении с контролем отмечалась при любой продолжительности заболевания (рис. 2):

Изменение экспрессии гена FOXP3 у пациентов с LADA носило волнообразный характер, что не наблюдалось у пациентов с СД 1 (рис.3). Начало заболевания характеризовалось показателями экспрессии, не отличающимися от контрольных значений, при этом наблюдалось достоверное повышение относительного количества Т-лимфоцитов подтипа CD4⁺25^+high (p=0,031) (рис. 4).

Снижение экспрессии гена FOXP3 у пациентов с LADA, в отличие от СД 1, наблюдалось через 6-12 месяцев от начала заболевания, при этом количество Т-лимфоцитов подтипа CD4⁺25^+high нормализовалось и при дальнейшем течении заболевания не отличалось от контрольных значений. В период от года до пяти лет вновь наблюдалась нормализация уровня экспрессии гена FOXP3, при длительности болезни более пяти лет – достоверное снижение.

Нарастание процентного содержания Тreg в период до 6 мес. может отражать их регулирующую роль при подавлении аутоиммунного ответа. Возможно, увеличение численности Тreg компенсирует их функциональный дефицит. Таким образом, при заболевании LADA функциональный дефицит Тreg возникает отсрочено, что, очевидно, обусловливает медленное прогрессирование аутоиммунной деструкции β-клеток. Прогрессирование индуцированной аутоиммунной реакции при длительности заболевания от года до пяти лет по неизвестным пока причинам замедляется, несмотря на наличие антител. Возможно, индукция аутоиммунного процесса происходит на фоне имеющейся периферической инсулинорезистентности, характерной для больных LADA.

Низкая интенсивность экспрессии гена FOXP3 (несмотря на отсутствие существенной разницы в содержании Тreg в крови) в сравнении с контролем при любой продолжительности СД 1 говорит о потере иммунологической толерантности и дефекте подавления аутоиммунного ответа при любом сроке заболевания.

В группе риска развития СД 1 отмечена тенденция повышения относительного количества клеток с подтипами CD25⁺ и CD4⁺CD25^+high по сравнению с контролем (p >0,05) и достоверное снижение экспрессии гена FOXP3 – 0,49 rq [0,24;0,81] (p <0,05). Результаты, полученные в группе риска развития СД 1, могут свидетельствовать о постепенно снижающейся способности Тreg подавлять Т-клеточную пролиферацию.

При оценке количества регуляторных Т-клеток в группе с ремиссией СД 1 было отмечено их повышенное число (2,4% [1,9; 2,8]), по сравнению с контрольными значениями у здоровых лиц (0,8% [0,6; 0,9]) (р <0,01) и при дебюте (0,9% [0,4; 2,1]) (р = 0,021). В группе без ремиссии, с “обычной” потребностью в экзогенном инсулине количество регуляторных Т-клеток не отличалось от контрольных значений (р=0,67). Экспрессия гена FOXP3 была снижена в том числе и в группе с ремиссией (р = 0,044). Можно предположить, что у пациентов этой группы для компенсации функционального дефицита Тreg возникает увеличение их численности, которое, однако, нельзя рассматривать как показатель роста активности этих клеток.

Исследование маркеров апоптоза

Апоптоз играет одну из ключевых ролей в патогенезе СД1. С одной стороны гибель β-клеток может идти по пути апоптоза, с другой — этот процесс участвует в элиминации аутореактивных клеток и контролирует иммунный ответ.

Исследование маркеров апоптоза проведено в той же выборке пациентов, что и исследование регуляторных Т-лимфоцитов и экспрессии гена FOX P3.

Были определены уровни экспрессии CD95 и CD95L на поверхности периферических лимфоцитов и концентрация их растворимых форм в сыворотке крови. В дебюте СД 1 отмечено достоверное снижение уровня синтеза CD95 лимфоцитами по сравнению с контрольной группой — 27% и 33%, соответственно (p <0,01). У пациентов с LADA этот показатель составил 31% и при попарном сравнении достоверно не отличался от 1-ой группы и контрольной группы (p >0,05) (рис. 5). Снижение экспрессии CD95 на поверхности клеток может свидетельствовать об устойчивости лимфоцитов к апоптозу и способствовать пролонгации иммунного ответа.

Более высокий уровень экспрессии CD95L на лимфоцитах периферической крови был выявлен у пациентов с СД 1 — 3,1%, чем у пациентов с LADA — 1,6% и практически здоровых лиц — 1,9% (рис. 6). Однако различия между группами оказались статистически недостоверны (р_1-2 = 0,19, p_1-к = 0,9, p_2-к = 0,27).

Нами отмечено изменение уровня экспрессии маркёрных молекул апоптоза (CD95, CD95L) на поверхности лимфоцитов периферической крови в разные сроки СД 1. Количество лимфоидных клеток, экспрессирующих антиген CD95 на поверхности, увеличилось при длительности заболевания до 6 мес. составило 27%, через 6 - 12 мес. — 32%, а через 1 - 5лет — 33% (p = 0,04). При парном сравнении показателей были также получены статистически достоверные различия: до 6 мес. vs 6 - 12 мес. (p < 0,05); до 6 мес. vs 1 - 5 лет (p < 0,01). При большей длительности заболевания достоверных изменений в уровне экспрессии маркёрной молекулы апоптоза CD95 отмечено не было.

Количество лимфоцитов подтипа CD95L⁺ в течение первого года наблюдения, наоборот, снизилось с 3,1% до 2,2%, однако, различия оказались статистически не достоверны (р = 0,81). Дальнейшее изменение количества лимфоцитов подтипа CD95L⁺ при большей длительности заболевания оказалось также статистически не достоверно (р = 0,7).

В отличие от пациентов с СД 1 при сравнительном анализе уровня экспрессии маркёрных молекул апоптоза на лимфоцитах в подгруппах пациентов с LADA мы не отметили статистически значимых различий ни одного из показателей. Уровень экспрессии CD95 и CD95L на лимфоцитах у этих пациентов был сопоставим с контролем. Корреляционных связей между маркёрами апоптоза у пациентов с LADA выявлено не было.

В группе риска развития СД1 содержание относительного количества лимфоцитов подтипов CD95⁺ и CD95L⁺ статистически не отличалось от контрольных значений (p >0,05). При проведении корреляционного анализа мы обнаружили сильную отрицательную связь между относительным количеством лимфоцитов, экспрессирующих CD95L на поверхности, и базальной концентрацией С-пептида (r =
-0,94; p = 0,05), что может быть связано с начальными явлениями апоптоза β-клеток.

В группе пациентов с ремиссией уровень экспрессии CD95 и CD95L на поверхности лимфоцитов был выше, чем в дебюте заболевания. Статистически достоверные различия отмечались только в изменении уровня экспрессии CD95 на поверхности лимфоцитов (p= 0,02). Нормализация экспрессии CD95 может свидетельствовать о частичном восстановлении иммунорегуляторных механизмов.

Исследование показателей секреторной функции β-клеток натощак, общей функциональной активности β-клеток и периферической инсулинорезистентности

В рамках данной работы были проанализированы показатели секреторной функции β-клеток натощак, общая функциональная активность β-клеток и периферическая инсулинорезистентность у больных LADA, СД1, группы риска в сравнении с контрольной группой практически здоровых лиц и СД2 по данным базального уровня ИРИ и С-пептида, а также по данным HOMA. У пациентов с впервые выявленным СД1 (n=28), LADA (n=23) и СД2 (n=31) до назначения терапии была взята кровь для определения ИРИ и С-пептида. Был произведен расчет функции β-клеток и инсулинорезистентности периферических тканей с использованием HOMA-модели.

В группе больных LADA средние показатели концентрации инсулина и С-пептида были достоверно ниже, чем у больных СД2 9,8 [3,2; 11,5] и 17,9 [7,2; 22,0] мкЕд/мл; 1,8 [1,6; 2,6] и 3,1 [1,8; 4,0] нг/мл, (p<0,001), но выше, чем у больных СД1 (0,7 [0,5; 1,2] нг/мл), (p<0,001). При оценке функции β-клеток и инсулинорезистентности периферических тканей с использованием HOMA-модели также были получены достоверные различия между группами. Показатели функции β-клеток и инсулинорезистентности при LADA были достоверно ниже, чем при СД 2 (табл. 11).

Таким образом, для дебюта LADA характерно как сниженная функциональная активность β-клеток (HOMA-F – 39,2%, в контрольной группе – 96%) (р=0,008), так и наличие инсулинорезистентности (HOMA-IR – 3,7, в контрольной группе – 1,6) (р=0,021). При этом начало СД 2, по сравнению с LADA характеризуется как большим показателем функциональной активности β-клеток (HOMA-F – 63,9%) (р=0,018), так и большим показателем периферической инсулинорезистентности (HOMA-IR – 7,2) (р=0,038). Вероятно, высокие потребности в инсулине у инсулинрезистентных пациентов приводят их к диабету при меньшем повреждении β-клеток (у худых, с хорошей чувствительностью к инсулину требуются более серьёзные повреждения β-клеток для развития клинической манифестации диабета).

Оценка секреторной функции β-клеток в ходе ММТТ в исследуемых группах

В рамках данного исследования был проведен анализ секреторной функции β-клеток в ходе ММТТ в исследуемых группах (табл. 12, 13).

Тест проводился в выборке больных на фоне компенсации углеводного обмена. Оценивался суммарный секреторный ответ в виде площади под кривой значений концентраций С-пептида. Суммарный секреторный ответ у пациентов СД1 и LADA достоверно между собой не отличался (p=0,082). При этом было отмечено достоверное отличие этих показателей от суммарного секреторного ответа пациентов в группе с СД2 (p<0,001).

Максимальные пики секреции у пациентов в группах с СД1 и LADA также достоверно между собой не отличались, при этом отмечено их достоверное отличие от максимального пика секреции С-пептида у пациентов в группе с СД2 (p<0,05). Секреция инсулина в ответ на смешанную пищу у пациентов с СД 1 в начале болезни на фоне компенсации (без ремиссии) в среднем составила 67,7% от ответа обследованных в контрольной группе, а у пациентов с LADA – 88,1%. В группе пациентов с ремиссией (n=11) суммарный секреторный ответ составил 94,7%, максимальный пик секреции в 3,6 раз превышал базальную концентрацию С-пептида и в 1,6 раз превышал максимальный пик секреции в группе пациентов с СД1 без ремиссии. Полученные данные могут свидетельствовать как о значении глюкозотоксичности в подавлении секреторной активности β-клеток в дебюте заболевания, так и об эндогенно-регенеративном потенциале β-клеток.

В результате выполненной работы были сформулированы дифференциально-диагностические критерии аутоиммунного сахарного диабета и СД 2 (табл. 14).

Таким образом, несмотря на сходство клинической картины LADA в дебюте заболевания с СД2, отмечено достоверное снижение общей функциональной активности β-клеток у пациентов с LADA (до 39%) по сравнению с пациентами с СД2 (до 64%) (p<0,05), а также достоверно больший индекс инсулинорезистентности у пациентов с СД2 по сравнению с пациентами с LADA (7,2 и 3,7 баллов соответственно) (p < 0,05). Отмечено генетическое сходство СД 1 и LADA в контексте ассоциаций с локусами IDDM1 и IDDM2. Подтверждена ассоциация генов HLA класса II с развитием как LADA, так и СД1. При этом, наличие в генотипе больных LADA только одного высоко предрасполагающего гаплотипа в комбинации с протективным или нейтральным гаплотипом, вероятно, обуславливает более позднее начало и менее агрессивное течение заболевания. В дебюте СД1 (при «классическом» варианте) отмечено снижение экспрессии ключевого маркера апоптоза (CD95) лимфоцитов сравнительно с контрольной группой (р<0,01) и с группой больных LADA (р >0,05), что является косвенным признаком подавления программированной гибели аутореактивных лимфоидных клеток, и, в свою очередь, объясняет большую выраженность аутоиммунного ответа при СД1, по сравнению с LADA. В начале заболевания у пациентов с LADA показатели экспрессии гена FOXP3 не отличались от контрольных значений, что говорит об отсроченном функциональном дефиците регуляторных Т-лимфоцитов, в отличие от пациентов с СД1, у которых отмечается низкая интенсивность экспрессии гена FOXP3 при любой продолжительности заболевания, что говорит о потере иммунологической толерантности и дефекте подавления аутоиммунного ответа при любом сроке заболевания. Суммарный секреторный ответ у пациентов с СД1 и LADA достоверно между собой не отличался. При этом было отмечено достоверное отличие этих показателей от суммарного секреторного ответа пациентов в группе с СД 2.

В настоящее время не существует специальных алгоритмов по лечению LADA. Большинство исследователей склоняется к целесообразности раннего назначения инсулинотерапии этим пациентам. Полученные нами данные о сниженной функциональной активности β-клеток в дебюте LADA свидетельствуют в пользу данной точки зрения.