Биорегуляция микросимбионтов в микросимбиоценозе кишечника человека 03. 02. 03 «Микробиология»
|
|
Скачать 0.6 Mb.
|
|
Табл. 1 – Изменение экспрессии физиологических функций ассоциантов под действием бифидобактерий, предварительного соинкубированных с супернатантом данных ассоциантов. Условные обозначения: «+» - увеличение экспрессии свойств ассоциантов; «-» - снижение экспрессии свойств ассоциантов; в % указано различие в экспрессии между воздействием на ассоциантов супернатантов бифидобактерий без предварительного соинкубирования с супернатантом микроорганизмов и после такового.
Табл. 2 – Оценка взаимодействия пар «доминант-ассоциант» для распознавания «свой-чужой» в микросимбиоценозе. ^ экспрессии РС, БПО и АЛА микроорганизмов, на основании чего они были отнесены к «чужим» видам микросимбионтов (p<0,01).Разработанный способ оценки микробного распознавания «свой-чужой» позволил проводить такую «диагностику» не только на межвидовом, но и внутривидовом уровне. Иллюстрацией внутривидового распознавания могут служить данные по влиянию бифидобактерий на кишечную палочку – лактозопозитивную негемолитическую и лактозонегативную гемолитическую (табл. 2). Лактозонегативные гемолитические эшерихии (характерные для патобиоценоза) активировали антагонизм бифидобактерий против себя, в результате чего происходило снижение РС, АЛА и БПО данных эшерихий; лактозопозитивные E. coli (нормоценоз), воздействуя на бифидобактерии, способствовали усилению РС, АЛА и БПО кишечных палочек (p<0,01). Известно, что при антагонистическом типе взаимодействия микроорганизмов может происходить модификация антагонистической активности продуцента в связи с активным воздействием на него симбионта: модификация обмена веществ или морфологические и функциональные изменения микросимбионтов (Shank A. E., Kolter R., 2009). Изучение этих вопросов важно для понимания механизмов формирования и функционирования микросимбиоценозов, через регуляцию антагонизма доминантных микроорганизмов ассоциативными микросимбионтам. Проведенные выше эксперименты и данные кластерного анализа подтвердили возможность использования роста/размножения микроорганизмов, их биопленкообразования и антилизоцимной активности в качестве системообразующего фактора микросимбиоценоза. Изменение данных признаков микросимбионтов в паре «доминант-ассоциант» имел уровень значимости 98% и позволял оценивать функциональные взаимосвязи микросимбионтов в 96 % случаев (p<0,01). В связи с этим полученные данные об изменении базовых физиологических функций микроорганизмов были обработаны с помощью программы «Дискриминантный анализ». Это позволило создать математическую модель дифференцировки штаммы микроорганизмов в паре «доминант-ассоциант», изолированных из микросимбиоценоза кишечника человека. По результату взаимодействия ассоциантов с бифидофлорой получено адекватное математическое выражение: Д = х1а1 + х2а2 + х3а3 + С, где Д - дискриминантная функция, характеризующая искомый вариант распознавания микросимбионтов бифидофлорой; х – различие между значением свойства ассоцианта в опыте (под действием супернатанта бифидобактерий, предварительно соинкубированных с экзометаболитами данного ассоцианта) и контроле (без влияния бифидобактерий) в %; а - коэффициент показателя; С - поправочная константа. В табл. 3 представлены коэффициенты для каждого показателя и поправочные константы.
Таблица 3 - Коэффициенты показателей и поправочные константы для дифференциации «свой-чужой» бифидобактериями при взаимодействии с ассоциантами. Для установления принадлежности исследуемых микросимбионтов к «своему» или «чужому» штамму, находили разницу полученных у ассоциантов количественных значения по показателям в опыте (под действием супернатанта бифидобактерий, предварительно соинкубированных с экзометаболитами данного ассоцианта) и контроле (без влияния бифидобактерий), переводя их в проценты и используя для расчета дискриминантной функции по приведенной формуле. Расчет проводили по всем строкам соответствующей таблицы. Наибольшая величина дискриминантной функции из всех полученных будет в 95% случаев соответствовать обозначенному на данной строке результату (типу) распознавания. Пример 1. Исследуемый штамм E. coli характеризовался следующими признаками: РС – 0,92 OD630, АЛА – 0,73 мкг/мл* OD, БПО – 0,12 ед., после воздействия экзометаболитов бифидобактерий исследуемые свойства E. coli изменились: РС – 1,3 OD630, АЛА – 1,37 мкг/мл* OD, БПО – 0,34 ед. Разница между опытным и контрольными значениями в процентах составила: РС – (+41,3%), АЛА - (+87,7%), БПО – (+183,3%). Расчет по формуле с использованием представленных в таблице коэффициентов показал, что: Д1 = 2.78710 х 41,3 + 8.43545 х 87,7 +7.23118 х 183,3 + (-272.13568) = 1907,9 Д2 = (-3.74074) х 41,3 + (-10.87087) х 87,7 + (-6.50287) х 183,3 + (-358.01895) = - 2657,9 В результате проведенного расчета максимальная величина дискриминантной функции установлена на первой строке (Д1), что позволило отнести исследуемую культуру E. coli к «своему» штамму бактерий. Пример 2. Исследуемый штамм C. albicans характеризовался следующими признаками: РС – 1,53 OD630, АЛА – 1,78 мкг/мл* OD, БПО – 0,21 ед., после воздействия экзометаболитов бифидобактерий исследуемые свойства C. albicans изменились: РС – 0,9 OD630, АЛА – 1,15 мкг/мл* OD, БПО – 0,11 ед. Разница между опытным и контрольными значениями в процентах составила: РС – (- 41,2%), АЛА - (- 35,4%), БПО – (- 47,6%). Расчет по формуле с использованием представленных в таблице коэффициентов показал, что: Д1 = 2,78710 х (-41,2) + 8,43545 х (-35,4) +7,23118 х (-47,6) + (-272,13568) = - 1029,8 Д2 = (-3,74074) х (-41,2) + (-10,87087) х (-35,4)+(-6,50287) х (-47,6) + (-358,01895) = 490, 5 В результате проведенного расчета максимальная величина дискриминантной функции установлена на второй строке (Д2), что позволило отнести исследуемую культуру C. albicans к «чужому» штамму микроорганизмов. Для проверки математической модели был проведен анализ видового состава микросимбиоценозов дистального отдела толстого кишечника человека у 20 пациентов в динамике (на 1-й и 14-30 день). Решение вопроса о принадлежности ассоциантов к «своему» или «чужому» виду проводили с использованием разработанной модели оценки распознавания «свой-чужой» в паре «доминант-ассоциант». Полученные результаты показали эффективность разработанной модели в 90±6,9% случаев. Микроорганизмы, которые по результату воздействия на них бифидобактерий были отнесены к категории «чужой», при повторном исследовании микросимбиоценоза кишечника через 14-30 дней снижали свою численность либо не обнаруживались, тогда как «свои» виды микросимбионтов достоверно не изменяли свою численность и сохранялись в ассоциации с бифидофлорой на протяжении данного времени. Таким образом, полученные результаты показали, что при ассоциативном симбиозе не только сам хозяин в состоянии организовать собственную защиту от ассоциантов, различая «чужаков» при помощи рекогносцировочных механизмов врожденного иммунитета (ПРР клеток), но и при помощи своей нормофлоры, которая, судя по приведенным результатам биорегуляции микросимбионтов, способна реализовать принцип «микробного распознавания» ассоциантов в системе «свой – чужой». Другими словами, на основании экспериментальных данных выявлен феномен оппозитного (усиление/подавление) влияния микроорганизмов на их биологические свойства (антагонистические, персистентные) пары «доминант – ассоциант» в условиях микросимбиоценоза, когда «свои» поддерживают «своих», но проявляют нетерпимость к «чужим» микробным видам. Вероятно, в этом заложен определенный биологический смысл защиты хозяина через его колонизационную резистентность, реализуемую в условиях микросимбиоценоза при помощи нормофлоры хозяина. На заключительном этапе работы были оценены некоторые механизмы адаптации микроорганизмов в условиях ассоциативного симбиоза. Среди них было рассмотрено значение микробных экзометаболитов адаптогенов (алкилоксибензолов), влияние микрофлоры на про- и противовоспалительные цитокины и хронобиологические особенности взаимодействия микроорганизмов в ассоциации. В связи со значимостью алкилоксибензолов (АОБ) как метаболитов микроорганизмов, обеспечивающих защитные эффекты микробной клетки (Эль-Регистан Г.И., 2005; Николаев Ю.А., 2006), было оценено их влияние на изучаемые базовые физиологические функции микросимбионтов – размножение и персистенцию бактерий. Учитывая, что вклад в адаптацию также вносит и внутрипопуляционная фенотипическая вариабельность, от которой зависит результативность симбиозов, замещение и поддержание продуктивных вариантов (Головлев Е.Л., 1998; Проворов Н.А., 2000; van der Woude M.W. et al., 2004), изучение данного явления проводили с позиции изменения популяционной структуры микроорганизмов. Проведенные исследования позволили установить, что низкомолекулярные внеклеточные регуляторные метаболиты бактерий контролируют развитие адаптивных реакций как доминантных, так и ассоциативных бактерий, влияя на их популяционную гетерогенность по антилизоцимному признаку. При этом влияние АОБ на микроорганизмы было видонеспецифическим и зависело от химического строения и концентрации препарата в среде культивирования. Установлено, что количество алкилоксибензолов 1 мкг/мл в среде являлось пороговой концентрацией, при которой отмечалось изменение популяционной структуры микроорганизмов разных групп в сравнении с контролем. Отмечена стимуляция ростовых свойств доминантной микрофлоры и угнетение признака у ассоциативных микросимбионтов. Этот эффект выявлен у гексилрезорцина, при действии которого отмечено увеличение оптической плотности культур бифидобактерий и лактобацилл на 34±2% (p<0,05) и снижение – у штаммов S.aureus, B. cereus и гемолитических E. coli в среднем на 40±3,1% (p<0,05). Оказалось, что оба химических аналога алкилоксибензолов стимулировали биопленкобразование B. bifidum (рис. 7 А). В эксперименте также была выражена концентрационная зависимость действия химических аналогов алкилоксибензолов. Максимальные изменения в популяции наступали при концентрации АОБ 10 мкг/мл, когда большинство клонов (90-95%) находилось в области средних и высоких показателей биопленкообразования, а низкие значения признака отсутствовали. В целом отмечалось увеличение среднепопуляционного уровня биопленкообразования бифидобактерий в 1,25 раза в сравнении с контролем. Аналогичные данные были получены в отношении популяции лактобацилл. Напротив, у K. pneumoniae, как и других представителей ассоциативных бактерий, изменение структуры популяции сопровождалось снижением доли клонов с высоким и средним значением изучаемого признака и увеличение клонов с низкой способностью к образованию биопленок. При действии метилрезорцина выявлено снижение среднего уровня признака на 31,2 – 43 % в сравнении с контролем. При влиянии гексилрезорцина среднепопуляционный уровень способности к образованию биопленок не изменялся за счет сохранения клонов с высоким уровнем признака. Исследование антилизоцимной активности бактерий на примере популяции K. pneumoniae № 278 показало, что увеличение концентрации С-7 АОБ (амфифильный, метилрезорцин) до 10 мкг/мл приводило к образованию только двух основных фенотипов в популяции: нетипичных вариантов, не обладающих АЛА (40±4,9%) и диссоциантов с низкими значениями антилизоцимной активности (60±4,9%) (рис. 7 Б). Аналогичные изменения наблюдались при воздействии метилрезорцина на другие виды условно-патогенных бактерий (S. aureus, B. cereus, гемолитические E. coli). При этом среднепопуляционное значение признака бактерий уменьшилось на 22 – 75 % в сравнении с контролем (p<0,05). А)   Б)  Рис. 7 – Изменение популяционной структуры бактерий по биопленкообразованию (А) и антилизоцимному признаку (Б) под влиянием алкилоксибензолов. ^ В отличие от ассоциативной микробиоты, у доминантных бактерий (бифидобактерий и лактобацилл) внесение в среду культивирования метилрезорцина, наряду с появлением фенотипических вариантов без антилизоцимной активности и увеличением доли диссоциантов с низким уровнем АЛА, способствовало сохранению клонов со средними значениями антилизоцимного свойства (в 20±4,0% случаев), а изменение среднепопуляционного уровня АЛА снизилось на 30±4,6% (p<0,05) от исходного уровня признака. Возможно, что в условиях микросимбиоценоза, при повышении плотности популяции бактерий и, как следствие, увеличении количества амфифильных АОБ в среде, популяция доминантных бактерий будет обладать большим адаптивным потенциалом в отношении факторов врожденного иммунитета (лизоцима), нежели ассоциативные микроорганизмы, за счет сохранения в структуре популяции вариантов экспрессирующих средние значения АЛА. При соинкубировании бактерий с С12-АОБ (гексилрезорцином), который отличался большей длиной алкильного радикала, отмечалась диссоциация популяции бактерий, в результате которой, наряду с появлением вариантов (35 - 45%) не обладающих антилизоцимным признаком, происходило увеличение доли диссоциантов (45 - 50%) с высоким уровнем АЛА. Кроме того, в популяции выявлено сохранение доли клонов со средним уровнем способности инактивировать лизоцим. При этом среднеопуляционный уровень антилизоцимной активности микроорганизмов не изменялся. Очевидно, что гексилрезорцин, в сравнении с метилрезорцином, обладал большим адаптогенным эффектом на микроорганизмы, поскольку при диссоциации популяции под действием С-12 АОБ, несмотря на наличие клонов, не обладающих АЛА, присутствовали варианты с различной степенью выраженности признака, что в итоге уравнивало среднепопуляционный уровень антилизоцимной активности бактерий. Установленные изменения были характерны как для представителей доминантной, так и ассоциативной микрофлоры и не зависели от строения их клеточной стенки. Таким образом, проведенные исследования позволили определить влияние мембранотропных ауторегуляторных метаболитов (гомологов алкилоксибензолов) на диссоциацию популяции индигенных бактерий биотопа дистального отдела толстого кишечника человека, что, вероятно, является одним из механизмов адаптации доминантной микрофлоры к условиям их окружения. Можно предположить, что присутствие С12-АОБ в окружающей среде способствует усилению колонизации бифидобактериями желудочно-кишечного тракта, что важно для формирования нормобиоценоза при эубиозе кишечника человека. Полученные данные, по-видимому, объясняют один из механизмов формирования ассоциативного симбиоза в условиях дисбиоза и эубиоза кишечного биотопа. При рассмотрении инфекции как результата паразит-хозяинных отношений очевидно, что инфекционный процесс – это модельная система ассоциативного симбиоза, где организм хозяина и его микрофлора образуют взаиморегулируемую систему (Бухарин О.В. и др., 2007, 2010), контролирующуюся посредством цитокиновой сети, определяющей направленность иммунного ответа (Черешнев В.А., 2001). Патогенные микроорганизмы, чтобы ослабить действие иммунной системы, могут модифицировать продукцию определенного вида цитокинов (Романова Ю.М., 2001, 2002; Horvat R., 1989; Leidal K.G., 2003). К сожалению, данные о распространенности и выраженности способности доминантных и ассоциативных микроорганизмов, представителей микрофлоры дистального отдела толстого кишечника человека к деградации/связыванию различных видов цитокинов единичны и не позволяют в полной мере оценить значимость этого свойства во взаимоотношениях микроорганизмов и человека. Проведенные исследования выявили наличие антицитокиновой активности у 58,1±11,9% исследуемых штаммов бактерий в отношении про- и противовоспалительных цитокинов. Высокие значения АЦА в отношении провоспалительного цитокина ФНО-α были характерны для доминантов - культур Bifidobacterium spp. и Lactobacillus spp. и в среднем составляли 62±8,7%, 67±9,8% соответственно. Низкие значения данного свойства отмечены у экзометаболитов ассоциативных S. aureus (28±6,1 %) и K. рneumoniaе (26±6,2 %) (рис. 10). Снижение концентрации провоспалительного цитокина ИЛ-6 происходило под действием всех изученных ассоциантов (стафилококков и клебсиелл) (р<0,05), однако экспрессия данного признака в среднем составляла не более 19,5±4,1%. АЦА регистрировалась при взаимодействии ИЛ-6 с экзометаболитами культур Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp. и клебсиелл (11 – 19,5%). Супернатанты представителей нормальной микрофлоры (бифидобактерии и лактобациллы) обладали высоким уровнем экспрессии антицитокиновой активности в отношении противовоспалительного цитокина ИЛ-10 (р<0,05), которая в среднем составлял 70±9,6 % и 35±5,1 % соответственно. У исследуемых видов ассоциативных микроорганизмов обнаруживались более низкие значения АЦА в диапазоне 14 – 25 %. Таким образом, полученные в работе результаты свидетельствуют о наличии АЦА у доминантных и ассоциативных микроорганизмов. Полученные данные о снижении концентрации цитокинов при воздействии супернатантов микроорганизмов в известной степени согласуются имеющимся сведениям о протеолитической модификации цитокинов различными видами бактериальных протеаз, содержащихся в супенатантах микроорганизмов (Leidal K.G., 2003; Kubica M., 2008; Sheets S.M., 2008; Potempa J., 2009).   Рис. 10 – Экспрессия антицитокиновой активности (АЦА) микроорганизмов в отношении про- (ФНО-α) и противовоспалительного (ИЛ-10) цитокинов. ^ *- р<0,05 (достоверность различия между уровнем АЦА доминантной и ассоциативной микрофлоры). Высокая экспрессия АЦА в отношении как провоспалительного цитокина - ФНО-α, так и противовоспалительного цитокина - ИЛ-10 у доминантов (бифидобактерий лактобацилл), в сравнении с ассоциативной микрофлорой, расширяет наши представления о регулирующем влиянии нормальной микробиоты на цитокиновый статус организма человека, что может обуславливать адаптацию микросимбионтов в организме хозяина и участие в формировании иммунологической толерантности к индигенной микрофлоре, посредством изменения концентрации цитокинов в микроокружении клеток (Jump R.L., 2004; Silva M. F., 2010; Tanoue T., 2010). Определение некоторых адаптационных механизмов, описанных выше в большей степени касалось выявления биорегуляторных механизмов «статической адаптации» микроорганизмов, отражающее их устойчивость к условиям среды (уровень адаптированности) и оценивающееся по параметрам окружающей среды в конкретный момент времени. Однако существует «динамическая адаптация», которая отражает процесс приспособления биосистемы к меняющимся условиям среды во времени и раскрывающая механизмы приспособления, их особенности и принципы регулирования (Казначеев В.П.,1980). Для функционирования живых систем и их выживания в изменяющейся окружающей среде постоянно требуется координация и регуляция разнообразных процессов сложной интегрированной симбиотической системы, обеспечивающей приспособление, что возможно лишь при изменении хроноструктуры физиологической активности биологических характеристик микроорганизмов под действием экзометаболитов ассоциативной микрофлоры. В связи с этим на модели S. aureus, E. coli, P. aeruginosa и C. albicans мы провели эксперименты по изучению биоритмов физиологических функций микроорганизмов в ассоциациях. Результаты исследования позволили выявить изменение профиля ритма роста/размножения, антилизоцимной активности и биопленкообразования микросимбионтов в ассоциации. Изменение ритмометрических показателей ростовых свойств S. aureus происходило под влиянием экзометаболитов грамнегативных микроорганизмов, тогда как динамику роста/размножения грамнегативной микрофлоры (E. сoli и P. aeruginosa) в большей степени изменяли продукты метаболизма C. albicans и S. аureus (p<0,05). На рис. 11 показано изменение роста/размножения исследуемых культур стафилококков и кишечной палочки в ассоциации.  Рис. 11 – Изменение биоритма роста/размножения S. aureus и E. coli в их ассоциации. Представленные данные свидетельствуют об изменении профиля ритма микросимбионтов при их взаимодействии. У штаммов S. aureus и E. coli сохранялись ультрадианные ритмы ростовых свойств под воздействием экзометаболитов микробов-ассоциантов, но дополнительно появлялись циркадианные ритмы изучаемого показателя, что свидетельствовало о возможном усилении адаптивных функций популяции. Анализ ритмометрических показателей биопленкообразования S. aureus под влиянием экзометаболитов микробов-ассоциантов выявил стабильность циркадианного ритма данного персистентного фактора возбудителя. Наиболее выраженное изменение ритмометрических показателей было выявлено в отношении биопленкобразования при воздействии экзометаболитов C. albicans на культуру P. aeruginosa. Под влиянием экзометаболитов S. aureus, E. coli, C. albicans в спектральном составе появился дополнительно стабильный циркадианный ритм с возрастанием амплитуды в 2-3 раза. В то же время экзометаболиты C. albicans нивелировали ультрадианный ритм и достоверно снижали мезор (р<0,05). Воздействие экзометаболитов ассоциативной микрофлоры изменяло профиль ритма антилизоцимной активности и способствовало появлению у всех исследуемых штаммов 24-часового ритма АЛА, что можно объяснить тем, что лизоцимная активность как один из факторов неспецифической резистентности макроорганизма проявляет циркадианную активность (Матияш И.Н.,1983), а способность микроорганизмов инактивировать лизоцим хозяина сформировалась в результате симбиотических отношений с макроорганизмом (Бухарин О.В.,1999). Таким образом, выявленные изменения (синхронизация) ритмометрических параметров биологических ритмов роста/размножения, БПО и АЛА микроорганизмов под действием экзометаболитов ассоциативной микрофлоры, вероятно, могут иметь адаптивное значение для изучаемых микроорганизмов, как одна из приспособительных реакций - лабильность ритма физиологических функций (Комаров Ф.И., 1989; Романов Ю.А., 2002; Смирнов В.М., 2002). В итоге проведенной работы следует выделить три основных момента:
ВЫВОДЫ:
^ Монографии:
Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК:
Публикации в других изданиях:
Патенты
Пособия для врачей:
Список сокращений: АТСС – American Type Culture Collection (американская коллекция типовых культур) КОЕ – колониеобразующая единица БПО – биопленкообразование АЛА – антилизоцимная активность АКА – антикомплементарная активность РС – ростовые свойства(рост/размножение) СН – супернатант микроорганизмов АЦА – антицитокиновая активность АЛфА – антилактоферриновая активность АКрА – антикарнозиновая активность АИА – «антиинтерфероновая» активность ГА – гемолитическая активность ДА – ДНК-азная активность ЛипА – липолитическая активность ЛизА – лизоцимная активность ПК – плазмокоагулаза АБР – полиантибиотикорезистентность АОБ – алкилоксибензолы УПМ – условно-патогенные микроорганизмы r – коэффициент ранговой корреляции Спирмена ч.к. – чистая культура микроорганизмов УПМ – условно-патогенные микроорганизмы ПЕРУНОВА НАТАЛЬЯ БОРИСОВНА БИОРЕГУЛЯЦИЯ МИКРОСИМБИОНТОВ В МИКРОСИМБИОЦЕНОЗЕ КИШЕЧНИКА ЧЕЛОВЕКА Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Оригинал макет подготовлен в программе Word for Windows 2003 Подписано в печать 12. 09. 2011 г. Формат 60*84/16. Усл.-печ. л. 2,0. Печать оперативная. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Тираж 100 экз.  |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям