Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук
|
|
Скачать 0.86 Mb.
|
|
Микроманипуляции с эмбрионами Экономическая эффективность методов замораживания спермы и трансплантации эмбрионов Предложения производству |
|
^ В опытах по разделению эмбрионов испытывались эффективность использования двух способов. Разделение эмбрионов первым способом проводили двумя остро отточенными металлическими иглами. 10 компактных морул и 16 вылупившихся бластоцист, вымытых на 6-10 день полового цикла, были разделены и пересажены 26 реципиентам. Все реципиенты проявили повторную охоту, что говорит о значительном травмировании эмбриона в данном случае. Более перспективным является предложенный нами способ разрезания эмбрионов микро скальпелем (рационализаторское предложение № 46 от 29.04.1990 г.). Всего было разделено 2 ранних, 33 экспандированных, 34 вылупившихся бластоцисты. 132 разделенные половинки пересажены 57 реципиентам, из которых объягнились две матки, от каждой из них получено по одному ягненку. Наряду с разделением эмбрионов нами проведены опыты, совместно с сотрудниками ВИЖа, по созданию химерных эмбрионов. В экспериментах после гормональной обработки 9 доноров казахских курдючных овец, было вымыто 45 эмбрионов, а у 14 доноров казахской тонкорунной породы – 77 эмбрионов. В результате частичного изъятия собственных бластомеров и инъекции бластомеров другой породы было сконструировано 57 химерных эмбрионов, которые были пересажены 29 реципиентам. Из 29 реципиентов объягнился один, получен один ягненок, который по анализу крови трех из четырех родителей подтвердил химерность. В 1985 году появились на свет первые трансгенные сельскохозяйственные животные – кролики, овцы с геном гормона роста человека. При этом наблюдалось увеличение скорости роста у трансгенных животных по сравнению с контролем. Более эффективными оказались исследования по созданию трансгенных животных, устойчивых к болезням. Успешно завершились исследования по созданию трансгенных животных, продуцирующих лечебные препараты для медицины. В институте физиологии животных и генетических исследований в Эдинбурге (Великобритания) выведены трансгенные мыши и овцы, секретирующие с молоком фактор-9-свертываемости крови и альфа-1-антитрипсин. Во Всероссийском институте сельскохозяйственной биотехнологии получены трансгенные животные по 7 видам различных генов – гены альфа и бетта интерферона, ген гормона роста человека, гены асРНК против аденовируса, вируса бычьей папилломы и вируса лейкоза. Во Всероссийском институте животноводства получены трансгенные свиньи с геном против парва-вируса свиней, с геном гормона роста быка и антигеном НВС. Нашим институтом в 1989 году начата серия исследований по получению трансгенных овец. Всего в 3 опытах использовали 103 донора. При этом обнаружено 895 овуляций, или в расчете на донора по 8,69. Выход полноценных эмбрионов на донора составил 5,51 штук. В том числе в первом опыте 4,48, во втором 4,75 и в третьем 6,03 эмбриона. Эти данные еще раз подтверждают эффективность, предложенной нами схемы индуцирования множественной овуляции извлечения эмбрионов овец. Интродукцию чужеродного гена в геном осуществляли путем микроинъекции в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки. Для этого использовали микропипетки, колющая часть которых диаметром 1,5 мкм, отградуирована для дозированных микроинъекций по 2 мк. Количество генокопий, инъецированных в одну зиготу, варьировало от 500 до 2500. Проникновение жидкости в пронуклеусы контролировали по положению мениска в просвете микроиглы или по увеличению пронуклеуса. Оптимальная доза ДНК – 1 нг/мкл, то есть 300-700 генокопий на пронуклеус. Для микрохирургии зигот овец использовали микроскоп «Оптон» или «Олимпус» и микроманипуляторы КМ-2, оснащенные фиксирующей и микроинъецирующей пипетками. Зиготу помещали в каплю питательной среды, которую покрывали вазелиновым маслом. Визуализацию пронуклеусов проводили при 200-кратном увеличении. Одним из генов, искусственная интродукция которого в геном млекопитающего может привести к изменению фенотипа, является ген гормона роста. В наших экспериментах использовали две конструкции гена – гормона роста КРС и релизинг фактор гормона роста КРС. Наряду с данными генами использовался ген интерферона человека. Всего в опытах микроинъецировали 452 зиготы, в том числе в первом опыте 72, во втором – 61 и в третьем – 319. От трансплантации микроинъецированных зигот получили 46 ягнят, в том числе по опытам соответственно 18, 10 и 18. Некоторые из них отличались высокой энергией роста. Так баранчик №03854 рождения 1991 года, имел живую массу при рождении 4,1 кг, а в возрасте 120 дней – 42,5 кг, то есть среднесуточный прирост его составил 320 г. Во второй серии опытов у 72 доноров извлечена 121 зигота. В этих опытах овец первой группы обрабатывали ГСЖК в дозе 1000 ИЕ. При этом получено 69 овуляций и извлечено 39 полноценных эмбрионов. Овец второй группы обрабатывали также ГСЖК, но в уменьшенной дозе (600 ИЕ) с целью получения умеренной множественной овуляции и получения одновозрастных зигот. В этой группе обнаружено 20 овуляций, или 2,5 на донора, вымыто 11 полноценных эмбрионов. Овец третьей группы, с целью получения полноценных одновозрастных зигот, у которых хорошо визуализировались пронуклеусы, гормональными препаратами не обрабатывали. У 53 доноров этой группы обнаружено 88 овуляций, или в расчете на донора 1,66, извлечена 71 полноценная зигота. Из всех полученных зигот пронуклеусы визуализированы у 81 зиготы, или 66,9%. Этим зиготам в пронуклеус был микроинъецирован ген гормона роста КРС. Зиготы были пересажены 50 овцам реципиентам, в срок объягнилось 16 овец, или 32%. В результате трансплантации 81 микроинъецированной зиготы получено 19 ягнят. Приживляемость зигот составила в среднем 23,4%. Наиболее высокая приживляемость зигот – 29,5%, наблюдалась в третьей группе. В сравнении с ней показатели первой и второй групп были ниже на 1,2 и 12,2%. При получении трансгенных овец, для визуализации пронуклеусов, особое внимание уделяется времени вымывания зигот. Так как при раннем вымывании яйцеводов пронуклеусы еще не образовались, а при позднем происходит слияние мужского и женского пронуклеуса с образованием ядра. По данным наших опытов оптимальное время вымывания зигот составляет 36-40 часов от начала охоты у овцы-донора. Наряду с разделением эмбрионов, созданием химер, получением трансгенных животных метод трансплантации эмбрионов выявил необходимость разработки методов их хранения. Эмбрионы овец хорошо переносят охлаждение до 0 градусов на любых стадиях развития. При этом угнетается или останавливается их развитие. Нормальные обменные процессы у них протекают у них после хранения их не более 5-6 суток. Для длительного хранения эмбрионов необходимо затормозить только их развитие, но снизить или даже остановить обменные процессы, протекающие в них. Такое возможно лишь при снижении температуры до –196 градусов, т.е. при замораживании эмбрионов. Нами в 1984-1985 годах проводились работы по трансплантации замороженных эмбрионов, доставленных из ВИЖа. Всего было получено 25 эмбрионов со сроком хранения 9-11 дней. Из этого числа признаны годными после оттаивания 16 эмбрионов, или 64%. При пересадке заморожено оттаянных эмбрионов, получено 8 ягнят. Замораживание эмбрионов является важным звеном в разработке ускоренного метода размножения ценных животных. При этом исходят из того, что свежеполученные эмбрионы даже при краткосрочном хранении снижают жизнеспособность. В 1986-1987 годах нами освоена методика морфологической оценки качества эмбрионов и проведена работа по их замораживанию в жидком азоте. Всего от 19 маток заморожен 71 эмбрион. Всего было заморожено 307 эмбрионов, полученных от 25 доноров. Оттаивание замороженных эмбрионов и их трансплантацию реципиентам проводили в Талдыкорганском племенном предприятии. Всего было разморожено 94 эмбриона, из них пригодными для трансплантации признаны 51, или 54,3%. Они были пересажены 18 реципиентам, от которых получено 7 ягнят. Импорт замороженных эмбрионов является новым методом завоза ценных животных. В 1993 году из Австралии был импортирован 451 замороженный эмбрион (пятидневного возраста) на стадии поздней морулы и ранней бластоцисты. Из них в декабре было оттаяно 68 эмбрионов. После морфологической оценки 61 эмбрион (89,7%) был признан годным к пересадке. Размороженные полноценные эмбрионы были пересажены 33 яркам казахской тонкорунной породы в возрасте 20 месяцев (таблица 9). Таблица 9 - Результаты трансплантации замороженных эмбрионов
Из числа реципиентов, одна овца абортировала два плода в трех месячном возрасте, 20 овец объягнилось в срок и получен 31 ягненок, в том числе 2 мертворожденных. Общее количество живых ягнят составило 29, из них 13 баранчиков и 16 ярок. В 1994 году было пересажено 260 размороженных эмбрионов со сроком хранения один год. При этом использовано 149 маток в качестве реципиентов. Матки были выранжированные, ниже средней упитанности. Тем не менее, суягность реципиентов составила 47%, а приживляемость эмбрионов 30,4%. В 1995 году было разморожено 77 эмбрионов со сроком хранения 2 года. Из них полноценными оказались 61, или 79,2%. При этом отмечено снижение полноценности эмбрионов по срокам хранения. За первый год снижение составило 3,3%, а во втором году 10,5% (таблица 10). Из 64 неполноценных эмбрионов у 29,4% обнаружен скол зоны пеллюцида, у 47,1% - пустая оболочка и 23,5% нарушена целостность бластомеров. Были отмечены и другие виды нарушения целостности эмбрионов. Таблица 10- Полноценность замороженных эмбрионов по срокам хранения
Полноценные эмбрионы, со сроком хранения 2 года, были пересажены 33 реципиентам. Из числа реципиентов суягными оказались 23 овцематки, или 69,7%. Таким образом, метод трансплантации замороженных и сохраненных эмбрионов является приемлемым методом при воспроизводстве генетически высокопродуктивных пород овец. ^ Экономическая эффективность методов замораживания спермы и трансплантации эмбрионов установлена в возможности получения дополнительного количества спермы и ягнят желательного типа. При разработке методов замораживания спермы учитывалось, что в среднем по республике, свежеполученной спермой одного барана производителя за случной сезон осеменяют 336 овцематок, с колебаниями по областям от 174 до 426 голов (таблица 11). Таблица 11 - Экономическая эффективность замораживания спермы баранов
Использование замороженной спермы, а также сохраненной при температуре 0-4ºС, позволило повысить нагрузку на барана-производителя. Для сравнения взято осеменение овец свежевзятой, сохраненной и заморожено оттаянной ( метод Каз НИТИО, а. с. №698617, Касымов К.Т. и др.). При осеменении овец свежевзятой и разбавленной спермой баранов- производителей используют только в течение случной компании, то есть 45 дней. Замораживание спермы позволяет дополнительно использовать баранов в течение 6 месяцев. Расчет экономической эффективности при замораживании спермы взят за 6 месяцев дополнительно к использованию свежевзятой и разбавленной спермы, когда можно получить 2670 доз на сумму 534 тыс. тенге (цены на начало 2009 года). Затраты на заготовку и транспортировку спермы составляют 398 тыс. тенге, что позволяет дополнительно осеменить, спермой высокопродуктивного барана, 1068 овцематок и получить от 634 до 798 ягнят на сумму 3170 и 3990 тыс. тенге. Экономическая эффективность при замораживании спермы барана-производителя составляет 3306-4126 тыс. тенге. Применение нового метода замораживания спермы позволило повысить экономическую эффективность использования барана производителя в год на 19,6% в сравнении с ранее применяемым методом. Эффективность работ по трансплантации эмбрионов характеризуется получением большего количества полноценных эмбрионов в сравнении с применяемым метод стимуляции множественной овуляции нативным препаратом СЖК, позволяющим получать 2,82 полноценных эмбриона на донора. В наших экспериментах в расчете на донора получено 3,73 полноценных эмбриона. При использовании очищенных гормональных препаратов ГСЖК, фоллитропина, графоллона получено соответственно 4,63; 4,71; 5,61 полноценный эмбрион на донора, что повышает эффективность использования овцы донора в среднем в 1,3 раза, а по препаратам ГСЖК, фоллитропин и графоллон в 1,6; 1,7; 2,0 раза, или при равных затратах на сумму стоимости ягнят в среднем - 18330 тенге, а по препаратам соответственно – 22560, 23970, 28200 тенге. Кроме того, при этом необходимо учитывать продуктивные и генетические качества полученных ягнят. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Проведенные исследования и полученные результаты позволяют сформулировать следующие научные и практические положения и выводы: 1. Разработка методов искусственного осеменения сельскохозяйственных животных и широкое их применение обеспечили большой успех в генетическом улучшении овцеводства Казахстана. Использование этих методов и, особенно, технологии длительного хранения спермы в замороженном состоянии дают возможность получения десятков тысяч потомков от одного производителя в год. Этот прием, по существу решает, проблему рационального использования производителей. А у овцематок традиционные методы разведения позволяют получать лишь несколько потомков за весь период их использования. Эта проблема решается за счет внедрения новых, более перспективных методов размножения животных, в частности трансплантацией эмбрионов. 2. В работе доказана возможность повышения эффективности основного зоотехнического метода, искусственного осеменения в Казахстане, посредством использования сохраненной и замороженно оттаянной спермы генетически ценных баранов-производителей. Изучена биологическая полноценность яйцеклеток овец, закономерности их развития. Исследованы этапы раннего развития эмбрионов при пересадке их реципиентам. При краткосрочном хранении и замораживании спермы испытан ряд составляющих компонентов в составе синтетических сред и технологические приемы. Получены приемлемые результаты суягности овец, осемененных, сохраненной и заморожено оттаянной спермой баранов-производителей. Испытан метод кратковременного хранения спермы в варьирующих температурах и её оплодотворяющая способность. Изучены и предложены приемы индуцирования множественной овуляции у доноров. При трансплантации целых, разделенных, химерных, микроинъецированных и заморожено оттаянных эмбрионов определена их приживляемость. 3. Установлено, что включение в состав синтетических сред для замораживания спермы баранов-призводителей комплексонатов щелочноземельных металлов и ряда компонентов, повысила эффективность искусственного осеменения, и позволило получить 64,3-78,8% ягнения овец. 4. Искусственное повышение процента подвижных спермиев после оттаивания, в среде с макроэргическими соединениями АТФ, снижает результативность осеменения овец заморожено оттаянной спермой на 10,5-21,7%. 5. Использование простагландина (эстрофана), при осеменении овец заморожено оттаянной спермой, с целью ускоренной доставки сперматозоидов к месту оплодотворения, вследствие влияния эстрофана на сокращение мышечных волокон матки, снизило процент ягнения овец на 19,3-29,2%. 6. На основании проведенных работ разработана новая синтетическая среда (патент №5182) для замораживания спермы баранов-производителей, повышающая подвижность заморожено оттаянной спермы на 46,2%, выживаемость спермиев при 38ºС, при 8 часах наблюдения на 63,1% и процент ягнения овец на 15,3% в сравнении со средой Казахского НИТИ овцеводства 1979 года. 7. Доказана возможность применения замороженной и сохраненной в течение 7-9 лет спермы баранов-производителей. Суягность овец, осемененных этой спермой, составила 30,3-59,4%, плодовитость овец 112-133 ягненка на сто маток. 8. В работах по трансплантации эмбрионов овец установлено влияние различных гормональных препаратов на фоне минеральной подкормки овец и инъекции им витаминных препаратов на стимуляцию множественной овуляции в условиях юго-востока Казахстана. Испытание нативного препарата СЖК позволило получить 2,82, а применение очищенных препаратов ГСЖК, фоллитропина, графоллона – 4,63; 4,71; 5,61 полноценных эмбриона на донора. Число полноценных эмбрионов при использовании нативного СЖК составило – 64,4%, а ГСЖК, фоллигона и гравогормона – 98,3%. 9. Доказано, что приемлемым методом воспроизводства генетически ценных животных является замораживание эмбрионов и дальнейшая трансплантация их овцам реципиентам. 10. Экономическая эффективность при замораживании спермы барана- производителя составляет 3306-4126 тыс. тенге или на 19,6% больше в сравнении с ранее применяемым методом. Эффективность работ по трансплантации эмбрионов характеризуется получением большего количества полноценных эмбрионов, при этом необходимо учитывать продуктивные и генетические качества полученных ягнят. ^ Для размножения овец с целью ускорения генетического прогресса, повышению эффективности племенной работы, роста продуктивных качеств овец, на ряду с традиционными методами осеменения свежевзятой и охлажденной спермой, рекомендуем осеменять овец спермой разбавленной фосфатно-сульфатно-комплексонатной средой для варьирующих температур (патент № 9056 от 2000 года), обеспечивающую выживаемость спермиев до 8 суток при температуре 7-27º С, оплодотворяемость овец по ягнению 61,1-75%. Для замораживания спермы высокопродуктивных баранов-производителей, с целью сохранения биологической полноценности и повышения оплодотворяющей способности заморожено оттаянной спермы, рекомендуется комплексонатная среда (патент № 5182). Для повышения эффективности трансплантации эмбрионов стимуляцию множественной овуляции желательно проводить на фоне минеральной подкормки овец и инъекции им витаминных препаратов, очищенными и гормональными препаратами - сывороточными - ГСЖК и гипофизарными – ФСГ, фоллитропином, графоллоном позволяющим получить до 98,3% полноценных эмбрионов, из числа вымытых и соответственно 4,63; 4,71; 5,61 качественных эмбриона на донора. Список опубликованных работ по теме диссертации:
«Асыл тұқымды қошқарлардың ұрығын ұзақ уақыт сақтау және эмбриондарды трансплантациялауды жетілдіру» тақырыбына 06.02.01 - ауыл шаруашылығы малын өсіру, олардың селекциясы, генетикасы және көбеюі мамандығы бойынша ауыл шаруашылығы ғылымдарының докторы ғылыми дәрежесін ізденуге арналған Аузбаев Сатыбалдының диссертациялық жұмысына жасалған |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям