Биорегуляция микросимбионтов в микросимбиоценозе кишечника человека 03. 02. 03 «Микробиология»
|
|
Скачать 0.6 Mb.
|
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на I - V Всероссийских конгрессах по медицинской микологии (2002 - 2007 гг.) (г. Москва); III - V Российской научной конференции “Персистенция микроорганизмов» (2003 - 2009 гг.) (г. Оренбург); 4-й и 6-й Российской конференции «Современные проблемы антимикробной химиотерапии» (Москва, 2003, 2005 гг.,); международном конгрессе «Стратегия и тактика борьбы с внутрибольничными инфекциями на современном этапе развитии медицины» (Москва, 2006 г.); международной конференции «Новые технологии в военно-полевой хирургии и хирургии повреждений мирного времени» (С-Пб., 2006 г.); VI Всеармейской международной конференции «Инфекция в хирургии мирного и военного времени (Москва, 2006 г.); I, II Междисциплинарном микологическом форуме (Москва, 2009, 2010 гг); X и XII Международном конгрессе по антимикробной терапии МАКМАХ/ESCMD по антимикробной терапии (Москва, 2008, 2010 гг); Всероссийских научно-практических конференциях по медицинской микологии (X - XIII Кашкинские чтения) (С.-Петербург, 2007 - 2010 гг.).Разработка «штамм бактерий Klebsiella pneumonia № 278 – продуцент ингибитора лизоцима» экспонирована на Х Московском международном салоне инноваций и инвестиций (г. Москва, 7-10 сентября 2010 г.) и удостоена серебряной медали (О.В. Бухарин, Н.Б. Перунова). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 36 научных работ, из них 19 статей в журналах, рекомендованных ВАК, 1 монография и 2 патента РФ. Изданы 2 пособия для врачей.^ Диссертация изложена на 272 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, главу с описанием материалов и методов исследования, 4 главы собственных исследований, заключение, выводы и указатель литературы, включающий 91 отечественных и 249 зарубежных источников. Иллюстрации представлены 20 таблицами и 31 рисунками. ____________________СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ:______________________ Материалы и методы исследования Определение биомишеней функциональных взаимодействий микросимбионтов в условиях микросимбиоценоза оценивали с использованием модели кишечной микрофлоры, поскольку в данном биотопе четко определяются пары «доминант-ассоциант» (Шендеров Б.А., 1999; Mitsuoka T., 1990; Biavati B. et al., 1991). С целью выявления информативных признаков оценки межмикробных взаимодействий микроорганизмов в микросимбиоценозе кишечника человека была проведена оценка динамики видового состава и биологических свойств микрофлоры пациентов (от 18 до 45 лет) при обследовании на дисбиоз кишечника. Всего было изучено 20 микросимбиоценозов (10 – эубиоз и 10 – дисбиоз), изолировано 143 штамма микроорганизмов, представителей облигатно- и факультативно анаэробной микрофлоры. Исследование микробиоценоза кишечника осуществлялось в соответствии с «Методическими рекомендациями по применению бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение дисбактериоза кишечника» (М., 1986). Выделение и идентификация анаэробных микроорганизмов проводились в соответствии с руководством «Wadsworth-KTL anaerobic bacteriology manual» (2002). Идентификация выделенных штаммов микроорганизмов-симбионтов проводилась общепринятыми методами на основании морфологических, тинкториальных и культуральных свойств (Биргер М.О. и др., 1982). Биохимический профиль изучаемых культур микроорганизмов оценивали с помощью коммерческих тест-систем фирмы «Lachema» (Чехия) и «BioMereux» (Франция). Определяли уровень бактериальной обсемененности (Шапиро А.В., Фельдман Ю.М., 1984), видовой состав возбудителей и их биологические свойства: плазмокоагулазную, гемолитическую активности по общепринятым методикам (Биргер М.О., 1982), антагонистическую активность штаммов бифидобактерий методом отсроченного антагонизма в агаре (Muriana P. и Klaenhammer T.,1987), липолитическую активность - чашечным методом (Slifkin M., 2000), ДНК-азную активность - по методу Power D.A., McCuen P.J. (1988), антилизоцимную, антикомплементарную, «антиинтерфероновую», антилактоферриновую и антикарнозиновую активности фотометрическим методом (Бухарин О.В. с соавт., 1999, 2004), способность формировать биопленки фотометрическим методом (O`Toole G.F. et al., 2000). Изучение способности супернатантов микроорганизмов вызывать изменение концентрации цитокинов проводили путём соинкубирования экзометаболитов микроорганизмов с очищенными рекомбинантными цитокинами («Sigma»). Определение концентрации проводили иммуноферментным анализом («Цитокин»; СП-б, Россия), учет результатов проводили на фотометре Multiskan Labsystems (Финляндия) при длине волны 492 нм. Антицитокиновую активность выражали в процентах (%) инактивации цитокинов супернатантом исследуемых бактерий в опыте по сравнению с контролем. Модельные эксперименты по изучению регуляции проводили на клинических изолятах микроорганизмов типичных для микросимбиоценоза толстого кишечника человека и эталонных штаммах бактерий и грибов коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича и Американской коллекции типовых культур микроорганизмов (АТСС). В качестве доминантной микрофлоры были использованы культуры Bifidobacterium spp., а в качестве ассоциантов - микроорганизмы родов Escherichia, Klebsiella, Staphylococcus, Enterococcus, Candida. Исследование биологических свойств бифидобактерий и условно-патогенных представителей кишечной микрофлоры в условиях межмикробных взаимодействий проводили при добавлении стерильных супернатантов (продуктов жизнедеятельности микроорганизмов) микроорганизмов-симбионтов в питательный бульон по алгоритму, описанному в ряде работ (Елагина Н.Н., 2001; Семенов А.В., 2009; Иванова Е.В., 2010). Регуляцию биологических свойств микроорганизмов оценивали на 216 вариантах ассоциаций микросимбионтов. Распознавание «свой-чужой» в паре «доминант-ассоциант» микросимбионтов определяли по разработанной методике. Полученную математическую модель оценивали в динамике (на 1-й и 14-30 день) на 20 микросимбиоценозах биотопа дистального отдела кишечника человека, изолированных при обследовании на дисбиоз кишечника у пациентов от 18 до 45 лет. В качестве микробных ауторегуляторов использовали химические аналоги алкилоксибензолов (АОБ) С7-АОБ и С12-АОБ (Sigma). Получение диссоциантов осуществляли путем рассева микроорганизмов на агаризованные среды с получением не менее 100 колоний. Индекс диссоциации популяции определяли как долю (%) колоний определенного фенотипа к общему числу колоний. Исследования по влиянию АОБ на биологические свойства популяции микроорганизмов были проведены на эталонных штаммах В. bifidum №791 («Бифидумбактерин»), Lactobacillus acidophilus № 1 («Лактобактерин»), K. pneumoniae ГИСК № 278, B. cereus ГИСК № 279 (ГИСК им. Л.А. Тарасевича) и клинических изолятах E. coli № 111, S. aureus № 104. Биоритмы пролиферативной активности микроорганизмов в ассоциации изучали многократно в течение суток с 3-часовым интервалом, начиная с 08.00 часов по методике Тимохиной Т.Х с соавт. (2009). Данные по видовому составу и биологическим свойствам микрофлоры кишечника были подвергнуты статистической обработке в компьютерной оболочке Windows с помощью процессора электронных таблиц Microsoft Office Excel 2003 и программы «Биостат» (Гланц С., 1999) путем подсчета средней арифметической (M) и средней ошибки средней величины (m). Кластерный анализ биологических свойств микросимбионтов – с использованием программы «STATISTICA 6.0». Данные по определению регулирующего влияния экзометаболитов бифидобактерий и микроорганизмов-симбионтов на их биологические свойства были подвергнуты статистической обработке непараметрическим методом с применением критерия Манна-Уитни и параметрическим методом с применением t-критерия Стьюдента. Разница между сравниваемыми величинами считалась достоверной при значении р<0,05. Для установления связи между параметрами использовали метод ранговой корреляции по Спирмену (Гланц С., 1999). Для создания математической модели распознавания «свой-чужой» в паре «доминант-ассоциант» использованы автоматизированные системы программ «Факторный анализ» и «Дискриминантный анализ». Для оценки амплитудно-фазовых характеристик экспериментальных серий была применена автоматизированная система «Косинор-анализ», адаптированная к микробиологическим исследованиям (Тимохина Т.Х., Санников А.Г., 2009). ^ На первом этапе работы, исходя из того, что микросимбиоценоз – это биологическая система ассоциативного симбиоза, а для любой живой системы характерны внутренняя целостность, структурность (видовая, пространственная и функциональная), иерархичность, саморегуляция, с помощью которой поддерживается в целом существование системы (состав и структура, внутренние связи и преобразования в пространстве и во времени) (Геодакян В.А. 1970; Новосельцев В.Н., 1978; Аверьянов А.Н., 1985; Сурмин Ю.П., 2003), было сформулировано определение микросимбиоценоза. Микросимбиоценоз - единая динамическая система, обладающая выраженной способностью к ауторегуляции и аутостабилизации, состоящая из многовидовых консорциумов микроорганизмов, образующих симбиотические связи между собой и макроорганизмом с целью создания благоприятных условий для своей жизнедеятельности и оказывающих непосредственное влияние на состояние здоровья организма хозяина. Объединение микроорганизмов в систему, называемую микросимбиоценозом, обусловлено наличием системообразующего фактора – совокупности признаков, благодаря которым элементы системы объединяются и функционируют как единое целое. В связи с этим были выявлены наиболее информативные и универсальные признаки микросимбионтов, характеризующие системообразующий фактор функционирования микросимбиоценоза. Одним из таких универсальных признаков является рост/размножение микросимбионтов, поскольку для выживания любого вида составляющие его особи должны достигнуть определенной массы, без чего невозможно выполнение ими всех жизненных функций (Новосельцев В.Н., 1978). В данном случае в большей степени интерес представляло размножение микроорганизмов, поскольку оно определялось по конечному результату - количеству колониеобразующих единиц в исследуемом материале. Анализ биологических свойств микроорганизмов показал, что среди следующей группы признаков – персистентных свойств микроорганизмов, определяющих выживание микросимбионтов в организме хозяина и отражающих адаптацию микрофлоры в макроорганизме, частота встречаемости биопленкообразования и антилизоцимной активности микрофлоры преобладали среди других факторов персистенции микросимбионтов как при эубиозе, так и при дисбиозе кишечника. Пенетрантность биопленкообразования микроорганизмов при эубиозе составляла 98,3%, при дисбиозе – 96,4%, а АЛА – 91,5% и 95,2% соответственно (рис. 1). Распространенность других факторов персистенции была менее выражена, варьировала в зависимости от видового состава микросимбиоценоза и состояния биотопа дистального отдела толстого кишечника человека и ранжировалась следующим образом: АЛфА>АКА>АИА>АКрА (при эубиозе), АКА>АЛфА>АИА>АКрА (при дисбиозе). Что же касается факторов патогенности, то их распространенность, как и следовало ожидать, возрастала при дисбиозе кишечника, в сравнении с эубиозом, отражая, таким образом, наличие в микросимбиоценозе патогенных видов микроорганизмов и характеризуя формирование патологического, дисбиотического микросимбиоценоза, что было отмечено в работах отечественных и зарубежных авторов (Пинегин Б.В. и др., 2004; Бондаренко В.М. и др., 2008; Kuhbacher T. et.al. 2006; Chow J., 2010).  Рис. 1 – Пенетрантность биологических свойств микроорганизмов в микросимбиоценозе (при эубиозе и дисбиозе) дистального отдела толстого кишечника человека. Условные обозначения: БПО – биопленкобразование; АЛА – антилизоцимная активность; АКА – антикомплементарная активность; АИА – «антиинтерфероновая» активность; АЛфА – антилактоферриновая активность; АКрА – антикарнозиновая активнсоть; ГА – гемолитическая активность; ДА – ДНК-азная активность; ЛипА – липолитическая активность; ЛизА – лизоцимная активность; ПК – плазмокоагулаза; АБР – полиантибиотикорезистентность (к 5 и более антибиотикам) Проведение кластерной дифференцировки биологических свойств микроорганизмов, изолированных из различных микросимбиоценозов, показало, что существует коридор, в пределах которого наиболее значимыми при изучении микросимбиоценоза являются рост/размножение микроорганизмов, их АЛА и БПО (К = 0,9 – 1). Ко вторым по значимости биологическим свойствам микросимбионтов (в коридоре К = 0,6-0,9) было отнесено большинство других секретируемых бактериями факторов персистенции: АКА, АЛфА, АИА, АКрА. К слабовыраженным факторам (К = 0,3-0,6) были отнесены патогенные свойства микроорганизмов (гемолитическая, липолитическая, ДНК-азная, пазмокоагулазная активности), лизоцимная активность и полиантибиотикорезистентность, характеризующие патогенных виды микросимбионтов, характерные преимущественно для дисбиоза кишечника. Таким образом, подход к инфекции с позиции симбиологии позволил определить параметры важнейших физиологических функций выживания микроорганизмов, таких как размножение и персистенция (антилизоцимная активность и биопленкобразование), составляющих системообразующий фактор микросимбиоценоза кишечника. Указанные характеристики микросимбионтов оказались универсальными, так как встречались практически с одинаковой частотой при эубиозе и дисбиозе кишечника и имели высокий коэффициент кластерной дифференцировки, по сравнению с другими биологическими параметрами микроорганизмов. На следующем этапе работы были охарактеризованы взаимодействия микроорганизмов в системе «доминант-ассоциант» под контролем системообразующего фактора микросимбиоценоза. Известно, что для каждого биотопа существует свой «ключевой» (основной) вид(ы) нормальной микрофлоры, обладающий универсальным набором характеристик микробного антагонизма в защите этого биотопа. Выбор в качестве доминантов Bifidobacterium spp. обусловлен тем, что именно бифидобактерии являются важнейшими представителями облигатной микрофлоры кишечника (Гончарова Г.И., 1987; Roy D., 1992; Vasiljevic T. et al., 2008). Функции бифидофлоры разнообразны, одной из которых является поддержание нормального микроэкологического статуса занимаемого биотопа (Шендеров Б.А., 1996, 1998). При оценке влияния бифидобактерий на рост/размножение ассоциантов выявлены различные типы взаимодействий микроорганизмов в паре «доминант-ассоциант», характер которых зависел от видовой принадлежности микросимбионтов. Супернатант бифидобактерий в 72,2 – 86,1% случаев подавлял рост/размножение ассоциантов, представителей дисбиотической микрофлоры, за исключением грибов рода Candida (p<0,05). Напротив, угнетение ростовой функции представителей нормофлоры под влиянием экзометаболитов Bifidobacterium spp. встречалось реже (в 44,4 - 47,2% случаев) и даже был отмечен стимулирующий эффект (в 19,5 – 30,6% случаев) (p<0,05) (рис. 2). Снижение концентрации экзометаболитов бифидобактерий в среде культивирования до субингибиторных не влияло на рост/размножение микросимбионтов, но оказывало модифицирующее действие на их персистентные свойства. Оказалось, что в данной концентрации экзометаболиты бифидофлоры преимущественно (в 55,6 – 80,6 % случаев) ингибировали образование биопленок условно-патогенных бактерий и дрожжевых грибов, характерных для дисбиоза кишечника и, напротив, чаще (в 33,3 – 50% случаев) стимулировали биопленкообразование микроорганизмов представителей нормофлоры (лактозопозитивных негемолитических кишечных палочек и энтерококков) (p<0,05) (рис. 3). Таким образом, на примере используемой модели пары «доминант-ассоциант» (под контролем изменения биопленкообразования ассоциантов)  Рис. 2 – Изменение роста/размножения условно-патогенных микроорганизмов при соинкубировании с экзометаболитами Bifidobacterium spp. ^  Рис. 3 – Изменение биопленкообразования условно-патогенных микроорганизмов при соинкубировании с экзометаболитами Bifidobacterium spp. ^ показано, что доминантный микросимбионт оказывал позитивное воздействие: с одной стороны, - стимулируя ассоциативные микросимбионты, характерные для эубиоза кишечника человека, а с другой – ингибируя виды микроорганизмов, часто обнаруживаемые при дисбиозе кишечника, что может иметь значение при реализации бифидобактериями колонизационной резистентности биотопа. Дальнейшая оценка межмикробных взаимодействий микроорганизмов в паре «доминант-ассоциант» с использованием другой характеристики (антилизоцимной активности микроорганизмов) - составляющей системообразующего фактора микросимбиоценоза, показала результаты, сходные с изменением биопленкобразования микросимбионтов. Установлено, что доминантная микрофлора (бифидобактерии) чаще (в 50 – 66,6% случаев) стимулировала антилизоцимную активность лактозопозитивных негемолитических (лак «+» гем «-») E. coli и непатогенных E. faecium, образуя с ними микросимбиоценоз характерный для эубиоза кишечника (p<0,05) (рис. 4). Напротив бифидобактерии в 61,1 – 77,8% снижали антилизоцимную активность лактозонегативных гемолитических (лак «-» гем «+») E. coli, K. pneumoniae и C. albicans (p<0,05). Исключение составили исследуемые культуры S. aureus, на АЛА которых экзометаболиты Bifidobacterium spp. оказывали разнонаправленное воздействие.  Рис. 4 – Изменение антилизоцимной активности условно-патогенных микроорганизмов при соинкубировании с экзометаболитами Bifidobacterium spp. ^ Полученные данные подтверждены клинико-бактериологическими материалами о частоте высеваемости ассоциаций условно-патогенных бактерий с разнообразными видами бифидофлоры у пациентов различных возрастных групп при эубиозе и дисбиозе кишечника (Бондаренко В.М. с соавт., 1998; Барановский А.Ю. с соавт., 2008; Амерханова А.М., 2009; Reuter G., 2001; Collado M.C. et al., 2008). Обобщение полученных результатов позволило определить антилизоцимную активность микросимбионтов, как «биомишень», через которую осуществляются межмикробные взаимоотношения в их ассоциации, что раскрывает один из механизмов функционирования микросимбиоценоза при дисбиозе и эубиозе биотопа дистального отдела толстого кишечника человека. Кроме того, АЛА микроорганизмов, отвечает основным признакам, характеризующим «биомишень»: «качество», «распространенность», «специфичность», «разработка метода анализа» (Арчаков А.И., Иванов А.С., 1996; Дубанов А.В., 2001; 1999; Hodgson J, Marshall A., 1998). Целесообразность использования антилизоцимного признака бактерий отмечена в работах по изучению взаимоотношений между доминантными и ассоциативными симбионтами при формировании микробиоценоза женской репродуктивной системы (Черкасов С.В., 2006; Бухарин О.В. и др., 2007) и при межклеточных взаимоотношениях бактериально-грибкового сообщества в микросимбиоценозе кишечника человека (Бухарин О.В. и др., 2006). Ранее использование АЛА бактерий было применено для исследования механизма действия различных препаратов (антибиотиков, гормонов и др.) и оценки эффективности лечебных мероприятий, что нашло отражение в ряде экспериментальных и клинических работ (Бухарин О.В., 1999; Кириллов Д.А., 2004; Фадеев С.Б., 2009). Таким образом, изучение роста/размножения и обеих часто обнаруживаемых у микроорганизмов персистентных характеристик (БПО и АЛА), включенных в системообразующий фактор микросимбиоценоза, показало сходные изменения данных признаков при взаимоотношениях микросимбионтов в паре «доминант-ассоциант». Полученные данные о взаимодействии микросимбионтов в паре «доминант-ассоциант» свидетельствуют, что экзометаболиты бифидобактерий, обладают плейотропным эффектом и способны осуществлять регуляторную функцию: в высоких концентрациях угнетать рост/размножение условно-патогенных микроорганизмов, а в субингибиторных – модифицировать их персистентные свойства (антилизоцимную активность и биопленкобразование). Тем самым бифидобактерии либо напрямую оказывают антимикробное действие на микрофлору, либо опосредованно, через снижение биологических свойств микросимбионтов, сочетано с иммунной системой макроорганизма, способствуя элиминации патогенов из организма хозяина. В других работах также показано, что метаболиты микросимбионтов могут обладать плейотропным эффектом и в субингибиторной концентрации выступают в качестве сигнальных молекул при регуляции внутри- и межвидовых взаимоотношений микроорганизмов (Fajardo A., Martinez J. L., 2008): снижают экспрессию генов SOS-ответа (Mesak L. R., Miao V., Davies J., 2008), уменьшают биопленкообразование (Starner T. D. et. al., 2008), влияют на ростовые свойства (Kolenbrander P. E. et. al., 2002), а также изменяют выраженность вирулентных свойств у разных видов бактерий (Linares J. F. et. al., 2006; Skindersoe M. E. et. al., 2008). Проведенные предварительные эксперименты наводят на мысль, что в регуляции межмикробных взаимоотношений при функционировании микросимбиоценоза важную роль играют микробные метаболиты, оказывающие регуляторное действие на биологические свойства микросимбионтов. К сходным выводам пришли Shank A. E. and Kolter R. (2009), которые связывали регуляторные взаимодействия микроорганизмов с составом экзометаболитов микрофлоры, а именно, с наличием в супернатанте «сигнальных» молекул. С одной стороны, фенотипические изменения микробных популяций и изучение биомодуляции между микроорганизмами свидетельствуют, что представители микрофлоры могут общаться с помощью малых микробных молекул, а с другой - данные микробные молекулы могут быть использованы в качестве индукторов новых метаболитов-посредников в результате межвидового взаимодействия симбионтов при ассоциативном симбиозе. Вот почему полученные результаты по взаимодействию микроорганизмов в паре «доминант-ассоциант» характеризовали лишь тенденцию изменений изучаемых признаков при прямом воздействии экзометаболитов доминантов на ассоцианты. В связи с этим, был изменен алгоритм эксперимента, при котором определение влияния экзометаболитов бифидобактерий на рост/размножение, антилизоцимную активность и биопленкобразование микроорганизмов проводили после предварительного соинкубирования культур бифидобактерий с супернатантами микросимбионтов (рис. 5). Проведение такого рода экспериментов было основано на предположении, что в условиях микросимбиоценоза экзометаболиты ассоциантов способны модифицировать биологические свойства бифидобактерий, индуцируя у них выработку вторичных экзометаболитов, что способствует изменению взаимодействия бифидофлоры с микросимбионтами и может оказаться полезным при микробном распознавании «свой-чужой». Проведенные эксперименты позволили выявить способность доминантов в ответ на воздействие супернатантов ассоциантов более четко усиливать или           Рис. 5 - Алгоритм микробного определения «свой-чужой» в паре «доминант-ассоциант». Условные обозначения: РС – ростовые свойства (рост/размножение); АЛА – антилизоцимная активность; БПО – биопленкобразование угнетать эффекты влияния бифидофлоры на физиологические функции ассоциантов. Внесение в среду культивирования субингибиторных концентраций экзометаболитов ассоциантов не увеличивало численность Bifidobacterium spp., что позволило заключить, что последующее влияние метаболитов доминантов на микросимбионты не было связано с изменением численности бифидобактерий, а являлось следствием изменения их функциональной активности. Предварительные опыты по изучению влияния экзометаболитов бифидобактерий на ассоцианты под контролем их ростовых свойств и персистентных характеристик выявили преимущественное ингибирующее (62,5±2,1%) воздействие доминантов на ассоцианты, характерные для дисбиоза кишечника (клебсиеллы, гемолитические лактозонегативные эшерихии и др.), и, напротив – чаще стимулирующий (41,7±9,6%) или индифферентный (32,9±4,4%) тип влияния на бактерий, представителей нормофлоры (лактозопозитивные негемолитические эшерихии, энтерококки) (p<0,05). Использование описанного алгоритма микробного распознавания показало, что предварительное соинкубирование бифидобактерий с супернатантами видов микроорганизмов, представителей дисбиотической микрофлоры способствовало нарастанию распространенности ингибирующего эффекта влияния доминантов на ростовые свойства ассоциантов с 59,7±5,3 % до 100% (рис. 6 А) (p<0,01). В тоже время, было отмечено уменьшение (с 45,8±4,9% до 12,5±2,3%) распространенности ингибирующего типа воздействия доминантов на бактерий, представителей нормофлоры (p<0,01). Супернатанты бифидобактерий, предварительно соинкубированных с супернатантами лактозопозитивных негемолитических эшерихий и энтерококков, увеличивали пенетрантность стимулирующего эффекта воздействия Bifidobacterium spp. на представителей нормофлоры с 25±2,7% до 62,5±5,9% (p<0,01). Аналогичные данные были получены и при определении влияния экзометаболитов бифидобактерий на биопленкобразование микроорганизмов (рис. 6 Б). Культуральная жидкость доминантов, полученная от бифидобактерий предварительно обработанных супернатантами ассоциантов, приводила к нарастанию ингибирующего эффекта влияния доминантов на БПО ассоциантов, характерных для дисбиоза кишечника человека с 66,7±7,1% до 98,1±1,9% (p<0,01). У ассоциантов, представителей нормофлоры, отмечено исчезновение ингибирующего влияния доминантов на ассоцианты и увеличение распространенности стимулирующего эффекта воздействия супернатанта Bifidobacterium spp. с 41,7±4,8% до 76,9±7,3% (p<0,01). Сходная закономерность была отмечена и при определении влияния супернатантов бифидобактерий (предварительно обработанных СН ассоциантов и без таковой) на антилизоцимную активность микросимбионтов. А)  Б)  Рис. 6 – Изменение ростовых свойств (А) и биопленкообразования (Б) микроорганизмов под действием бифидобактерий, предварительно соинкубированных с супернатантом микросимбионтов. Условные обозначения: I – эффекты влияния бифидобактерий на условно-патогенные микроорганизмы (УПМ); II – эффекты влияния бифидобактерий, предварительно соинкубированных с супернатантом УПМ. Кроме того, в 49 – 62,6% случаев выявлено усиление эффекта влияния доминантов на ассоцианты: снижение экспрессии РС, БПО и АЛА у микроорганизмов, представителей дисбиотической микрофлоры, под действием СН бифидобактерий и усиление экспрессии данных признаков у представителей нормофлоры (табл. 1). При проведении экспериментов мы обратили внимание, что выраженность «ответа» бифидофлоры на присутствие в среде СН микросимбионтов не зависела от изучаемых свойств (РС, АЛА, БПО) микросимбионтов, а была связана с видом бифидобактерий, убывая в ряду B. longum > B. adolescentis > B. bifidum. В связи с тем, что использование в качестве тест-культуры доминантов B. longum позволяло получать более четкие результаты, а так же учитывая, что данный вид бифидобактерий часто обнаруживается при эубиозе дистального отдела кишечника человека, мы использовали B. longum для осуществления распознавания «свой-чужой» при взаимодействии микроорганизмов в системе «доминант-ассоциант» в микросимбиоценозе кишечника человека. Поскольку, как было установлено выше, предварительное соинкубирование бифидобактерий с супернатантами ассоциантов, позволяло оценить распознавание бифидофлорой данных ассоциантов по изменению их основных физиологических функций, то дальнейшие эксперименты были проведены по схеме, представленной на рис. 5. Разработанный алгоритм микробного распознавания в микросимбиоценозе кишечника человека, позволил экспериментально выявить оппозитный феномен (усиление/подавление) важнейших физиологических функций выживания микросимбионтов (рост/размножение, биопленкобразование и антилизоцимная активность) и дифференцировать «свои» и «чужие» виды микроорганизмов в парах «доминант-ассоциант». В табл. 2, приведены полученные данные, из которых видно, что СН культуры B. longum, предварительно соинкубированной с СН лактозопозитивной негемолитической эшерихии, не изменял выраженности ее ростовых свойств и увеличивал экспрессию АЛА и БПО (p<0,01), в связи с чем, данная кишечная палочка могла быть отнесена к «своим» видам микросимбионтов. Также к «своему» виду был причислен штамм E. faecium (используемый в качестве компонента пробиотиков), воздействие СН которого на культуру B. longum приводило к увеличению экспрессии РС, АЛА и БПО данного энтерококка под действием СН бифидобактерий (p<0,01). Предварительное соинкубирование B. longum с супернатантами клебсиелл, золотистого стафилококка, лактозонегативной гемолитической кишечной палочки и грибов рода Candida (с каждым в отдельности), способствовало снижению
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям