Биотехнология» и260204 «Технология бродильных производств и виноделие» Бийск Издательство Алтайского государственного технического университета им. И. И. Ползунова 2009
|
|
Скачать 0.96 Mb.
|
|
6 Методы генетического конструирования Haemophilus parainfluenzae 6.2 Конструирование рекомбинантных ДНК |
|
^
IN VITRO 6.1 Биотехнология рекомбинантных ДНКДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота, высокомолекулярное вещество, содержащееся в ядрах клеток организмов и вместе с белками гистонами образующее вещество хромосом. ДНК – носитель генетической информации, ее отдельные участки соответствуют определенным генам. Молекула ДНК состоит из двух полинуклеотидных цепей, закрученных одна вокруг другой в правовинтовую спираль. Цепи построены из большого числа мономеров четырех типов нуклеотидов. Нуклеотид состоит из дезоксирибозы, остатка фосфорной кислоты и одного их четырех азотистых оснований – аденина, гуанина – пуриновые основания; цитозина, тимина (в РНК – урацила) – пиримидиновые основания. Азотистые основания нуклеотидов, будучи комплементарно связаны друг с другом (А – Т, Г – Ц), соединяют полинуклеотидные цепи в молекулу ДНК. Сочетания трех рядом стоящих нуклеотидов в цепи (триплеты или кодоны) определяют генетический код, а их последовательность – характер генетической информации. Способность ДНК к самоудвоению (редупликация) обеспечивает генетическую преемственность между поколениями организмов в процессе размножения. Расстояния между парами комплементарных оснований по длине спирали равно 0,34 нм. В одном ее витке размещается 10 пар оснований (3,4 нм). Диаметр спирали равен 2 нм. Макромолекула ДНК состоит из 10…15 тыс. и более дезоксирибонуклеотидов. У каждого вида организмов ДНК характеризуется специфическим распределением и количественным молярным соотношением азотистых оснований. Все это дает практически неисчерпаемое разнообразие вариантов, для разных организмов оцениваемое феноменальным числом от 1050 до 101000, в крайних выражениях значительно превышающем число атомов во Вселенной. Генетическая инженерия – ветвь молекулярной генетики, исследующая возможности и способы создания лабораторным путем (in vitro) генетических структур и наследственно измененных организмов, то есть создания искусственных генетических программ, с помощью которых направленно конструируются молекулярные генетические системы вне организма с последующим их введением в живой организм. In vitro соединяют фрагменты ДНК, которые в естественных условиях не сочетаются благодаря межвидовым барьерам (рекомбинантные ДНК). Согласно определению национальных институтов здоровья США, «рекомбинантными ДНК называют молекулы ДНК, полученные вне живой клетки путем соединения природных или синтетических фрагментов ДНК с молекулами, способными реплицироватья в клетке». Молекула рекомбинантной ДНК представляет собой соединенные вне клетки два компонента: вектор, обеспечивающий механизм репликации и экспрессии, и фрагмент клонируемой (чужеродной) ДНК, содержащие интересующие исследователя генетические элементы. К наиболее важным методам биотехнологии рекомбинантных ДНК относят следующие: 1) специфическое расщепление ДНК рестрикцирующими нуклеазами, что ускоряет выделение различных генов и манипуляции с ними; 2) быстрое секвенирование (установление последовательностей азотистых оснований в ДНК) всех нуклеотидов в очищенном фрагменте ДНК, позволяющее определить точные границы гена и кодируемую им аминокислотную последовательность полипептида; 3) гибридизацию нуклеиновых кислот, позволяющую с большой точностью выявить специфические нуклеотидные последовательности на основе их способности связывать комплементарные основания; 4) клонирование ДНК, суть которого сводится к введению ДНК-фрагмента в самореплицирующийся генетический аппарат (плазмиду или вирус), который используют для трансформации бактерий. Бактериальная клетка после трансформации способна воспроизводить этот фрагмент во многих миллионах идентичных копий; 5) генетическую инженерию, позволяющую получать модифицированные версии генов и затем внедрять их в клетки или организмы. Расщепление ДНК в специфических участках нуклеотидных последовательностей осуществляется особыми ферментами – рестрикцирующими нуклеазами, способными разрушить чужеродную ДНК. Все ферменты можно условно разделить на следующие группы: 1) используемые для получения фрагментов ДНК; 2) синтезирующие фрагменты ДНК на матрице РНК; 3) соединяющие фрагменты ДНК; 4) позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК; 5) применяемые для приготовления гибридизационных проб.  Каждый фермент, способный разрушить чужеродную ДНК, опознает в ней последовательность из 4…6 нуклеотидов. В настоящее время выпускается более 100 разнообразных рестриктаз. Каждый фермент опознает различные последовательности нуклеотидов и специфично разрывает их. При разрыве образуется серия фрагментов, называемая рестрикционной (рестрикта), с тупыми либо липкими концами. Преимущественно разрывается двунитевая ДНК.Рисунок 5 – Участки узнавания ДНК тремя рестриктазами из ^ (HpaI); Escherichia coli (EcoRI) и Haemophilus influenzae (HindIII) Многие рестриктазы вносят разрывы в две цепи ДНК со смещением на несколько нуклеотидов и образованием на концах фрагментов коротких одноцепочечных участков. Они способны образовывать комплементарные пары оснований с любым другим одноцепочечным участком, полученным с помощью того же фрагмента (липкие концы). Липкие концы позволяют легко соединить два любых фрагмента ДНК в одно целое. Полученный фрагмент ДНК можно встроить в очищенную ДНК плазмиды или бактериального вируса. Сравнение размеров фрагментов ДНК после обработки соответствующего участка генома набором рестриктаз позволяет построить рестрикционную карту, отражающую расположение определенной последовательности нуклеотидов в данном участке. Сравнением таких карт можно оценить степень гомологии между отдельными генами без определения их нуклеотидной последовательности. Рестрикционные карты важны для клонирования ДНК, решения эволюционных и филогенетических задач. В генной инженерии важно быстро секвенировать (определить последовательность нуклеотидов) любые очищенные фрагменты ДНК. В настоящее время такую информацию обрабатывают с помощью компьютерных программ. В биотехнологии рекомбинантных ДНК используют химический и ферментативный методы секвенирования. Оба метода быстры и результативны. ^ Сущность генетической инженерии сводится к целенаправленному конструированию генетических систем вне организма и последующему введению их в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата реципиентного организма и, кроме того, они привносят в него новые генетические и физико-биотехнологические свойства. Один из важных этапов конструирования молекулы ДНК – лигирование (или сшивание) генов с помощью фрагмента ДНК – лигазы. Сшивание фрагментов ДНК, содержащих нужные гены, осуществляют двумя основными методами: а) по «липким» концам; б) с помощью искусственно достроенных «липких» концов (ферментативным путем). «Липкие» концы – взаимнокомплементарные участки, длиной из 4…6 пар нуклеотидов. После того, как рекомбинантная ДНК сшита, ее вводят в живые клетки. Но поскольку она не способна к самовоспроизведению, ее разрушают внутриклеточные нуклеазы. Для того, чтобы рекомбинантная ДНК стала составной частью генетического аппарата клетки, она должна либо встроиться (интегрироваться) в ее геном и реплицироваться за его счет, либо быть способной к автономной репликации. Молекулы ДНК, способные акцептировать чужеродную ДНК и автономно реплицироваться, называют векторными молекулами. К числу векторов относят плазмиды, бактериофаги, вирусы животных. Векторы должны обладать следующими особенностями: 1) иметь субстратные участки для определенных эндонуклеаз рестрикции; 2) иметь свойства репликона; 3) содержать один или несколько маркерных генов, которые после проникновения вектора в клетку придают ей фенотип, свидетельствую-щий о присутствии вектора. В частности, для бактериальных векторов в качестве маркерных генов чаще всего используются гены, вызывающие устойчивость клеток к некоторым антибиотикам. Таким образом, все векторы обеспечивают репликацию встроенных генов, их экспрессию, интеграцию в хромосому клетки и т.д.  Рисунок 6 – Встраивание изолированного гена в генетический вектор Чаще других в генетической инженерии в качестве векторов используют плазмиды. Первый плазмидный вектор был получен С. Коэном (1973 г). Его источником была плазмида E.coli R6-5 c молекулярной массой 65 кDa. Плазмида стала родоначальником серии векторов и других структур. Особое место в генетическом манипулировании занимает плазмида, относящаяся к группе колициногенных плазмид Е.coli, Col E1, которая реплицируется независимо от хромосомы и присутствует в количестве, примерно, 24 копий на клетку. Ее широко используют благодаря селективному маркеру в качестве вектора для клонирования фрагментов про- и эукариотической ДНК в E.coli. Плазмидные векторы в настоящее время чрезвычайно разнообразны за счет следующих свойств: – уменьшения размеров плазмиды вследствие изъятия участков, не обязательных для репликации (чем больше плазмида содержит уникальных участков узнавания для рестриктаз, тем они универсальнее); – гибридизации векторов одного рода с другими векторами или природными плазмидами (например, получены гибридные векторы комбинацией плазмиды и фага-λ), при этом вновь сконструированная рекомбинантная ДНК должна сохранить репликационные свойства исходной плазмиды; – использования новых плазмид; – применения транспозонов; – создания векторов с генетическими маркерами, позволяющими вести отбор рекомбинантных клонов. Векторные плазмиды и векторные вирусы со встроенными чужеродными генами часто называют гибридными или химерными плазмидами (или фагами). После конструирования рекомбинантных ДНК их с помощью трансформации вводят в реципиентный организм: бактериальную, грибную, растительную или животную клетку. Трансформация предусматривает предварительную обработку клеток соединениями, обусловливающими проникновение ДНК внутрь клеток с последующим их помещением в среду, в которой способны существовать только клетки, получившие векторную молекулу (например, в среду с определенным антибиотиком). Процесс инфицирования клеток с помощью чужеродных ДНК, приводящий к образованию зрелого фагового потомства, назван трансфекцией, то есть вирусные частицы развиваются в клетке, при этом она приобретает новые свойства. При обработке клеток бактерий хлористым кальцием их клеточные стенки становятся проницаемыми для ДНК. Однако эффективность проникновения экзогенной ДНК в клетку довольно низкая, трансформируется небольшая часть клеток. Из общей массы их отделяют клонированием. Для этого бактериальную суспензию высевают в чашки Петри из расчета от 5 до 10 бактерий на 1 см3 поверхности. Одна клетка образует на поверхности маленькую колонию, называемую клоном. Из одной клетки образуется один клон, все клетки которого имеют свойства бактерии-родоначальника. |
отлично
2
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям