Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук
|
|
Скачать 0.86 Mb.
|
|
Рисунок 1 - Схема опытов по замораживанию спермы Первое производственное испытание замораживания спермы и изучение её оплодотворяющей способности по методу КазНИТИ овцеводства (а.с. № 698617) на казахских курдючных матках нами проведено в овцесовхозе «Бесобинский» Каркаралинского района Карагандинской области. Осеменение овец осуществлялось спермой баранов-производителей эдильбаевской породы Карагандинского облплемпредприятия. Проверку оплодотворяющей способности замороженного семени проводили в ноябре – декабре 1981 года. Овцематок в охоте выбирали при помощи баранов-пробников. Осеменяли овец двукратно – утром и вечером с интервалом 8-10 часов, маток с продолжительной охотой – третий раз утром следующего дня. Осеменение проводили обычными инструментами, светопроводным влагалищным расширителем конструкции В.К.Милованова и Ю.Н.Трофимова, а также депонирующим шприцом катетером собственной конструкции, для введения спермы в канал шейки матки. Учет результатов ягнения овец был проведен в апреле – мае месяце 1982 года. Результаты ягнения овец приведены в таблице 2. Таблица 2 - Результаты ягнения овец, осемененных по методу КазНИТИО 1979 года
Всего из 245 овцематок, осемененных глубокозамороженным семенем, объягнилось 127, или 51,8%, с колебаниями по группам от 49,5 до 59,0%. Наилучшая оплодотворяемость была у баранов-производителей серой масти – 59,0 % и наименьшая у черной и бурой масти, что, возможно, объясняется более низким качеством спермы в период замораживания. Контролем служили 89 маток, осемененных свежевзятым семенем. Оплодотворяемость их после первичного осеменения составила 74,1%. Все овцы пришедшие повторно в охоту, были осеменены свежевзятым семенем и в основном объягнились в срок. В первом опыте, при использовании спермы эдильбаевских баранов, замороженной по технологии Казахского НИТИ овцеводства (а.с. № 698617, 1979 г.) оплодотворяемость овец от осеменения в первый половой цикл составила в среднем 51,8%. Во втором опыте для дальнейшего испытания этой методики в мясосальном овцеводстве было отобрано 9 основных баранов-производителей опытного хозяйства им. Мынбаева, в том числе 4 дегересской и 5 каргалинского типа казахской курдючной полугрубошерстной породы 3-4 – летнего возраста, живой массой 85-110 кг, настригом шерсти 3,5-5,0 кг. Кроме того, в опыте использовались 3 таджикских барана 1,5 – летнего возраста, живой массой 80-95 кг, настригом шерсти 2,6-3,9 кг, завезенных для улучшения шерстных качеств казахских курдючных овец. Всех баранов-производителей разделили на 3 группы, в соответствии с породой. Качество спермы баранов всех пород после оттаивания было сходным и приемлемым для осеменения овец. Подвижность составила у каргалинских баранов 4,34 балла, таджикских – 4,27 и дегересских – 4,25 балла, разница между показателями даже при сравнении 1 и 2 группы недостоверна (td= 1,06). Производственные испытания замороженного семени проводились в овцесовхозе «Балыктыкольский» Нуринского района Карагандинской области на матках каргалинского типа казахской курдючной полугрубошерстной породы. Овец в охоте выбирали раз в сутки рано утром, с помощью баранов-пробников с подвязанными фартуками. Осеменение проводили двукратно – утром и вечером с интервалом 7-8 часов. Контролем служили овцы, осемененные свежевзятым семенем. В контроле было осеменено 322 овцематки. Всего в опыте замороженным семенем было осеменено 298 овцематок, оплодотворяемость по ягнению составила 57,4% с колебаниями по группам от 48,4 до 63,3%. В контроле оплодотворяемость по ягнению составила 77,4% после первичного осеменения. Учитывая высокую коррелятивную связь между результатами осеменения и биологической полноценностью спермиев, нами изучена сохранность их акросом. Акросома – носитель ферментов и антигенов, участие которых очень важно в процессе оплодотворения. Акроскопический метод, предложенный сотрудниками ВИЖа В.К.Миловановым, И.И. Соколовской, основан на использовании эффекта отраженного света, проходящего через темнопольный конденсор микроскопа. В 1987 году проведено 37 анализов и учтено состояние 5814 спермиев. Установлено, что в свежевзятом, разбавленном и эквилибрированном семени количество спермиев с поврежденной акросомой составляет 6,2-7,8%. В замороженной и оттаянной сперме количество сперматозоидов с поврежденной акросомой увеличивается до 16,9-28,3% или в 2,7-4,5 раза. В замороженном семени, сохраненном в течение 4-5 лет, количество спермиев с поврежденной акросомой увеличивается до 38,9-39,1%.. Это выше, чем у свежезамороженного семени на 10,8-22,0%. Видимо, эти нарушения продолжаются в процессе хранения в замороженном состаянии и связаны с технологическими процессами хранения – карантин, смена жидкого азота, инвентаризация. Тем не менее необходимо отметить, что синтетическая среда КазНИТИО (а.с. № 698617, 1979 г.), обеспечивает сохранение акросомы у 71,7-83,0% спермиев при замораживании и у 60,9-61,1% при длительном хранении. Таким образом, замораживание спермы баранов-производителей по методу КазНИТИО (а.с. № 698617, 1979 г.), позволило получить 51,8% ягнения овец в первом и 57,4% во втором и 56,5% в третьем, в среднем 56,6%. Что послужило основанием совершенствования метода криоконсервации спермы баранов, более приемлемого для производственных условий, с целью повышения её оплодотворяющей способности. ^ Среда для замораживания спермы барана, разработанная КазНИТИ овцеводства (К.Т.Касымов и др.), включает в свой состав в качестве изотонического раствора натриевую соль ЭДТА, калий фосфорнокислый однозамещенный, сахарозу и криопротекторы. В наших исследованиях ставилась задача заменить ЭДТА и калий фосфорнокислый комплексонатами кальция и магния. Для проведения опыта были отобраны бараны – производители таджикской породы в возрасте 2,5 лет, живой массой 95-117 кг, настригом шерсти 3,1-3,9 кг, дегересской и каргалинского типа казахской курдючной полугрубошерстной пород 3-4 лет, живой массой 85-110 кг, настригом шерсти 3-4 кг. Сперму получали три раза в неделю и разбавляли следующими средами: первую группу (контроль) – КазНИТИО (1979 г.), вторую – с комплексонатом кальция, третью – с комплексонатом магния и четвертую – с комплексонатами кальция и магния. Оптимальным количеством комплексонатов по выживаемости размороженной спермы при температуре 38˚С, для состава предлагаемой среды определено – 200 мг. Поэтому в состав среды, используемой для замораживания спермы баранов-производителей, включалось или 200 мг комплексоната кальция, или 200 мг комплексоната магния, или по 100 мг комплексоната кальция и магния в соотношении 1:1. Для изучения оплодотворяющей способности замороженного семени баранов мясосальных пород был проведен производственный опыт в овцесовхозе «Бесобинский» Каркаралинского района Карагандинской области на местных казахских курдючных матках. Всего в опыте замороженным семенем было осеменено 142 овцематки, оплодотворяемость их по ягнению составила 65,5%, в том числе осемененных спермой каргалинских баранов 64,8%, таджикских – 67,0% и дегересских 60,8%. Контролем служили 92 овцематки, осемененные свежевзятой спермой местных баранов. Оплодотворяемость их составила 92,4%. Результаты ягнения овец, осемененных заморожено оттаянной спермой, с применением различных комплексонатов приведены в таблице 3. Таблица 3 - Результаты ягнения овец, осемененных замороженным семенем с комплексонатами кальция и магния
Лучшая оплодотворяемость овец, осемененных оттаянным семенем, была получена при использовании в составе среды для замораживания спермы баранов-производителей, в данном опыте, комплексоната магния – 72,7%. Несколько ниже этот показатель был получен при осеменении овец спермой замороженной в среде, где использовались комплексонаты кальция и магния в соотношении 1:1 и составила 69,4%. При использовании для замораживания спермы баранов-производителей среды с комплексонатом кальция было получено 64,3% ягнения овец. Тогда как при наличии среде натриевой соли ЭДТА, включаемой в состав синтетической среды КазНИТИО (а.с. № 698617, 1979 г.), было получено только 56,5% ягнения овец, что в пределах полученных в предыдущих опытах результатов. Таким образом, полученные результаты использования комплексонатов кальция и магния в синтетических средах по замораживанию спермы баранов -производителей, в место натриевой соли ЭДТА, указывают на целесообразность их дальнейшего применения. Для проведения второго опыта по испытанию состава среды с комплексонатами щелочноземельных металлов сперму замораживали от полуторалетних баранов эдильбаевской, дегересской пород и каргалинского типа казахской курдючной полугрубошерстной породы. Живая масса их составила 87 – 118 кг, настриг шерсти 3,2 – 5,7 кг. Подвижность оттаянной спермы после замораживания составила у каргалинских баранов – 49,9%, дегересских – 49,2% и эдильбаевских – 46,5%. Процент патологических форм, соответственно 7,13; 6,53; 6,72%. В данном опыте для замораживания спермы баранов-производителей использовали два состава синтетической среды – первая с 200 мг на 100 мл среды комплексоната кальция и вторая с таким же количеством комплексоната магния. Для определения оплодотворяющей способности заморожено оттаянной спермы был проведен научно-производственный опыт в опытном хозяйстве им. Мынбаева Казахского НИТИ овцеводства. На пункте искусственного осеменения работы проводились в 2 отарах курдючных овец. Всего заморожено оттаянной спермой была осеменена 141 овцематка. Из этого числа объягнилось 83 овцы, что составило 58,2%, в том числе при использовании спермы дегересских баранов 63,7%, каргалинских 54,3% и эдильбаевских – 59,7%. В контроле оплодотворяемость маток в первый половой цикл по ягнению составила 83,9%. Семенем, замороженным с комплексонатом магния, было осеменено 102 овцематки. Оплодотворяемость овец по ягнению в данной группе составила 56,9%. При использовании в составе синтетической среды комплексоната магния, оплодотворяемость овец по ягнению составила при использовании спермы дегересских баранов-производителей – 62,5%, каргалинских – 51,2% и эдильбаевских – 60,4%. Из 39 овец, осемененных заморожено оттаянной спермой, разбавленной синтетической средой с включением комплексоната кальция, объягнилось 25 голов. Оплодотворяемость овец, в данной группе, по ягнению составила 64,2%. Разница по оплодотворяющей способности заморожено оттаянной спермы баранов-производителей по результатам ягнения составила 7,3% в пользу использования комплексоната кальция. Таким образом, использование комплексонатов кальция и магния, вместо ранее применяемых в среде КазНИТИО (а.с.№ 698617, К.Т.Касымов и др.1979 г.) натриевой соли ЭДТА и калия фосфорнокислого, позволило повысить процент ягнения овец при осеменении заморожено оттаянной спермой. В первом опыте при использовании синтетической среды с комплексонатами процент ягнения овец составил 64,3 – 72,7% (в среднем 68,5%) и во втором опыте соответственно 56,9 – 64,2% (в среднем 60,6%), а по двум опытам 64,6%. повышение подвижности спермы в процессе оттаивания (де консервации) В дальнейших экспериментах с синтетической средой, включающих комплексонаты кальция и магния, проведена серия опытов по повышению подвижности спермы в процессе оттаивания (де консервации). При этом за основное условие принималось то, что чем выше процент подвижных сперматозоидов после оттаивания, тем выше должен быть процент оплодотворяемости данной спермы. В связи с этим для оттаивания замороженных гранул нами составлен раствор, состоящий из 9-11 г сахарозы, 0,15-,025 г комплексоната магния, 95-105 мл дистиллированной воды, 95-105 мл однопроцентной динатриевой соли АТФ. При этом предполагалось, что во время оттаивания спермы, применение только АТФ не может дать положительного эффекта, так как она является лишь энергетическим источником и выводит жгутики из состояния окоченения. Добавление АТФ вызывает размыкание поперечных мостиков. Дальнейшее цикличное размыкание и замыкание поперечных мостиков возможно только в присутствии ионов магния, что обеспечивает сперматозоиду с полностью сохраненной ультраструктурой возможного прохождения полового тракта овцы и оплодотворения яйца. В экспериментах в 1 мл испытуемого раствора для оттаивания размораживали 4-6 гранул. Подвижность оттаянной спермы составила 7-8 баллов, то есть соответствовала подвижности свежевзятой спермы, при удовлетворительной выживаемости во время инкубации при температуре 38ºС. В пятом опыте по испытанию оплодотворяемости заморожено оттаянной спермы, в соответствии с решением Госагропрома СССР от 17 июля 1987 года № 400-23/1500, в племенном заводе «Сараево» Петровского района Ставропольского края была проведена комиссионная проверка. При этом было заготовлено 577 доз спермы, с подвижностью после оттаивания 4-6 баллов, при равноценном распределении спермы, членами комиссии между участниками проверки – ВИЖ, ВНИИплем, ВНИИОиК, КирНИЖ, КазНИТИО. Осеменение овец проводилось с 12 по 23 сентября. Всего было осеменено 368 овец, в том числе заморожено оттаянной спермой 200 и разбавленной 168. Осеменение проводилось в отарах старших чабанов Лагутина И.И. и Зиверова И.П. Перегул овец и результаты ягнения были учтены комиссией. Оплодотворяемость овец по перегулу составила, при использовании заморожено оттаянной спермы 45,5%, а разбавленного семени 75,9%. Суягность маток по ягнению, соответственно, 30,7% и 52,2%. В расчете на 100 маток получено 135,5 и 150 ягнят. Государственный агропромышленный комитет СССР, рассмотрев итоги проверки от 29 июня 1988 года, рекомендовал методику, разработанную нашим институтом, совместно с методикой Всесоюзного института животноводства, применять для повышения эффективности использования высокоценных баранов-производителей. Институтам – разработчикам предложено продолжить работу по совершенствованию способа замораживания и оттаивания при круглогодовом использовании баранов-производителей. Среда для оттаивания замороженной спермы, содержащая макроэргические соединения АТФ повышает подвижность спермиев. Однако, в выше описанном опыте, при государственной проверке, из 200 овец, осемененных заморожено оттаянной спермой, перегуляло 109 голов или 54,5% (таблица 4). Таблица 4 - Результаты ягнения овец, осемененных замороженной спермой оттаянной в среде с динатриевой солью АТФ
Поэтому работы по испытанию среды для оттаивания спермы были продолжены. Подвижность спермы, оттаянной в изучаемой среде, была выше на 14%. Абсолютный показатель выживаемости выше на 66,6%. Эти данные позволили заложить опыт по изучению оплодотворяемости и плодовитости овец, осемененных замороженной спермой с использованием среды для оттаивания. Во втором опыте в 1988 году, в зоне обслуживания Талды-Курганского племенного предприятия, в совхозе «Саратовский» Андреевского района, провели осеменение овец в 4 отарах. Всего было осеменено 950 маток, в том числе в первой группе 160, во второй – 169, в третьей – 272, четвертой – 349. После первичного осеменения объягнилось 73, 79, 95, 103 овцы. Суягность овец составила соответственно 45,3; 46,7; 34,9; 29,6 %. Это ниже принятой технологии на 10,5; 10,2; 17,0; 21,7%. Следовательно, использование новой среды для оттаивания спермы, повышает подвижность и выживаемость заморожено оттаянной спермы, но снижает суягность овец на 10,2 – 21,7%. влияния простагландинов на ускоренный перенос спермиев к месту оплодотворения В литературе приводятся данные влияния простагландинов на сокращение продольных мышечных волокон матки и в связи с этим ускоренный перенос большого количества спермиев к месту оплодотворения. Приведены данные осеменения овец глубокозамороженной спермой. Без применения простагландинов объягнилось 22% овец, а с добавлением 46%. Простагландины разрушались при охлаждении спермы даже до 0 – 4 градусов, поэтому их вводили в оттаянную сперму. При добавлении эстрофана в разбавленную сперму баранов романовской породы оплодотворяемость от первого осеменения повысилась с 80% до 86 – 96%, а плодовитость возросла с 2,6 до 2,9-3,0 ягненка в расчете на объягнившуюся матку или увеличилась на 9 –12%. В наших экспериментах добавление 0,05 мл эстрофана в свежеразбавленную сперму повысила выживаемость на 3 – 5%. В 1991 году, с добавлением эстрофана в дозе 0,05 мл на 1 мл размороженной спермы было осеменено 633 овцематки (таблица 5). Таблица 5 - Результаты ягнения овец, осемененных заморожено-оттаянной спермой
В опыте осеменено спермой баранов австралийский корридель, сохраненной в течение 9 лет - 336 овец, породы линкольн, со сроком хранения 8 лет – 240, казахской тонкорунной породы (опытная среда) – 57 овцематок. В группе овец, осемененной спермой баранов австралийский полварс без использования эстрофана насчитывалось 215 овцематок. Срок хранения спермы в данной группе составил 7 лет. В первой группе из осемененных 336 овцематок объягнилось 130, получено 173 ягненка или в расчете на 100 овец по 133,1 ягненку, оплодотворяемость по ягнению составила 40,2%. Во второй группе при использовании спермы баранов линкольн, учтено 234 матки, из них объягнилось 71 или 30,3%, получено 80 ягнят, в расчете на 100 маток по 112,6 ягненку. В третьей опытной группе из осемененных 57 овец объягнилось 26 и получен 31 ягненок, в расчете на 100 маток по 119,2 ягненка. Из осемененных маток объягнилось 45,6%, что на 5,4 – 15,3% выше результатов ягнения овец при использовании сохраненной 8 – 9 лет спермы, что указывает на повышение результативности осеменения при замораживании спермы опытной средой. В группе без применения простагландина из осемененных 215 овец перегуляло 23,3%. При ягнении было учтено 185 овец из которых объягнилось 59,4%, в расчете на 100 маток получено по 123,6 ягненка. Таким образом, применение эстрофана в дозе 0,05 мл на 1 мл заморожено оттаянной спермы снижает результативность осеменения на 19,3 – 29,2%. В результате опыта установлена возможность использования замороженной и сохраненной в течение 7 – 9 лет спермы баранов-производителей. ^ В стремлении усовершенствовать метод замораживания спермы баранов-производителей ученые использовали в составе синтетических сред, наряду с желтком и глицерином – натрия цитрат, глюкозу, арабинозу, мочевину, сахарозу, лактозу, маннит, пчелиный мёд, кукурузную патоку, молоко. А так же гликокол, натрия глютомат, этиленгликоль, диэтиленгликоль, натрия или аммония сульфат, натрия тиосульфат, инозит, кальциево-натриевые комплексонаты, желатин, альбумин и большой ряд других веществ. Однако эти исследования не принесли желаемых результатов так же, как и использование гипертонических сред. В литературе имеются многочисленные данные о важности ионов кальция и магния, в сочетании с пировиноградной кислотой, в регуляции метаболизма спермиев, акросомной реакции о оплодотворении В наших опытах испытание пирувата натрия в составе синтетической среды улучшило показатели подвижности и выживаемость заморожено оттаянной спермы. Реакцией спермы на охлаждение является температурный шок, осмотические явления на мембране, которые сопровождаются рядом морфологических, физиологических и биохимических изменений в спермиях, приводящих к их гибели. Для уменьшения вредного действия холодового удара исследователи предложили вводить в разбавители различные химические вещества. Аммоний сульфат защищает спермии от холодового удара, но не обладает защитным действием при замораживании от 0 до минус 196 градусов. Вместе с тем не электролиты (сахара) предохраняют спермии от гибели при глубоком охлаждении в зоне отрицательных температур. Для повышения устойчивости спермиев при эквилибрации – самом длительном технологическом процессе криоконсервации спермы, в состав синтетической среды введен сульфат аммония. В опытах 1991 года у 6 баранов-производителей казахской тонкорунной породы было исследовано 125 эякулятов. Подвижность заморожено оттаянной спермы в комплексонатной среде (контроль) 4,030,18 балла, а в разрабатываемой опытной среде 5,590,17 балла, выживаемость при 9 часах наблюдения при температуре 38 градусов Цельсия, соответственно 85888 и 1045122 условные единицы. Для предотвращения вредного действия кислорода и развития перекисного окисления липидов ненасыщенных жирных кислот при замораживании спермы в среды вводят антиоксиданты. К веществам, обладающим антиоксидантными свойствами, обычно относят витамины, гормоны, коферменты, нуклеиновые кислоты, аминокислоты, пептиды, полиамины, углеводы, липиды, отдельные синтетические и природные лекарственные препараты, тиоловые соединения. Хорошим стабилизатором функциональных показателей спермиев при криоконсервации оказался введенный в состав синтетической среды – тиосульфат натрия . В наших экспериментах, применение тиосульфата натрия совместно с альфа-токоферол-ацетатом, улучшило показатели подвижности и выживаемости заморожено оттаянной спермы. Энергия движения спермиев обеспечивается гидролитическим расщеплением АТФ на АДФ и фосфорную кислоту. Использование в составе синтетической среды глицерофосфата кальция восстанавливает фосфорно-кальциевый обмен, который активизирует минеральный обмен, нормализует процессы возбуждения в жгутиках. Фосфор является пластическим материалом и активизирует ферменты. В 1992 – 1993 годах, при проведении опыта по замораживанию спермы баранов-производителей, было получено и исследовано качество спермы 173 эякулятов. В сравнительном испытании подвижность заморожено оттаянной спермы в опытной среде была выше на 46,2%, а выживаемость на 63,1%. В первых опытах по замораживанию спермы баранов-производителей, в середине 70 годов прошлого столетия, без применения антиоксидантов, оплодотворяемость заморожено оттаянной спермы составляла 15-22%, а применение антиоксидантов резко повысило оплодотворяемость до 50 и более процентов. По этому был проведен опыт, по осеменению овец заморожено оттаянной спермой в опытной среде, без включения антиоксиданта – витамина Е, с целью выяснения защитных свойств разрабатываемой синтетической среды. Результаты ягнения овец приведены в таблице 6. Таблица 6 - Результаты ягнения овец
Всего в Аксенгерском опытном хозяйстве было осеменено 587 овцематок. Первую и вторую группу овец осеменяли, заморожено оттаянной спермой, а третью свежевзятой. Оплодотворяемость овец, осемененных заморожено оттаянной спермой, по перегулу составила 52,3 – 77,3%, а по ягнению 50,8 – 63,3%. В расчете на 100 маток получено по 121,2 – 150 ягнят. Суягность овец, осемененных свежевзятым семенем, составила 68,0%, что на 14% больше, чем заморожено оттаянной спермы. Тем не менее, нужно отметить удовлетворительную суягность овец, осемененных без альфа-токоферол-ацетата, которая оказалась на 4,2 – 18,0% выше, чем минус варианты осеменения опытной средой опыта 1991 года, при применении эстрофана. Из 87 овцематок, осемененных заморожено оттаянной спермой, объягнилось 47, получен 61 ягненок, или в расчете на 100 овец по 129,8 ягненка, что указывает на защитные свойства компонентов разработанной синтетической среды. С учетом полученных данных по защитным свойствам компонентов разработанной синтетической среды, было изучено влияние антиоксиданта – витамина-Е на качественные показатели заморожено оттаянной спермы. Для этой цели от четырех баранов было получено 102 эякулята. В эксперименте изучались показатели целостности акросом по их свечению в темном поле микроскопа, процент патологических форм после де консервации и выживаемость спермиев при 38 градусах Цельсия, в течение 8 часов наблюдения. При этом, в размороженной сперме в опытной среде без витамина-Е, процент свечения целых акросом составил 21,68,0, с витамином 55,01,1, то есть повысился более чем в 2 раза. Процент патологических форм составил в среде без витамина-Е 26,08,0, а с витамином 17,01,7 или снизился на 9%.По выживаемости спермиев после оттаивания, при 38 градусах инкубирования, за 8 часов наблюдения не было установлено заметных различий. В обоих случаях выживаемость составила 1710 условных единиц. Здесь необходимо отметить влияние сезона года на качественные показатели спермы. Если осенью объем спермы составил 1,04 мл, то в зимне-весенний период 0,67-0,94 мл, подвижность, соответственно, 8,92 и 7,59-8,14 балла, концентрация 2,62 и 2,86-3,33 млрд/мл, дыхание 2,58 и 2,67-3,50 мин, выживаемость 2666 и 1710 условных единиц. В результате проведенных научных исследований разработан более совершенный состав синтетической среды для замораживания спермы баранов-производителей (патент № 5182). ^ Искусственное осеменение овец резко подняло возможность повышения продуктивности поголовья овец за счет получения многочисленного потомства от производителей с выдающимися наследственными признаками, которые при совмещении с генотипом овцематок расщепляются, замедляя тем самым процесс формирования необходимых хозяйственно полезных признаков. Получение большего числа потомков от лучших по продуктивности овцематок возможно при применении метода трансплантации эмбрионов. Этот метод позволяет извлекать эмбрионы на ранних стадиях развития и тем самым создает условия для более быстрого, в сравнении со сроком суягности, повторного получения зародышей у того же донора, а также за счет увеличения выхода эмбрионов путем вызывания множественной овуляции. В целях вызывания суперовуляции и получения большего количества полноценных эмбрионов нами использованы препараты витаминов - А, Д, Е и микроэлементы с последующей обработкой животных гонадотропинами и простагландином. Для проведения работ по трансплантации эмбрионов нами применялась следующая схема подготовки овец доноров (рисунок 2).
Рисунок 2 - Схема опытов по трансплантации эмбрионов овец Опытным животным инъецировали за 7-10 дней до проявления охоты, в день ее проявления и через 7 дней после ее проявления препараты витаминов - А, Д, Е в дозе, соответственно, 25-30 тыс.ед, 40 тыс.ед и 20 мг на голову. Кроме того, в течение 25-30 суток в корм добавляли соли микроэлементов йода, меди, цинка и кобальта в соответствии с рекомендациями КазНИТИО. В последующем на 12 день полового цикла инъецировали соответствующую дозу гонадотропина и через 48 часов простагландин Ф-два-альфа. В первом опыте была отобрана 21 овцематка донор казахской тонкорунной породы и породы линкольн. Это поголовье было распределено на 3 группы. Первую группу животных (контроль) обрабатывали сывороточным гонадотропином (нативный СЖК) в дозе 1000 ИЕ на 12 день полового цикла. Овцам второй группы с 3 дня после проявления охоты давали 0,45 мкг йодистого калия, на 7 день их обрабатывали тривитамином в дозе – А – 30 тыс. ИЕ, Д – 40 тыс. ИЕ и Е – 20 мкг. На 12 день после проявления охоты животным этой группы вводили подкожно 1000 ИЕ нативного препарата СЖК и на 14 день – внутримышечно 250 мкг простагландина Ф-два-альфа (эстрофан). Животных третьей группы обрабатывали так же, как и второй группы, но фоллигоном, в дозе 1000 ИЕ. В результате обработки у 21 донора получено 148 овуляций, в среднем на одного донора по 7,04 овуляции. Множественная овуляция (более 4) наблюдалась у 13 животных (62%). Использование фоллигона обеспечило множественную овуляцию у 50% животных, при этом отдельные животные дали от 7 до 16 овуляций. На основе проведенного эксперимента можно заключить, что стимуляция полиовуляции у овец обеспечило получение множественной овуляции у 85,7% доноров. При извлечении эмбрионов у овец доноров наблюдалось 127 овуляций. Извлечено 44 эмбриона и ооцита (34,6%). Обнаруженные эмбрионы находились на стадиях морулы и бластоцисты. Из числа обнаруженных 41 эмбриона, 32 были на стадии ранней морулы и 5 на стадии поздней морулы. На стадии бластоцисты было 4 эмбриона. Из 41 эмбриона 5 были неполноценными, в том числе 4 морулы и бластоциста. Процент неполноценных эмбрионов составил 12,2%. Всего было трансплантировано 36 эмбрионов 23 реципиентам. Из них повторно пришло в охоту 18 овец. Пять реципиентов объягнились в срок, продолжительность суягности их составила 149-153 дня. Во втором опыте в качестве доноров использовались овцы казахской тонкорунной породы живой массой 56-73,4 кг и настригом шерсти 4-7 кг. Овец контрольной группы обрабатывали СЖК дозой 1000 ИЕ на 12 день полового цикла. Овцам опытных групп после проявления установочной охоты давали по 0,45 мг йодистого калия. На 7 день полового цикла их обрабатывали тривитамином – А, Д, Е. На животных этих групп испытывались различные гонадотропные гормоны. Овцам второй группы подкожно вводили 1000 ИЕ нативного препарата СЖК, производства Чимкентской лаборатории биостимуляторов. Животным третьей группы на 12 день после проявления установочной охоты инъецировали 1000 ИЕ фоллигона, производства Голландии. Овцам четвертой группы, вводили 1000 ИЕ гравогормона производства Чехословакии. В пятой группе испытывали ФСГ-Р, производства США, в дозе 50 мкг по Армюру. С целью стимуляции овуляции всем подопытным маткам на 14 день полового цикла внутримышечно инъецировали 250 мкг простагландина Ф-два-альфа. Для осеменения использовали двух баранов-производителей казахской тонкорунной породы с живой массой 108 и 136 кг, настригом шерсти 12,1 и 14,1 кг. Лапаротомию доноров проводили через 72-96 часов после их первого осеменения. При этом было обнаружено 82 овуляции, или в расчете на донора 4,31. Наибольшее число овуляций было у животных второй группы. Здесь в расчете на донора получено по 6,62 овуляции. Множественная овуляция (более 4) была у 75% животных. В третьей группе при использовании фоллигона множественная овуляция обнаружена только у 33,3% овец. В четвертой группе, где испытывался гравогормон, множественная овуляция составила также 33,3%. В пятой группе, при обработке ФСГ-Р, множественной овуляции не отмечено, что, возможно, зависело от серии, качества, сроков хранения, схемы использования препарата. Таким образом, для стимуляции полиовуляции, у овец приемлема следующая схема обработки доноров: скармливание животным с 3 дня после проявления охоты микроэлементов (йодистого калия), инъекция гонадотропинов на 12 день полового цикла и простагландина на 14 день. При применении нативного СЖК в дозе 1000 ИЕ в расчете на каждого донора получено по 6,62 овуляции. Из числа полученных эмбрионов 95% были полноценными. Это подтверждает результаты первого опыта, когда при обработке по выше указанной схеме в расчете на каждого донора было получено по 11,4 овуляции. Дальнейшее испытание, приведенной схемы обработки доноров проведено в 3 опыте на 36 животных с применением нативного препарата СЖК. В целом 36 обработанных доноров дали 258 овуляций, или по 7,1 на каждого, с колебаниями по группам от 6,4 до 8,5. Множественную овуляцию проявили 75-100% животных. Следовательно, предлагаемая схема стимуляции полиовуляции овец позволяет получать множественную овуляцию у доноров (таблица 7). Четвертый опыт проведен также на матках казахской тонкорунной породы. Под опытом было 17 маток доноров средней живой массой 60,3 кг и настригом шерсти 5,4 кг. Отдельные животные имели живую массу 68-81 кг, настриг шерсти 6,2-7,0 кг. Животных первой группы обрабатывали по разрабатываемой схеме, с применением нативного препарата СЖК, а овцам второй группы сывороточный гонадотропин вводили в двух инъекциях в течение 48 часов по 500 ИЕ. При этом полагалось, что постепенное введение гонадотропина будет стимулировать число овулируемых фолликулов. Лапаротомию животных проводили с 6 ноября по 10 декабря 1987 года. При этом у животных первой группы обнаружено 117 овуляций, а второй – 8. Таблица 7 - Результаты стимуляции полиовуляции у овец
В расчете на одного донора, соответственно получено 8,36 и 2,66 овуляций. Множественная овуляция у доноров первой группы составила 78,6%. Следовательно, дробное введение нативного препарата СЖК отрицательно влияет на степень проявления множественной овуляции и количества получаемых от донора эмбрионов. При однократной инъекции, у отдельных доноров обнаружено 10-17 желтых тел. Так у донора №3386 овулировало 17 фолликул, у донора №2895 – 16 фолликул и у донора №С3846 – 11 фолликул. Только от этих трех доноров получено 36 полноценных эмбрионов. В целом из 117 овулированных фолликул обнаружено 97 эмбрионов и ооцитов, или 82,9%. В том числе неоплодотворенных ооцитов – 9, неполноценных 3 и полноценных 86 эмбрионов (88,6%). Дополнительная подкормка маток доноров за месяц до начала и в период проведения опытов, использование разрабатываемой технологии вызывания полиовуляции, позволило получить от донора 6,14 полноценных эмбриона, а от отдельных животных до 10-14. Пятый опыт проведен на овцах казахской тонкорунной породы опытного хозяйства им. Мынбаева. В качестве доноров использовались 37 маток с живой массой 55-59 кг и настригом шерсти в мытом волокне 2,5-2,9 кг. Для осеменения доноров использовали двух баранов казахской тонкорунной породы. Баран №Р0026 имел живую массу 126 кг и настриг шерсти в мытом волокне 6,77 кг, а баран №05011, соответственно 108 и 6,05 кг. Стимуляцию полиовуляции и извлечение эмбрионов проводили по разработанной в предыдущих опытах схеме. Лапаротомию проводили на 3-10 день в зависимости от цели эксперимента. При этом было обнаружено 344 овуляции, или в расчете на донора по 9,3. У матки №05877 при овуляции 14 фолликул было извлечено 8 эмбрионов, из них полноценными оказались 2. У донора №Г9829 при овуляции 20 фолликул, из 16 извлеченных эмбрионов, полноценными признаны 8. Отсюда вытекает, что у отдельных доноров не все овулированные ооциты способны к оплодотворению, а некоторые оплодотворенные к дальнейшему развитию. В противоположенность этому встречались доноры, у которых все обнаруженные эмбрионы были полноценными. Шестой опыт проведен с использованием 3 видов гормональных препаратов на фоне подкормки животных в период опыта концентрированными кормами (0,5 кг) и полисолями. Поли соли имели следующий состав (из расчета на 1 голову в судки) – йодистый калий – 1,31 мг, хлористый кобальт – 3,43 мг, сернокислый цинк – 283 мг, сернокислый аммоний – 5,1 г, кормовой фосфат – 5,1 г по рекомендации отдела кормления КазНИТИО. Опыт проводили в 3 группах. В первой группе обработку животных проводили нативным препаратом СЖК (Чимкентского производства) в дозе 1000-1200 ИЕ. Число обработанных доноров составило 61, из которых реагировало овуляцией 88,5. Общее число овулировавших фолликулов составило 600, или в среднем на донора 9,8. Извлечено 245 эмбрионов, в расчете на донора по 4,0. Во второй группе овец обрабатывали ГСЖК (производства Покровской биофабрики Российской федерации) дозой 1000-1200 ИЕ на 12 день полового цикла. Всего была обработана 51 овца донор, получено 344 овуляции, в расчете на донора 6,7 овуляций. Извлечено 227 эмбрионов, по 4,5 на обработанного донора. Третью группу обрабатывали фоллитропином по двухдневной схеме дозой 384 ЕД на 12 день полового цикла. От 14 доноров получено 161 овуляция, в среднем на донора 10,7, извлечено 110 эмбрионов, в среднем на донора по 7,3. В опыте установлено влияние вида гормонального препарата на выход полноценных эмбрионов у овец. При обработке животных более доступным нативным препаратом СЖК получено лишь 2,2 полноценных эмбриона на донора, а в группах при применении ГСЖК – 4,1 и фоллитропина 4,5. Седьмой опыт по индуцированию множественной овуляции проведен на казахских тонкорунных матках опытного хозяйства им. Мынбаева. Животных первой группы обрабатывали сывороточным гонадотропином (ГСЖК Покровской биофабрики), в дозе 1000 ИЕ, при этом в расчете на 1 кг живой массы доза составляет 17,2-18,8 ИЕ. У 11 обработанных доноров обнаружено 69 овуляций, что в расчете на одного донора составляет 6,27. Было извлечено 39 эмбрионов и ооцитов или 56,5%. В расчете на донора извлечено 3,54 эмбриона. Все извлеченные эмбрионы были полноценными. Вторую группу обрабатывали уменьшенной дозой гонадотропина (600 ИЕ) с целью вызывания умеренной овуляции и получения одновозрастных зигот. В этой группе обнаружено 20 овуляций, или в расчете на донора по 2,5. Извлечено 13 эмбрионов и ооцитов, или 65 % от числа овуляций, что в расчете на донора составляет 1,62 эмбриона и ооцита. Из этого числа 11 эмбрионов, или 84,6% были полноценными. В расчете на донора получено 1,37 полноценных эмбрионов. Третью группу доноров гормональными препаратами не обрабатывали. Животные получали полисоли и витамины в тех же дозах, как животные первых двух групп. При лапаротомии у 53 доноров обнаружено 88 овуляций. В расчете на донора получено 1,66 овуляций. Извлечено 73 эмбриона и ооцита, или 82,9% от числа овуляций, 71 зигота, или 97,3% были полноценными. Таким образом, овцы казахской тонкорунной породы без обработки гонадотропными препаратами обеспечивают получение 1,33 полноценных эмбрионов на донора. Уменьшение дозы гонадотропина с 1000 ИЕ до 600 ИЕ снижает степень овуляции, и она практически не отличается по показателям получения полноценных эмбрионов у необработанных овец доноров. В восьмом опыте для индуцирования полиовуляции у овец казахской тонкорунной породы впервые был использован препарат «графоллон», производства института разведения и генетики животных (г. Пушкин Ленинградской области, РФ). Графоллон вводили в дозе 300 ЕД, из расчета 5,1-5,6 ЕД на 1 кг живой массы. У 5 обработанных графоллоном доноров обнаружено 63 овуляции, или в расчете на донора 12,6. На вторые-шестые сутки после осеменения извлечен 31 эмбрион и ооцит или 49,2%. Видимо, на результативность извлечения эмбрионов повлияли поздние сроки вымывания, Тем не менее, 80,6% извлеченных эмбрионов оказались полноценными. В расчете на донора получено 5,0 полноценных эмбриона. Установлено, что графоллон в дозе 300 ЕД на овцу донора, обеспечивает высокую полиовуляцию. Девятый опыт проводился в племенном заводе «Брлик» Уральской области на овцах эдильбаевской породы. В качестве доноров использовали ценных в племенном отношении маток в возрасте 4-5 лет, живой массой в среднем 77 кг. В качестве реципиентов использовали маток того же возраста, со средней живой массой 65 кг. Обработку животных проводили в четырех группах. Первую группу обрабатывали графоллоном, по двухдневной схеме, дозой 250 ЕД в четырех внутриматочных инъекциях в убывающем количестве – 90, 70, 50, 40 ЕД. Первую инъекцию проводили утром на 11 день эстрального цикла, вторую – через 12 часов, третью через 24 часа и четвертую через 36 часов. Вместе с третьей инъекцией вводили 250 мкг простагландина. Вторую группу обрабатывали фоллигоном на 11 день полового цикла дозой 1000 ИЕ, в сочетании с простагландином. Третью группу обрабатывали фоллитропином (Каунасского завода эндокринных препаратов), также как и графоллоном по двухдневной схеме в четырех инъекциях уменьшающейся дозой – 144, 120, 72, 48 ЕД. Вместе с третьей инъекцией, для регрессии желтого тела, вводили простагландин. Контрольную группу обрабатывали сывороточным гонадотропином (Покровского завода биопрепаратов) дозой 1600 ИЕ, с последующей инъекцией простагландина. Лапаротомию доноров проводили через 48 часов после осеменения..Вид гормонального препарата оказал влияние на количество и качество вымытых эмбрионов. Наилучшие результаты получены при использовании графоллона и фоллигона. В расчете на донора получено, соответственно 8 и 9 овуляций и 5,3 и 5,0 полноценных эмбрионов. В результате опыта 26 реципиентам было пересажено 60 эмбрионов, с соблюдением синхронности (±12 часов) эстральных циклов донора и реципиента и наличие хорошо выраженного желтого тела. Из общего числа реципиентов объягнилось 15, или 57,6% и получено 20 ягнят, что составило 33,3% от числа пересаженных эмбрионов. В племенном заводе «Брлик» В 1991-1992 годах проведен десятый опыт по индуцированию полиовуляции у маток доноров эдильбаевской породы. Всего в опыте использовано 57 доноров с живой массой 75-102 кг. Доноров первой и второй группы обрабатывали сывороточным гонадотропином (Покровского завода биопрепаратов) в зависимости от живой массы. Доза препарата для доноров первой группы составила 1600 ИЕ, а для второй группы 1800ИЕ. При лапаротомии установлено, что в первой группе у 39 доноров обнаружено 295 овуляций, ил в расчете на донора по 7,56 штук. Множественная овуляция (более 4) обнаружена у 93% доноров. 222 извлеченных эмбриона и ооцита составили 75,3% к числу овулировавших фолликулов. При этом из числа обнаруженных эмбрионов полноценными оказались 210 или 95,9%. В расчете на донора получено 5,43 полноценных эмбриона. У 8 доноров второй группы при лапаротомии обнаружено 72 овуляции, или в расчете на донора по 9 овуляций. Множественная овуляция была у 86% доноров. Всего извлечено 50 эмбрионов, или 69,4%. Из них полноценными были 46, или 92%, что составило в расчете на донора 5,75 эмбриона. Третью и четвертую группу животных обрабатывали графоллоном в дозе 250-300 ЕД. При этом в расчете на 1 кг живой массы доза составила 3,1-3,7 ЕД. В третьей группе у 7 доноров обнаружено 64 овуляции, или в расчете на донора 9,14. Из числа овулировавших фолликулов извлечено 46 эмбрионов и ооцитов или 71,8%. При этом 43 эмбриона оказались полноценными, что составило 93,4% от числа извлеченных. Несколько лучше оказались результаты у доноров четвертой группы, где доза графоллона была увеличена на 20% с учетом живой массы маток. В этой группе у 3 маток обнаружено 32 овуляции, или в расчете на донора по 10,66 овуляций. Из числа овулировавших фолликул извлечено 23 эмбриона и ооцита. Процент извлечения их составляет 71,9%, а в расчете на донора извлечено по 7,66 эмбрионов и ооцитов. Из числа извлеченных эмбрионов этой группы были классифицированы полноценными - 95,6%. В среднем на донора получено по 7,66 полноценных эмбрионов. В целом, при использовании графоллона для индуцирования полиовуляции у эдильбаевских овец установлено, что этот препарат в дозе 250-300 ЕД вызывает множественную овуляцию у всех животных и обеспечивает получение от донора 6,14-7,33 полноценных эмбриона. Если принять показатели получения полноценных эмбрионов на донора в первой группе за 100%, то во второй этот показатель выше на 5,8%, в третьей на 13% и в четвертой на 39,4%. Все 323 полноценных эмбриона пересажены 183 реципиентам, от которых получено 94 ягненка трансплантата, в числе 41 баранчик и 53 ярки. От отдельных доноров за год получено 4-6 ягнят Использование ГСЖК на эдильбаевских матках позволило получить по 5,69-6,25 эмбриона, в том числе по 5,43-5,75 полноценных. Применение графоллона несколько улучшили эти показатели, и они составили соответственно 6,57-7,66 и 6,14-7,33. На основании проведенных работ, установлено значительное влияние гормонального препарата на выход полноценных эмбрионов в расчете на обработанного донора на фоне подкормки животных доноров микроэлементами и инъекцией витаминов. В результате 10 проведенных опытов, стимулирована на овуляцию 347 овца донор и получено 2736 овуляции, или в расчете на донора по 7,9. Вымыто 1569 эмбрионов, или по 4,49 на обработанного донора. В том числе признаны полноценными 1292 эмбриона, или по 3,73 на обработанного донора (таблица 8). При проведении различных микроманипуляций с эмбрионами 459 овцам реципиентам было пересажено 814 эмбрионов. От 175 объягнившихся реципиентов получен 191 ягненок трансплантат. Таблица 8 - Результаты испытания гонадотропинов
Разработанная методика вызывания множественной овуляции у овец, с подкормкой микроэлементами и инъекцией витаминов повысила результаты вымывания полноценных эмбрионов при использовании нативной СЖК в 2,3 раза. При использовании других гонадотропинов, при предварительной подготовке овец доноров, результаты зависели от серии и активности препаратов. Всего в опытах для индуцирования полиовуляции было испытано 7 гонадотропных препаратов, таких как сывороточные, продуцируемые плацентой жеребых кобыл и гипофизарные очищенные гормоны, получаемые из гипофиза сельскохозяйственных животных. Оба вида гонадотропина содержат, как фолликулостимулирующее, так и лютеинизирующее начала. Основные различия сывороточного, производного из сыворотки жеребой кобылы (СЖК, ГСЖК, гравогормон, фоллигон и др.) и гипофизарного, производного из вытяжки из гипофиза сельскохозяйственных животных (ФСГ-Р, фоллитропин, графоллон и др.) препаратов заключается в продолжительности их биологического действия после введения донору. Для сывороточных гонадотропинов длительность полураспада в организме составляет 5-6 суток, а для гипофизарных 5-6 часов. Поэтому сывороточные гонадотропины вводят овцам донорам однократно в дозе 1000-1200 ИЕ, а при живой массе более 70 кг – 1600-1800 ИЕ, из расчета 20-22 ИЕ на 1 кг живой массы. Гипофизарные гонадотропины вводят путем дробных инъекций, с интервалом 12 часов, в течение 2-6 дней, дозой 10-24 мкг, эквивалентного 250-600 ЕД, в зависимости от схемы обработки и живой массы донора. В наших опытах использовалась 4-кратная инъекция гипофизарных гормонов, с интервалом 12 часов, по двухдневной схеме, уменьшающимися дозами. Общая доза вводимого препарата составляла 250-300 ЕД. Наилучшие результаты по стимуляции множественной овуляции и выходу полноценных эмбрионов были получены при использовании гипофизарных очищенных препаратов – фоллитропина и графоллона, однако они зависели от серии и активности гонадотропина. Гипофизарные препараты более дорогостоящие, по этому менее доступны, кроме того, при обработке доноров необходима многократная инъекция препарата. Использование же более доступного сывороточного гонадотропина СЖК позволило получать в среднем 2,82 полноценных эмбриона на донора, а препарата ГСЖК – 4,63 полноценных эмбриона. В связи с длительностью полураспада в организме донора, применение нативного СЖК приводит к получению большего числа неполноценных эмбрионов. В группах с нативной СЖК процент полноценных эмбрионов из числа вымытых составляет – 64,4%, тогда как использование гипофизарных гормонов дало возможность получить 68,4%, а в группах с ГСЖК, фоллигона, гравогормона (очищенных сывороточных гормонов) 98,3% полноценных эмбрионов из числа вымытых. Таким образом, при стимуляции полиовуляции у овец в условиях юго-востока Казахстана, предлагается следующая схема вызывания множественной овуляции – это инъекция овцам донорам витаминных препаратов, подкормка йодистым калием и обработка животных желательно гипофизарными гормональными препаратами, а в случае их отсутствия очищенными сывороточными гормонами. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ересажено эмбрионов
СЖК
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям