Н. Г. Базарнова Редакционный совет

Скачать 3.83 Mb.

Название	Н. Г. Базарнова Редакционный совет
страница	2/54
Дата	24.02.2013
Размер	3.83 Mb.
Тип	Документы

Содержание

1. Особенности строения пероксидаз
Ph. chrysosporium

1 2 3 4 5 6 7 8 9 ... 54

Введение

В настоящее время ведущую роль в окислительной деструкции лигнина отводят ферментам, относящимся к классу оксидоредуктаз, а именно к суперсемейству пероксидаз растений. Изучение данного суперсемейства ферментов ведется сравнительно давно. Первое упоминание о пероксидазах появилось в 1855 г., после того как Шейнбен провел окисление ряда органических соединений разбавленными растворами пероксида водорода в присутствии экстрактов из растений и животных. Однако выделением пероксидаз в сравнительно чистом виде и изучением основных их свойств наиболее полно занимался А.Н. Бах с сотрудниками, в ряде их работ 1903–1904 гг. сообщается о выделении пероксидазы и изучении ее каталитической активности [1].

Несмотря на вековую историю, интерес к изучению и использованию данных ферментов не ослабевает. Они являются достаточно широко используемыми в иммуноферментных анализах; на основе рекомбинантных пероксидаз разрабатываются высокочувствительные биосенсоры для определения различных соединений в сложных многокомпонентных смесях, в том числе и при анализе загрязнений в окружающей среде. В настоящее время они получают все более широкое распространение в исследованиях, связанных с изучением биотрансформации и биодеградации лигнина (одной из проблем целлюлозно-бумажной и лесохимической промышленности). Это одно из самых молодых направлений биотехнологии, получившее свое развитие после того, как удалось выделить данный класс окислительных ферментов, охарактеризовать и подтвердить их окислительную способность (лигнолитическую способность) по отношению к лигниноподобным веществам, устойчивым к действию других классов окислительных ферментов.

Рассматриваемое суперсемейство пероксидаз подразделяется на три класса на основе гомологии аминокислотных последовательностей. Класс I включает микробиальные пероксидазы, бактериальные каталазы – пероксидазы (КФ 1.11.1.6), дрожжевую цитохром С пероксидазу (КФ 1.11.1.5) и аскорбатпероксидазы растений (КФ 1.11.1.11). Класс II – это пероксидазы грибов, включающие лигнинпероксидазу (LiP), марганецпероксидазу (МпР) и секреторные пероксидазы растительного типа. Класс III – это классические пероксидазы растений, такие как пероксидаза хрена (HRP), арахиса и сои. Пероксидазы двух последних классов (КФ 1.11.1.7) гликозилированы, содержат четыре дисульфидные связи и два катиона кальция на молекулу фермента [2, 58]. Большинством авторов [3–8] установлено, что наиболее перспективное применение для процесса окисления лигнина и его модельных соединений имеют следующие пероксидазы: лигнинпероксидаза, марганецпероксидаза и лакказа; в ряде работ [9–13] представлены данные по применению пероксидазы, выделенной из корней хрена. Основной функцией данных ферментов является прямое, как у LiP, или опосредованное медиатором (катионрадикалом у LiP, хелатированными органическими кислотами ионами Мn³⁺ у МnР) одноэлектронное окисление ароматических субстратов до соответствующих радикалов и двухэлектронное восстановление пероксида водорода до воды.
^

1. Особенности строения пероксидаз

Лигнинпероксидаза (LiP) является хорошо изученной пероксидазой грибного происхождения, вместе с другими грибными пероксидазами ее относят к классу II надсемейства пероксидаз. Молекулярная масса ее составляет около 40 кДа. Изоэлектрические точки лежат в области pI = 3,2–4,7.

Она обладает высоким окислительно-восстановительным потенциалом, в результате чего имеет способность окислять не только фенольные, а еще и нефенольные модельные соединения лигнина, ароматические эфиры и полициклические ароматические соединения. Изоферменты Н2 и Н8 имеют очень близкие структуры с единой общей укладкой, принципиально сходной с укладкой пероксидазы хрена (HRP) – типичного представителя класса III растительных пероксидаз. Однако четыре дисульфидных мостика изофермента Н2 (Cys3–Cys15, Cys14–Cys285, Cys34–Cys120, Cys249–Cys317) расположены иначе, чем четыре аналогичных мостика HRP [14]. LiP содержит как соседствующие с гемом, так и отдаленные Са-связывающие сайты, однако в ней отсутствуют дополнительные структурные элементы между α-спиралями F и G, характерные для пероксидаз класса III. Активный центр LiP сходен с закрытой структурой активного центра HRP (так называемый гемовый карман) и отличается от других гемсодержащих белков: глобинов, каталазы, хлоропероксидазы и др., у которых гем экспонирован наружу. Как и у HRP, у изоферментов LiP, по данным разных авторов, ион Fe³⁺ имеет пять [15] или шесть лигандов [16] (рис. 1). Вероятно, различия в трактовке связаны с тем, что в определенных условиях координационное число гемового железа может изменяться. В работе [17] показано, что фермент может переходить из одной формы в другую. При 25 °С высокоспиновое трехвалентное железо в ферменте преимущественно имеет пять лигандов, как у HRP, а при 2 °С и ниже – шесть. Таким образом, LiP так же, как и HRP, имеет вакантную позицию для координации шестого лиганда, расположенную напротив пятого. Спектральное сходство рассматриваемых пероксидаз подтверждается исследованиями [29, 30], данные пероксидазы принадлежат к гемопротеинам с высокоспиновым железом Fe³⁺. Полоса Соре и другие полосы поглощения в видимой области близки для данных ферментов (табл. 1).

Рис. 1. Структура активного центра пероксидазы
Согласно литературным данным [18], предполагается, что для LiP и HRP окисление небольших субстратов происходит на δ-мезосайте гема (атом углерода между метильными группами 1 и 3, обеспечивающий перенос электрона от восстанавливающего субстрата окисленным интермедиатом фермента). Между тем LiP менее способна к модификации мезосайта гема и быстро инактивируется пероксидом водорода, в отличие от HRP. Также было высказано предположение о существовании в молекуле LiP двух различных субстрат-связывающих центров. Прямыми доказательствами этого предположения являются данные рентгеноструктурного анализа нативного фермента, приведенные в работе [19]. Первый (неспецифический) субстрат – связывающий центр – находится на δ-мезосайте гема, а второй (специфический) – вблизи Тrр171, который необходим для окисления классических субстратов данной пероксидазы.

Сходство строения активного центра ферментов, а именно наличие проксимального гистидинового остатка, дистального гистидинового остатка и аргининового остатка, расположенных сходным образом, подтверждаются также с помощью ЯМР-спектроскопии [32].

Таблица 1. Полосы поглощения лигнинпероксидазы (LiP), Mn-зависимой пероксидазы (МnР) из ^ Ph. chrysosporium и пероксидазы хрена (HRP) [31]

Форма фермента	Максимумы полос, нм
Ферри-, высокоспиновая
LiP, pH 4,5	407	500	–	–	632
MnP, pH 4,5	406	502	–	–	632
HRP, pH 6,0	403	500	–	–	641
Ферри-, низкоспиновая
LiP–CN	423	–	540	–	–
MnP–CN	421	–	546	–	–
HRP–CN	422	–	539	–	–
LiP–N₃	418	–	540	575	–
MnP–N₃	417	–	542	580	–
HRP–N₃	416	–	534	565	–
Ферро-
LiP	435	–	–	556	–
MnP	433	–	–	554	–
HRP	437	–	–	556	–
Ферро-СО
LiP–СО	420	–	535	568	–
MnP–СО	423	–	541	570	–
HRP–СО	423	–	541	575	–
LiP ³⁸A H E S I R L V F H D S I A I S P ⁵⁴…¹⁶⁶ E L E L V W M L S A H S V A ¹⁷⁹ MnP ³⁷A H E V I R L T F H D A I A I S R ⁵³…¹⁶³ P F E V V S L L A S H S V A ¹⁷⁶ HRP ³³A A S I L R L HF H D C F VNGC ⁴⁹…¹⁶⁰S S D L V A L S G G H T F G ¹⁷³ а) б)
Рис. 2. Гомология в области активного центра у LiP, MnP, HRP. Идентичные и сходные остатки выделены [33]: а – проксимальный гистидин; б – дистальный гистидин

В настоящее время сложилось мнение, что субстраты классических пероксидаз растений можно разбить на три группы.

К первой относят двухэлектронные доноры электронов, для которых главным является связывание вблизи активного центра (у плоскости гема, иодит-ион) или даже проникновение внутрь активного центра.

Вторая группа представляет собой достаточно простые одноэлектронные ароматические субстраты, которые (как это было показано для феруловой кислоты) связываются вблизи активного центра HRP.

Третья группа – это субстраты, окисляющиеся по цепи переноса электронов.

В случае первой группы субстратов, механизм их окисления включает перенос феррильного кислорода на субстрат, для которого необходимо прямое взаимодействие субстрата с феррильным кислородом. Субстраты второй группы связываются вблизи активного центра фермента. В третьей группе субстратов, если предполагать отсутствие специфических взаимодействий субстрата с активным центром, субстратная специфичность определяется редокс-потенциалами субстратов и окисленных форм фермента и их стабильностью, так как каталитический процесс представляет собой окислительно-восстановительную реакцию. Это мнение основано на данных Данфорда о возрастании констант скорости восстановления окисленных форм фермента с ростом восстановительного потенциала в ряду замещенных аминов и фенолов [20–22].

В отличие от LiP и HRP марганецпероксидаза (МnР) не способна окислять наиболее устойчивые нефенольные подструктуры лигнина. Активность МnР полностью зависит от наличия Мn²⁺, который окисляется ферментом до Мn³⁺. Поэтому механизм действия МnР заключается в образовании сильного окислителя – Мn³⁺, который далее, независимо от фермента, окисляет различные соединения, т.е. служит в этой реакции редокс-медиатором. В настоящее время МnР найдена у нескольких десятков видов базидомицетов. Ее молекулярная масса составляет около 45 кДа, изоэлектрическая точка лежит в области pI = 3–4, содержание сахаров 10–17% [23]. Однако в литературе описаны некоторые истинные МnР, способные к марганецнезависимому окислению [24]. Так, МnР Ceriporiopsis subvermispora непосредственно окисляет некоторые ароматические амины, однако для окисления гваякола присутствие марганца необходимо. Структура МnР сходна со структурой HRP, LiP и других пероксидаз грибов и растений. Однако уникальной характеристикой фермента является марганецсвязывающий сайт. Сайт связывания Мn²⁺ в МnР впервые предсказан на основании гомологии фермента и LiP, а затем изучен рентгенографически в ферменте, закристаллизованном в присутствии Мn²⁺. Сайт его связывания расположен на поверхности белка и свободно доступен из раствора. Никаких других сайтов прочного продуктивного связывания Мn²⁺ в МnР не обнаружено, хотя ранее считалось, что сайт связывания марганца близок к δ-мезосайту гема в LiP и HRP (в нативном ферменте Мn²⁺ окружен четырьмя карбоксильными группами, одна из которых образует ионную пару с соседним остатком Argl77) [25]. Поэтому при окислении олигомерных фенольных моделей лигнина МnР гораздо менее реакционноспособна, чем LiP и HRP. Важным моментом является чувствительность ферментов к избытку пероксида водорода: LiP наиболее чувствительна к инактивации избытком пероксида водорода (инактивация наблюдается уже при 25-кратном его избытке), МnР менее чувствительна (требует 250-кратного избытка пероксида водорода), а наименее чувствительна HRP (выдерживает более чем 500-кратный избыток пероксида водорода), что характеризует последнюю как наиболее стабильную форму. Данный факт связан с повышением рН-оптимума этих ферментов (LiP – 3,0; МnР – 4,5; HRP – 6,0) [26].

Еще один фермент, относящийся к классу грибных пероксидаз (группа медьсодержащих оксидаз), – лакказа. Данный фермент один из немногих, исследуемых с конца XIX в. Все растительные лакказы являются мономерными белками с молекулярной массой 90–130 кДа и изоэлектрической точкой, находящейся в области pI = 3,0–5,1, и высоким содержанием углеводов 22–45%.[27]. До настоящего времени все функции лакказ не определены. Считается, что в растениях лакказы участвуют в синтезе лигнина, катализируя реакцию полимеризации структурных единиц лигнина, которая протекает по свободно-радикальному механизму. Основными физиологическими функциями грибных лакказ считается участие в процессах деградации лигнина, развития и морфогенеза грибов, в патогенезе и детоксикации. Однако лакказы не обладают специфичностью по отношению к субстрату-донору и способны катализировать окисление широкого круга неорганических и органических соединений. Таким образом, субстратами лакказы являются органические ароматические соединения, многие из которых представляют собой фенольные подструктуры лигнина. Разрушение нефенольных подструктур лигнина определяется редокс-потенциалом Т1 центра фермента (редокс-потенциал лакказ не превышает 800 мВ, в то время как потенциалы ионизации большинства нефенольных подструктур лигнина весьма высоки, более 1,4 В) [28].

Таким образом, особенности строения вышеприведенных пероксидаз, обуславливающие их субстратную специфичность по отношению к лигнинным соединениям, достаточно хорошо изучены; данные пероксидазы имеют схожее строение активного центра, однако наиболее широкое применение в процессе окисления лигнина нашли грибные пероксидазы: МпР, LiP, лакказа. Что же касается пероксидазы хрена, то ее использование ограничено небольшим кругом исследований в области окисления простых мономерных фенольных структур. При этом, с точки зрения практического применения, необходимо отметить ее высокую стабильность и более высокий рабочий рН-оптимум, в отличие от грибных пероксидаз. Отмеченные факты дают возможность предположить перспективность использования фермента – пероксидазы хрена, как катализатора процессов биодеградации лигнина.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 ... 54

плохо

не очень плохо

средне

хорошо

отлично

Ваша оценка этого документа будет первой.

Ваша оценка:

	А. Б. Мулик Редакционный совет Физиология адаптации: Материалы 1-й Всероссийской научно-практической конференции, г. Волгоград,...		Совет
	Севастопольский городской совет		Экономический и Социальный Совет
	Экономический и Социальный Совет		2 Совет, консультация по просьбе пациента 3,00
	Нарвинский сельский совет депутатов		Научный совет по медицинским проблемам питания
	Улан-удэнский городской совет депутатов		Совет судей российской федерации постановление

Н. Г. Базарнова Редакционный совет

Введение

1. Особенности строения пероксидаз

Похожие: