Тию направляет сведения о предстоящей защите диссертации и автореферат диссертации Коханова Александра Владимировича
|
|
Скачать 0.89 Mb.
|
|
Результаты исследования и их обсуждение Ионообменная хроматография |
|
Как видно из табл.2, большинство больных составляли лица молодого и среднего возраста, тогда как пациентов старше 60 лет было 16,3%. У лиц молодого и среднего возраста преобладали ЧМТ, переломы голени и бедра, частое наличие сопутствующей алкогольной интоксикации (рис.1), а в возрасте 60 лет и старше – переломы вертельной области и шейки бедренной кости. Среди мужчин переломы голени встречались чаще, чем у женщин почти в 2 раза, диафиза бедра и ЧМТ — более, чем в 3 раза. Среди женщин преобладали переломы шейки бедренной кости (более чем в 2 раза чаще, чем у мужчин). Ни в одной группе обследованных больных в период наблюдения летальных исходов не зафиксировано. Больные с сопутствующей соматической патологией исключены из исследования. Больные с кранио-абдоминальной сочетанной травмой, имеющих высокую госпитальную летальность (Шапот Ю.Б., 2002), а также пострадавшие с ретроспективно установленной политравмой более двух систем в данное исследование не включены. Оценивались следующие клинические параметры, необходимые для балльной оценки тяжести травмы и общего состояния: характер, локализация и степень повреждений (AIS, ISS, шкала Цибина), степень тяжести шока (индекс Альговера), комы (по шкале ком Глазго — SCG) и общего состояния (шкала ВПХ-СП, APACHE-II — у пострадавших и больных, находящихся в ОРИТ, отдельно три параметра SIRS лейкоцитоз, температуру, частоту сердечных сокращений в баллах, взятых из шкалы APACHE-II). Наличие и степень алкогольной интоксикации (АИ) при поступлении определялось по записи в истории болезни о концентрации этанола в крови. Учитывались следующие характеристики больных: возраст, пол, характер предпринимавшегося оперативного вмешательства и последующих физиотерапевтических воздействий и вид посттравматических осложнений (нагноения, пневмонии).  Рис.1. Частота наблюдения алкогольной интоксикации у пострадавших в зависимости от степени тяжести изолированной травмы опорно-двигательного аппарата (ОДА), изолированной ЧМТи политравмы (ЧМТ + скелетная травма) Всем больным проводилось подробное клиническое обследование, включая в зависимости от характера травмы методы инструментальной (ЭКГ, ЭЭГ и др), рентгенологической (рентгенография, в том числе рентгеноскопия, КТ, ангиография). У тяжелых больных в реанимационном отделении мониторовались параметры, необходимые для количественной оценки тяжести состояния по угрозометрическим шкалам. Всем больным с изолированной и сочетанной ЧМТ, травмой ОДА проводилась адекватная соответстующая терапия и необходимые оперативные вмешательства. Кровь с антикоагулянтом (трилон Б) и сыворотку крови для гематологических, биохимических и иммунохимических исследований в соответствии с требованиями этического комитета забиралась на 1-3, 5-7 и при возможности на 14-19 сутки после травмы. У некоторой части больных удавалось провести дополнительный 4-й забор крови на 21-28 сутки. Общее количество проанализированных с 2000 по 2007 годы образцов крови и сыворотки от 472 пациентов и 68 доноров составило 1773. Результаты анализа крови пострадавших включали СОЭ и следующие параметры, определенные на автоматическом гематологическом анализаторе МАХ (Франция): WBC (лейкоциты), RBC (эритроциты), HGB (гемоглобин), HCT (гематокрит), MCV (средний объем эритроцита), MCH (среднее содержание гемоглобина в эритроците), MCHC (средняя концентрация гемоглобина в эритроците), RDW (анизоцитоз), PLT (тромбоциты), NEU%#, LYM%#, MON%# или MXD%# (соответственно % и абсолютное количество нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов или смеси моноцитов, эозинофилов и базофилов). Лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ) рассчитывали по формуле Кальф-Калифа, С.Ф.Хомич в модификации А.Л.Костюченко и соавт. (2000):  ,У больных, находящихся после тяжелой травмы в реанимационном отделении, помимо шкалы комы Глазго (SCG), точнее ее обратной величины (15 — SCG), двух гематологических показателей HCT и WBC, креатинина в сыворотке, дополнительно учитывались еще 8 параметров, необходимых для балльной оценки по системе APACHE-II: температура тела, среднее АД [(2АДдиаст+АДсист)/3], ЧСС (частота сердечных сокращений), ЧДД (частота дыхательных движений), рО2 или раО2, рН артериальной крови или содержание Na+, K+ и бикарбоната в сыворотке, сыворотки. Триада клинических показателей: гипертермия, тахикардия и лейкоцитоз считаются клиническими проявлениями SIRS. Признаками напряженности SIRS служили повышение температуры более 38,5°С, ЧСС более 90 в мин и лейкоцитоз свыше 12×109/л — параметры, которые включены в шкалу APACHE-II. Исходя из этой системы, SIRS в баллах оценивали следующим образом: температура – 38,5-38,9°С (1 балл), 39-40,9°С (3 балла), >41°С (4 балла), пульс –110-139 (2 балла), 140-179 (3 балла), >180 (4 балла), лейкоциты, ×109/л – 15-19,9 (1 балл), 20-39,9 (2 балла), >40 (4 балла). Из биохимических показателей крови, определенных одномоментно на автоматическом анализаторе "Hitachi 911" (Австрия) с использованием реактивов фирмы «Олвекс» (г.Санкт-Петербург) или на анализаторе «HUMAN» с наборами реактивов фирмы «HUMAN» (Германия) и «LACHEMA» (Чешская Республика), в исследование включены следующие параметры: уровень глюкозы, общего белка, альбумина, ферментов (АСТ, АЛТ, ГГТ, ЛДГ, КК и ЩФ), мочевины, мочевой кислоты и креатинина. Содержание молекул средней массы (МСМ) в сыворотке крови определяли скрининг-методом (Габриэлян Н.И. с соавт.,1985). Уровень МСМ выражали в единицах оптической плотности при длине волны 280 нм. В динамике травматической болезни мозга и ОДА различными иммунохимическими методами были исследованы сывороточные уровни белков, отражающих влияние травмы на иммунный и системный воспалительный ответ — иммуноглобулины трех классов (IgG, IgM, IgA), острофазовые белки: лактоферрин (ЛФ), СРБ, связанный с беременностью α2-гликопротеин (СБАГ), α2-макроглобулин (МГ), на окислительный стресс— церуллоплазмин (ЦП), на систему гемостаза — продукты деградации фибриногена (ПДФ), повреждение тканей — ферритин (Фр), и органоспецифические белки: миоглобин (MG), тропонины Т и I (TrТ, TrI), креатинфосфокиназа (КФК), костная кислая фосфатаза (ККФ), костная щелочная фосфатаза (КЩФ), нейроспецифический белок S-100 (S-100), репаративную регенерацию — онкомаркеры альфа-фетопротеин (АФП), раковоэмбриональный антиген (РЭА) и щелочную фосфатазу плацентарного типа (ПЩФ). В этих же сыворотках больных иммунохимическими методами исследовалась концентрации транспортных сывороточных белков сывороточного альбумина (СА), его термостабильной фракции (ТСА), транскортина (ТК), соотношению уровней субфракций альбумина и содержание МСМ, а в крови этих же больных иммунохимическими методами исследовалась концентрации HbF. Количественное определение HbF проводили в гемолизированной сапонином или гипотоническим шоком крови методом радиальной иммунодиффузии по Манчини с использованием кроличьих антисывороток к HbF из банка иммунохимических тест-систем Астраханской медицинской академии. Количественное определение СБАГ, СРБ и ПДФ, а также идентификация тканевых и сывороточных белков в период конструирования моноспецифических тест-систем проводилась двойной радиальной иммунодиффузией (РИД) в агаре по Ouchterlony в модификации Н.И. Храмковой и Г.И. Абелева (1961), концентрации ТСА, МГ, ЦП и ПДФ, иммуноглобулинов IgG, IgA, IgM — методом радиальной иммунодиффузии в геле по Mancini (1970) на готовых планшетах или с применением тест-систем и моноспецифических антисывороток фирм-изготовителей (Нижегородского, Санкт-Петербургского НИИВС; Берингверке, ФРГ; Sebia, Франция; Corning, Великобритания). СА, ТСА, ТК и МГ — методом метод «ракетного» иммуноэлектрофореза по Laurell et al. (1972), ПЩФ, частично ЛФ и Фр в экстрактах тканей — методом встречного иммуноэлектрофореза по Kohn (1970)., ККФ, КЩФ определяли в единицах Боданского денситометрией диск-электрофореграмм после инкубации с ингибиторами и субстратами. ПЩФ и оксидазную активность ЦП после специального окрашивания иммунопреципитатов. Определение высокочувствительного С-реактивного белка (hsCRP) проводили на автоматическом анализаторе Cobas С (Швейцария), идентификацию КФК, миоглобина и тропонинов Т и I — методом иммунохромато-графического анализа (Прогрессивные медицинские технологии, Россия; ACON, США; Hoffman La Rochе, Россия—Швейцария). РЭА, кортизол, частично АФП и Фр определяли методом РИА с реактивами фирм (Höechst, Германия; Cis Bio International, Франция; рио-РЭА-125J–М, Беларусь). Радиометрию результатов РИА осуществляли на радиоизотопном анализаторе "Гамма-1" и "Гамма-800". В основном антигены (АФП, ЛФ, Фр, ЦП, S-100, МГ) определялись количественно методом ИФА в различных модификациях с использованием коммерческих тест-наборов (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск; «Spinreact S.А.», Испания) в соответствии с требованиями фирм-поставщиков реагентов. Молекулярные массы очищенных белков определяли методом диск-электрофореза в SDS- и градиенте концентраций ПААГ, на колонке с сефадексом G-100 и G-200 с использованием как минимум пяти соответствующих маркеров с известной молекулярной массой (Sigma): ферритина (440 kDa), сывороточного альбумина быка или человека (67 kDa), овальбумина (45 kDa), трипсина (23 kDa), тропонинов T, I, C (38; 24; 18,5 kDa), цитохрома С (12 kDa). Для изучения влияния мезодиэнцефальной модуляции (МДМ) на лабораторные показатели крови с первых суток после получения травмы 77 пациентам с переломами длинных костей нижних конечностей из групп ОДА I и II и 33 пациентам с сотрясением и ушибом головного мозга легкой степени из группы ЧМТ I в схему лечения были включены сеансы МДМ по 12 процедур модулированной частотой 70–90 Гц, длительностью импульса 3,0-5,0 мс, продолжительность воздействия - 30 минут. Остальные больные служили контрольной группой, которых лечили по традиционной схеме. Для проведения данной процедуры использовался аппарат МДМ – 101. Электроды накладывались в саггитальной плоскости, один из которых располагался в области лба, второй в проекции затылочного отверстия. Сила тока зависела от индивидуальной чувствительности пациентов и колебалась от 0,5 до 2,5 мА. Сеансы мезодиэнцефальной модуляции хорошо переносились больными. Пострадавшие, имевшие на голове раны и другие дефекты кожного покрова входили в контрольную группу больных, не получавших МДМ-терапию. Для статистической обработки и анализа полученных результатов исследования, а также построения графиков на полученных данных был использован лицензионный пакет прикладных программ статистического анализа Excel-98 (Microsoft), Statistica 6.0 (StatSoft. Inc.). Для каждой выборки вычисляли средние величины (М), среднее квадратичное отклонение (σ), среднюю ошибки средней арифметической (m). Оценку нормальности распределений проводили с использованием коэффициентов асимметрии и эксцесса. С целью определения значимости (достоверности) р различий сопоставляемых средних величин применялся критерий t Стьюдента и однофакторный дисперсионный анализ с вычислением критерия F Фишера. Разницу средних величин считали достоверной при р < 0,05. Статистические взаимосвязи между показателями оценивались применением корреляционного, регрессионного анализа и методов многомерной статистики (Гланц С., 1999). ^ Среди иммунохимических маркеров, представляющих интерес для оценки травматической болезни, для трех белков (СБАГ, ТК, ПЩФ) по разным причинам, отсутствовали доступные коммерческие наборы для их определения. Для конструирования иммунохимических тест-систем на связанный с беременностью альфа2-гликопротеин (СБАГ), транскортин (ТК), плацентарную щелочную фофатазу (ПЩФ) предварительно исследовали их поведение на гелях для ионообменной (КМ- и ДЕАЕ-целлюлоза), гидрофобной (фенил-сефароза), амфифильной (агароза) и аффинной хроматографии (эстрадиол-сефароза и голубая сефароза). Параллельно изучались хроматографические характеристики еще двух белков — сывороточного альбумина (СА) и альфа-фетопротеина (АФП). Для иммунохимической идентификации белков во фракциях на данном этапе исследования применяли тест-системы для РИД по Оухтерлони, любезно предоставленные д.м.н. Сухаревым А.Е. (ПЩФ), к.м.н. Безрукавниковой Н.В. (ТК), к.м.н. Никулиной Д.М. (СБАГ) и антисыворотки НИИВС им. И.И.Мечникова (АФП и поливалентные к белкам сыворотки человека). Акцент на методы гидрофобной хроматографии и аффинной элюции сделан в связи с общей особенностью всех пяти белков связываться или изменять свою активность (ПЩФ) в присутствии стероидных гормонов и триазиновых красителей. ^ . Установлено, что АФП, ПЩФ, ТК и ЧСА не адсорбируются на катионообменнике СМ-сефадексе С-50 (Pharmacia, Швеция) при трех значениях рН (8,0; 6,6; 5,8) 0,02М фосфатного и рН 4,6 0,02М ацетатного буферов. СБАГ довольно прочно связывается с катионообменным гелем в нейтральной и слабощелочной среде (рН 6,6 и 8,0). Нами проанализирован характер элюции белков с этих анионообменников в зависимости от значения рН буферных систем (табл.3). Пробы в колонку вносились из расчета 20 мг белка на 1 мл геля. Хроматографию сывороток и экстрактов на колонке с ДЕ-52 целлюлозой проводили стартовым 0,01 М фосфатным или ацетатным буфером с линейным градиентом NaCl от 0 до 0,3М. Все белки связываются с анионообменной целлюлозой DЕ-52 (Watman, США) при низкой ионной силе (0,02 М) стартового буфера в диапазоне рН 5–9. Установлено, что при рН 5,1 ацетатного буфера все белки слабо связывались с анионообменником и легко десорбировались уже 0,05М NaCl. При всех остальных значениях рН первым из пяти белков элюируется ПЩФ при концентрации NaCl 0,10М. Альбумин десорбируется с хроматографической колонки широким пиком при ионной силы NaCl от 0,12 до 0,21М независимо от рН элюирующего буфера в диапазоне от 5,8 до 8,0. В отличие от альбумина пик АФП с уменьшением рН элюэнта десорбируется все более высокими концентрациями NaCl (табл.3). Этот факт может быть использован для отделения АФП от основной массы СА как один из этапов выделения и очистки АФП. Параметры десорбции ТК близки к таковым для СА (табл.3) и не позволяют отделять его от остальных сывороточных белков. Повышенную «липкость» проявляет СБАГ и к анионообменному сорбенту (табл.3). При рН 8,0-6,4 белок элюируется более высокими концентрациями NaCl, чем все остальные рассматриваемые белки. СБАГ также как и СА десорбируется достаточно широким пиком, в связи с чем, применение ионообменной хроматографии в классическом виде для очистки СБАГ не дает определенных преимуществ. Вместе с тем, возможности анионообменной хроматографии могут быть расширены за счет использования аффинной элюции и гидрофобных свойств ионообменников на основе целлюлозы. Таблица 3. Условия десорбции (начальная и конечная молярной концентрации элюирующего буфера) белков с анионообменной целлюлоза ДЕ-52
|
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям