Тию направляет сведения о предстоящей защите диссертации и автореферат диссертации Коханова Александра Владимировича
|
|
Скачать 0.89 Mb.
|
|
^ . Поскольку макромолекулы АФП, ПЩФ, ТК, СБАГ и ЧСА имеют на своей поверхности гидрофобные области, необходимые для осуществления их транспортной и (или) каталитической функции (Чегер С.И., 1975; Луйк А.И., Лукьянчук В.Д., 1984; Терентьев А.А., 1990; Розен В.В., 1994; Кривенцев Ю.А., 1999; Сухарев А.Е. и соавт., 2006), мы сочли целесообразным применение гидрофобной хроматографии для изучения их поведения на гидрофобных гелях, их разделения и очистки. В качестве гидрофобного сорбента мы использовали фенилсефарозу CL-4В. Активацию геля проводили в колонке последовательным промыванием 1% тритоном Х-100 на 0,02М фосфатном буфере рН 7,2, 20%, 50%, 96% этанолом, бутанолом, этанолом в обратной последовательности, фосфатным буфером и буфером с добавлением 0,5 М NaCl или 2 М (NH4)2SO4. Смесь белков из расчета 50 мг на мл геля в 2М сульфате аммония после центрифугирования при 8000 g и удаления осадка при комнатной температуре наносили на колонку, заполненную фенилсефарозой. В случае хроматографии сывороток беременных, содержащих СБАГ, проба и колонка с агарозой содержали 1 моль/л соли. Результаты хроматографических экспериментов представлены в табл.4. В варианте хроматографии нисходящим линейным градиентом сульфата аммония забуференного до рН 7,2 СА начинал десорбироваться 0,8М солью и его широкий пик заканчивался при 0,15М концентрации соли, но следы ЧСА содержались и в последних фракциях. АФП более прочно связывался с сорбентом и незначительно элюировался заключительным объемом градиентного буфера, начиная с 0,13 М (NH4)2SO4, но основная фракция АФП продолжал десорбироваться после дополнительного промывания колонки 0,02 М стартовым буфером. ПЩФ элюировался с фенилсефарозы раньше АФП, начиная с 0,5М (NH4)2SO4, и его пик заканчивался при 0,1М концентрации соли. Пик ТК десорбировался после СА. СБАГ прочно связывался с гидрофобной колонкой и не десорбировался промыванием стартовым буфером. Для его элюции требовалось дополнительная обработка колонки неионным детергентом. Таким образом, применение простого солевого градиента позволило нам отделить АФП, ТК и СБАГ от основной массы альбумина. Таблица 4. Условия десорбции (начальная и конечная молярной концентрации элюирующего буфера) белков с фенил-сефарозы CL-4B
* — линейный градиент сульфата аммония 1М - 0 М Десорбция связанных с фенилсефарозой белков ускорялась снижением полярности 0,02 М фосфатного буфера добавлением 0,1% тритона X-100, но не глицерина. Дополнительное введение в элюирующий буфер гидрофобных лигандов (спиртовых растворов билирубина, стероидных гормонов) с целью создания эффекта аффинной элюции было невозможно из-за их нерастворимости в солевых растворах высокой концентрации. Как видно из табл.4, при изменении полярности с помощью детергента и глицерина на фоне неизменной 1М концентрации сульфата аммония, сходные по электрофоретической подвижности белки ведут себя по разному: тритон хорошо десорбирует ПЩФ (0,1-0,3%), СА (0,1-0,5%), ТК (0,2-0,5%), и АФП (0,2-0,4%) пики которых полностью накладываются друг на друга. СБАГ в присутствии сульфата аммония десорбируется с гидрофобной колонки только высокими концентрациями тритона Х-100. Глицерин частично вымывает СА и ПЩФ, начиная с 25% концентрации вплоть до последней фракции (75%), начиная с 50% элюирует ТК и не элюирует АФП и СБАГ на фоне такой ионной силы, задаваемой сульфатом аммония. В последующих опытах (табл.4) нарастающий градиент тритона или глицерина добавлялся к понижающемуся градиенту концентрации соли (ножницы). Применение таких комбинаций получило в гидрофобной хроматографии особенно широкое распространение (Туркова Я., 1979; Скоупс Р., 1985; Ochoa J.L. 1978). Обе комбинации ножниц (табл.4) давали приблизительно сходные картины элюции белков: сначала вымывался альбумин, затем ПЩФ, ТК и АФП, причем, их пики частично перекрывались. Последним элюировался СБАГ. Таким образом, целенаправленно изменяя в циклах гидрофобной рехроматографии концентрацию соли, детергента и неполярного растворителя в элюирующей буферной системе, можно подобрать условия для их выделения и очистки. ^ . Обнаружено, что замещенные целлюлозы способны эффективно адсорбировать белки при высокой концентрации соли (Скоупс Р., 1985). Еще в большей степени, чем у ДЕАЕ-целлюлозы гидрофобные свойства выражены у агарозы. Благодаря своей амфифильной природе эти матрицы (частично гидрофобные и частично гидрофильные) подходят для адсорбции белков при высоких концентрациях соли, чем чисто гидрофобные материалы (Von der Haar F., 1976). Белки, связанные с такими целлюлозными и агарозными матрицами, можно элюировать раствором с такой же высокой концентрацией соли, которая используется для их адсорбции, добавив в раствор вещества, ослабляющие водородные связи, — глицерин, сахарозу, мочевину или этанол (Fujita T. et al., 1980). Таким образом высаливающая хроматография на агарозном геле может использовать как принципы гидрофобной, так и аффинной хроматографии. Важным ограничением амфифильной хроматографии по сравнению с аффинной является то, что лиганд должен сохранять способность связываться с белком при высокой концентрации соли. В качестве амфифильного сорбента мы использовали агарозу (Serva, США). Активацию геля проводили в колонке по схеме для фенилсефарозы и уравновешивали 2М (NH4)2SO4. В случае хроматографии сывороток беременных, содержащих СБАГ, проба и колонка с агарозой содержали соли в 2 раза меньше (1 моль/л). Смесь белков из расчета 10 мг на мл геля в 2М или 1М сульфате аммония после центрифугирования при 8000 g и удаления осадка наносили на колонку, заполненную агарозой при комнатной температуре. Установлено что в присутствии 2М сульфата аммония, растворимые при такой концентрации белки (ПЩФ, ТК, СА, АФП) адсорбируются на геле агарозы, снижение концентрации соли до 1,8-1,5М вызывает их десорбцию с колонки. Нерастворимый в 2М (NH4)2SO4 СБАГ удерживается на агарозе при 1-0,5М концентрации соли и элюируется при более низких концентрациях сульфата аммония в буфере. При постоянной 1М концентрации сульфата аммония десорбцию СБАГ с агарозы можно осуществлять 0,1% тритоном Х-100, солевым 5-15% раствором глицерина или 1-2М мочевины. ^ . Из аффинных сорбентов для исследования хроматографичекого поведения белков мы применяли голубую сефарозу (Pharmacia, Швеция), представляющую собой коммерческий конъюгат сефарозы 4В с ковалентно присоединенным красителем цибакроновым синим, и два варианта иммобилизованного эстрадиола. Конъюгат эстроген-бензидин-сефароза был синтезирован и любезно предоставлен канд. хим. наук Р.3.Алиевым (Астраханская медакадемия) и представлял собой иммобилизованный на сефарозе через бифункциональный бензидиновый спейсер эстрадиол, ковалентно присоединенный по кольцу А. Второй сорбент — эстрадиол-С-17-триазинхлорид-сефароза был приготовлен на кафедре биохимии РГМУ и любезно предоставлен член–корр. РАМН, профессором А.А.Терентьевым. На этапе получения высокоочищенных препаратов АФП, ТЩФ, ТК и СБАГ мы применили аффинные сорбенты, в которых использовались иммобилизованные различными методами антитела (негативные и позитивные иммуносорбенты). Результаты изучения поведения белков на двух типах неантительных аффинных сорбентов, лиганды которых, эстрадиол и триазиновый краситель — цибакроновый синий, по литературным сведениям имеют сродство к исследуемым белкам (Иванов В.Б.,1982; Скоупс Р., 1985) представлены в табл.5. На подготовленную к работе голубую сефарозу наносили диализованные против стартового 0,02 М трис-солянокислого буфера рН 7,4 растворы белка из расчета 10 мг белка на 1 мл влажной суспензии. Хроматографию проводили стартовым буфером в объеме 160 мл со скоростью 10 мл/час линейным от 0 до 2М градиентом NaCl. Собранные фракции иммунохимически тестировались на изучаемые белки. Установлено что на голубой сефарозе сорбируется альбумин, но не ПЩФ, АФП и ТК. Основной пик ЧСА обнаруживается во фракциях, содержащих 0,8-1М NaCl, однако альбумин частично вымывается стартовым буфером и загрязняет фракции АФП. СБАГ частично связывается с голубой сефарозой и элюируется 0,07-0,12 М NaCl на 0,02 М, трис-солянокислом буфере, другая часть этого белка элюируется стартовым буфером. Таким образом, АФП и альбумин отличаются по их поведению на голубой сефарозе — ЧСА связывается с красителем, АФП — нет. Полученные данные обосновывают применение на одном из этапов очистки АФП негативной хроматографии на сорбенте с триазиновыми красителями — голубой сефарозе. Что касается адсорбции СБАГ на голубой сефарозе, то учитывая физико-химические свойства этого белка, можно предположить о катионообменном, а не об аффинном механизме его связывания с окрашенным гелем. Хроматографию белков на сорбентах эстрадиол-бензидин-сефарозы и эстрадиол–С-17-сефарозы проводили в двух режимах (табл.5). Смесь белков, диализованная против солевого фосфатного буфера наносилась на колонку с эстрадиол-сефарозой, промывалась стартовым буфером и элюировалась ступенчатым градиентом NaCl до 1М на том же буфере. Последние ступени кроме соли содержали 2% тритона или эстрон в 20% диоксане. Для хроматографии на эстрадиол-сефарозе в гидрофобном режиме проба в стартовом фосфатном буфере рН 7,2 с добавлением 1М сульфата аммония элюировалась нисходящим линейным градиентом этой соли. В первом режиме на колонку наносилась диализованная против стартового буфера смесь исследуемых белков, при этом все белки вымывались со свободным объемом, не связываясь с сорбентом. Дополнительная последовательная элюция через колонку буферного раствора со ступенчатым градиентом NaCl до 2М, 1% тритона Х-100 и или эстрона на 20 % водном растворе диоксана не обнаружила в этих фракциях исследуемых белков. Таблица 5. Условия десорбции (начальная и конечная молярной концентрации элюирующего буфера) белков с с аффинных сорбентов
Так как белки при низкой ионной силе буферного раствора не связывались с иммобилизованным на сефарозе через бензидиновый спейсер по бензольному кольцу эстрадиолом, что совпадает с известными данными (Терентьев А.А., 1990), мы попытались сорбировать белки на этой колонке в гидрофобном режиме, при высокой молярности стартового буфера (табл.5.). Установлено, что все белки связывались с эстрадиол-бензидин-сефарозой как с гидрофобным сорбентом в 1М сульфате аммония, (если на 1 мл аффинного геля наносилось не более 10 мг белка) и десорбировались с колонки при уменьшении концентрации соли в последовательности: СА => АФП => ПЩФ => ТК => СБАГ (табл.5). Аффинный сорбент эстрадиол-С-17-триазинхлорид-сефароза, созданный для выделения эстрогенсвязывающих белков при хроматографии стартовым буфером не связывал СА, АФП, ТК и ПЩФ, так как имеет слишком короткий триазиновый спейсер (Терентьев А.А., 1990), однако в данном режиме на нем адсорбировался СБАГ, который потом элюировался при добавлении в стартовый буфер 1 М NaCl или водонасыщенного бутанола на этом буфере. ^ . Обнаруженные нами особенности поведения СБАГ и ТК на хроматографических носителях легли в основу разработанных нами методов одновременного выделения этих белков из пула (500 мл) сыворотки крови беременных III триместра (табл.6 и 7). Метод для обоих белков включает последовательную высаливающую, ионообменную, гидрофобную и аффинную хроматографию и не требует промежуточных этапов диализа и концентрирования. Таблица. 6 Характеристика препарата СБАГ на этапах выделения.
Характеристика очищенного СБАГ представлена на рис.2, а очищенного транскортина вместе с маркерами молекулярной массы на рис.3. Полученный нами препарат СБАГ не взаимодействовал с антисыворотками против сывороточных белков донора и против сывороточного альбумина и давал единственную дугу преципитации с поливалентной антисывороткой, полученной иммунизацией кроликов сывороткой беременных. Методом диск-электрофореза препарат СБАГ выявлял только одну окрашенную полосу в зоне макроглобулинов (рис.2), а электрофорез полоски полиакриламидного геля во втором направлении с антисывороткой к сывороточным белкам беременной выявил единственный пик иммунопреципитата, принадлежащий СБАГ (рис.2). По результатам SDS-ПААГ электрофореза препарат транскортина выявлял только одну окрашенную полосу в зоне между БСА (65 кД) и овальбумином (45 кД), соответствующую молекулярной массе 50-55 кД (рис.3). Таблица. 7 Характеристика препарата транскортина на этапах выделения.
Оба препарата не проявляет иммунохимической активности при взаимодействии с антителами к ТБГ, ПЩФ, АФП и с большинством коммерческих антисывороток к белкам плазмы человека, а их антисыворотки не дает перекрестных линий преципитации между собой (рис.4). Рис. 2. Двумерный электрофорез препарата СБАГ. В первом направлении – электрофорез в 7,5% ПААГ, во втором направлении – электрофорез в агарозе с иммунопроявлением 15% антисывороткой к сывороточным белкам беременной.  Для выделения и очистки ПЩФ гомогенат зрелой плаценты, полученой в родах и освобожденной от плодных оболочек, смешивали с тремя объемами 0,02М трис-HCl буфера рН 8,6, троекратно замораживали при –6-8°С, оттаивали и добавляли один объем холодного бутанола. Моноспецифические антисыворотки на СБАГ, транскортин и ПЩФ использованы для получения иммунодиффузионных и иммуноферментных наборов для их количественного определения при изучении роли иммунохимических показателей в оценке состояния пострадавших с изолированной и сочетанной ЧМТ и травмы ОДА. Смесь перемешивали на магнитной мешалке, центрифугировали и в делительной воронке собирали нижнюю (водную) часть, содержащую ПЩФ. ферритин (440 кД) церулоплазмин (180 кД) БСА (67 кД) транскортин овальбумин (45 кД) линия Кольрауша Транскортин —>  Рис. 3. Характеристика очищенного препарата транскортина методом SDS-ПААГ электрофореза в сопоставлении с маркерами молекулярной массы  Рис.4. Иммунодиффузионный анализ качества полученных антисывороток против СБАГ и ТК. В отличие от известных способов получения ПЩФ (Lehman et al., 1974; Сухарев А.Е. с соавт., 2006), в основе предлагаемого нами способа, лежит обнаруженный нами феномен относительной устойчивости ПЩФ к некоторым ионам тяжелых металлов (кадмий) при прогревании. К плацентарному экстракту добавляли сульфат кадмия до конечной концентрации 0,14% и раствор прогревали при 65°С в течение 1-3 минут до образования осадка, который отделяли центрифугированием (табл.8). В супернатант добавляли сульфат аммония до 40% насыщения и после удаления осадка проводили с супернатантом дальнейшие хроматографические этапы, которые отражены в таблице 8. Степень очистки ПЩФ по данному способу превышала 1000 раз, а чистота препарата достигала 98% (табл.8). Удельная активность фермента при его концентрации 10 мг/л составляла 8-10 тыс нмоль/сек/л (МЕ). Так как в иммунохимическом анализе у пострадавших с травмами применялась коммерческая тест-система на АФП, данные по его хроматографической очистке не приводятся. Таблица. 8 Характеристика препарата ПЩФ на этапах выделения.
^ . Отношение к температуре — одна из важных физических характеристик белка. Термостабильность белков может варьировать в определенных пределах в зависимости от целого ряда факторов: природы белка, рН, ионной силы раствора, присутствия различных низкомолекулярных лигандов. На примере транспортного белка — сывороточного альбумина, обладающего сродством к большому количеству гидрофильных и гидрофобных лигандов нами исследована возможность регулировать такой параметр как термическая устойчивость. Выбор СА в качестве экспериментальной модели связан не только с его биологической ролью в организме как главного неспецифического транспортного белка сыворотки, но и с удобством его иммунохимической регистрации даже при тысячекратном снижении концентрации (рис.5) Для сравнительной оценки влияния лигандов на температуру денатурации СА в качестве низкомолекулярных лигандов использовали спиртовые растворы билирубина и эстрадиола (Merck, ФРГ), водонасыщенный бутанол, растворы глицерина, сульфата аммония и хлорида натрия различной концентрации (Реахим, Россия). Кроме того, исследовали комбинацию неизвестных низкомолекулярных лигандов в составе смывов гипертоническим раствором (1M NaCl) с медицинских угольных сорбентов «СНК», «СКК» и «СУГС» после сеанса гемосорбции у больных с интоксикационным синдромом различной этиологии (рис.6), полученными из отделения гемодиализа НПК «Экологическая медицина» Газпрома (г. Астрахань). Рис.5 Результаты определения в крови уровней термостабильной фракции альбумина методом «ракетного» иммуноэлектрофореза по Лоурелю в зависимости от степени нагрузки альбумина лигандом   Рис.6. Кривые денатурации альбумина в присутствии различных лигандов В качестве препаратов СА использовали сыворотки крови доноров, беременных, больных с выраженным эндотоксикозом, пуповинной крови и кристаллический СА человека фирмы BDH (США). Перед прогреванием готовили 0,5% растворы СА, а сыворотки разводили в 10 раз для профилактики гелеобразования. Препараты СА с добавлением лигандов прогревали в стеклянных пробирках на водяной бане при следующих режимах 50° × 1 час, 60° × 1 час, 70° × 15 мин, 80° × 15 мин, 90° × 10 мин или 100° × 10 мин. Установлено, что СА переносит без денатурации температуру до 70°С, сохраняется на четверть при 80°С и на 2-3% при 100°С. Высокие концентрации глицерина (20%) и солей (1М) предохраняют белок от денатурации при кипячении на 20-40%. Незначительное (до 2-3 раз) увеличение термостабильной фракции альбумина (ТСА) при 100°С наблюдается под влиянием гидрофобных лигандов (эстрадиола и билирубина). Способность повышать концентрацию ТСА выявлена также у смеси токсинов элюированных с гемосорбента «СУГС» от больных перитонитом (рис.6). В серии экспериментов иммунохимическими методами в индивидуальных разбавленных сыворотках здоровых лиц и больных с различной патологией, сопровождающейся эндотоксикозом, до и после обработки активированным углем определяли концентрации альбумина (ракетный иммуноэлектрофорез) (рис.5). Достоверно отличающиеся концентрации белков в параллельных пробах до и после обработки активированным углем выявлены у больных с выраженным токсикозом. Предложен новый подход оценки степени выраженности эндогенной интоксикации (заявка на изобретение№ 2007146077, приоритет от 11.12.2007) при помощи количественной оценки термостабильной фракции сывороточного альбумина (ТСА). Способ заключается в одномоментном измерении уровня альбумина в одной микропробе кипяченой и некипяченой разбавленной крови методом иммунохимического анализа. Результаты определения ТСА, СА, отношения ТСА/СА и обратного отношения (СА/ТСА×100%) коррелируют с другими лабораторными данными (общий анализ крови; ЛИИ, СМП254) — маркерами интоксикации (r = +0,99 между ССА и МСМ, r = +0,95 между ССА и ЛИИ, r = +0,97 между ЛИИ и МСМ, r = -0,87 между ЛИИ и ОССА, r = -0,94 между ОССА и МСМ, r = -0,96 между ОССА и ССА). Сравнительная характеристика чувствительности различных методов оценки интоксикации в% к контролю предсталена на рис.7.  Рис.7. Сравнительна характеристика чувствительности тестов количественной оценки степени интоксикации в % к контролю (доноры) |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям