Н. Г. Базарнова Редакционный совет
|
|
Скачать 3.83 Mb.
|
^
Научно-технологический комплекс «Фан ва тараккиёт», Ташкентский государственный технический университет, ул. М. Голиб, 7а, Ташкент, 100174 (Узбекистан) E-mail: [email protected]В статье обсуждены принципы проведения анализа и исследования молекулярно-массовых характеристик водорастворимых полисахаридов методом эксклюзионной хроматографии. Рассмотрен сравнительный анализ хроматографических свойств сорбентов и подвижных фаз в исследовании водорастворимых полисахаридов различной природы (нейтральной, кислой и основной). Для устранения влияния агрегированных макромолекул полисахаридов на процесс эксклюзионной хроматографии предложен альтернативный метод – асимметричное фракционирование течением под влиянием поля. ^ стерическая эсклюзионная хроматография, полисахариды, электростатические и полиэлектролитные эффекты, неподвижная фаза, подвижная фаза, детектор многоуглового рассеяния лазерного света, вискозиметрия, молекулярно-массовое распределение. ^ Водорастворимые полимеры синтетического и природного происхождения находят широкое применение при производстве материалов различного назначения, используемых в химической, текстильной, фармацевтической, пищевой, косметической промышленности, сельском хозяйстве, медицине и ветеринарии [1–7]. Среди синтетических водорастворимых полимеров, в основном, используются поливинилпирролидон, поливиниловый спирт, полиакриловая и полиметакриловая кислоты [1]. К водорастворимым производным полимеров природного происхождения относятся эфиры целлюлозы и хитозан. Простые эфиры целлюлозы, например, Na-карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ), Na-сульфат целлюлоза, обладают эмульгирующими, стабилизирующими, загущающими, клеящими, пленкообразующими свойствами и поэтому они играют важную роль в нефтяной, текстильной, пищевой, фармацевтической, косметической отраслях промышленности [2–4]. Уникальные свойства хитозана, включающие высокую биосовместимость и адгезию, а также возможности химической модификации, послужили серьезным основанием к его основному применению в биомедицине. Кроме того, он является перспективным материалом для создания композиционных полимерных пленок, волокон, ионообменников и т.д. [5–7]. Для воспроизводимого регулирования свойств водорастворимых полимеров, помимо химической структуры и степени замещения, к их важным характеристикам следует отнести молекулярно-массовое распределение (ММР), молекулярную массу (ММ) и зависящий от термодинамического качества растворителя радиус вращения. Средние ММ фракций обычно определяют вискозиметрическим или каким-либо другим методом, а для фракционирования из множества существующих методов наиболее эффективным зарекомендовала себя стерическая эксклюзионная хроматография (СЭХ) [8, 9]. Помимо фракционирования полимеров, этот метод является наиболее эффективным при изучении структурных изменений, происходящих в макромолекулах в процессах окисления [10, 11] и гидролиза [12–16], определении ММР при контроле чистоты полисахаридов, предназначенных для приготовления лекарств [17] и т.д. На основе разделения метода СЭХ лежит молекулярно-ситовый механизм, согласно которому макромолекулы, продвигаясь вдоль хроматографической колонки, разделяются в соответствии с их гидродинамическими размерами. Это условие строго соблюдается, когда полностью отсутствуют энтальпийные взаимодействия между ионогенными группами полимера и поверхностью сорбента. СЭХ гидрофильных полимеров имеет свои особенности. Это связано с тем, что многие гидрофильные полимеры являются полиэлектролитами и при их хроматографировании наблюдаются побочные эффекты, нарушающие механизм разделения СЭХ. ^ Сущность метода СЭХ состоит в разделении высокомолекулярных соединений по размерам макромолекул в колонках, заполненных пористыми сорбентами, часто называемыми гелями, с широким диапазоном диаметра пор, а именно, в среднем от 8 до 500 нм. К достоинствам СЭХ относятся: использование небольших количеств исследуемого образца (в пределах мг), широкий интервал ММР (103–107 г/моль) и кратковременность анализа [18]. Разделение при СЭХ достигается на основе гидродинамического объема индивидуальных макромолекул и благодаря тому, что поры гелей проницаемы только для молекул определенных размеров. При прохождении раствора полимера через колонку, макромолекулы полимера проникают в те поры геля, которые доступны им по размеру. Небольшие по размеру макромолекулы проникают наиболее глубоко в поры геля и удерживаются в колонке более длительное время, чем более крупные макромолекулы. Макромолекулы с размерами, превышающими размеры наибольших пор, не удерживаются в колонке и элюируются первыми (рис. 1).
Объём элюирования VR макромолекул в СЭХ определяется из выражения: VR = Vo + Kd Vp, где Vo – свободный или межчастичный объем колонки; Vp – объем пор сорбента; Kd – коэффициент распределения. Общий объем СЭХ колонки определяется как Vo+Vp+Vматрицы, где Vматрицы – объем матрицы сорбента. Кd зависит от гидродинамического объема макромолекул и колеблется от нуля (молекулярный размер больше, чем самый большой размер пор) до единицы (размер молекул меньше размера самых маленьких пор): 0 ≤ Kd ≤ I. На результаты СЭХ могут иметь влияние, например, адсорбция, ионная эксклюзия или деформация молекул из-за сил растяжения потока. Если растворы полисахарида содержат их агрегаты или ассоциаты, это может затруднить и даже сделать полностью невозможным процесс эксклюзионной хроматографии. В таком случае колонка действует как фильтр, который препятствует прохождению агрегата [18]. ^ В качестве наполнительного материала колонок для СЭХ водорастворимых полисахаридов нашли применение жесткие носители: пористое стекло (биоглас), пористый силикагель (порасил), а также полужесткие и мягкие носители: сшитые сополимеры стирола и дивинилбензола (стирогель), поливинилацетатные, полиакриламидные и декстрановые (сефадекс) гели [9]. Ниже приводятся примеры, использующихся в последнее время, различных гелей. Так, например, в пористом силикагеле по эксклюзионному механизму выполнено разделение водных растворов декстранов Т-10, Т-20, Т-40, Т-70, Т-110, Т-161, Т-250, Т-500 [19]. Shodex ОН Pak KB 806 был применен для изучения ММР пуллулана с использованием в качестве подвижной фазы 0,05 н водного раствора NaH2PO4 при pH 4.95 [20]. ММР хитозана получено на высокосшитом полидивинилбензоле, используя в качестве элюента 4%-ный водный раствор уксусной кислоты [21]. Жесткий гель Jordi GBR (полидивинилбензол с привитой глюкозой) был использован при СЭХ декстранов с водной и водно-диметилсульфоксидной подвижными фазами [22]. Все еще используются сшитые декстрановые гели – сефадекс G-50 и G -100 [17], а также Superose 12 HR 10 [14]. Существенным недостатком декстрановых гелей является деструкция углеводной матрицы, обусловливающая появление пиков, не соответствующих разделяемым веществам [9]. В последнее время для исследования ММР водорастворимых эфиров целлюлозы широко используются TSK GM PW (Toya Soda, Япония) [23], PL Aquagel OH (Polymer Laboratories, Англия) [24] и PSS Suprema (Polymer Standard Service, Германия) [25]. ^ Для СЭХ используются жидкостные хроматографы различных фирм-производителей (Хьюлет-Паккард, Дюпон, Бекман, Вариан, Шимадзу, Алтекс и др.), которые выпускают, помимо самих приборов, комплектующие части к ним, насосы, детекторы, упакованные сорбентом колонки, инжекторы, фильтры и др. Исходя из поставленных задач, для хроматографического исследования выбирается подходящий хроматограф и укомплектовывают его соответствующими колонками и чувствительными детекторами [18]. В связи с низкой концентрацией вводимого образца полимера к чувствительности детекторов предъявляются особые требования. В СЭХ применяют следующие типы детекторов: дифференциальные рефрактометры [21, 22], фотометр многоуглового лазерного светорассеяния (ФМЛС) [10–12, 26–28], реже используют УФ детекторы [8, 9]. Дифференциальные рефрактометры измеряют непосредственно отклонение светового пучка, обусловленное различием в показателях преломления образца и эталонной жидкости. С его помощью можно определить небольшие изменения показателя преломления. Показатель преломления ∆n пропорционален изменению плотности ∆ρ (при концентрации полимера ∆с) раствора. Недостаток рефрактометрических детекторов – высокая чувствительность к изменениям температуры. Повышение температуры вызывает увеличение уровня шумов [8]. При малоугловом лазерном рассеянии света измерения проводят в интервале углов 2–10°. Поскольку объем рассеяния света геометрически определен, получаемые значения Мw представляют собой абсолютные величины. Достоинством такого детектора является то, что проблема осветления раствора образца для исследования сводится к минимуму, что связано с очень маленьким объемом (0,1 мкл) рассеивания. Кроме того, этот метод детектирования не сопряжен с деструкцией полимеров; обеспечивает возможность абсолютной калибровки при определении ММ; высокая чувствительность позволяет исследовать небольшие объемы разбавленных растворов образцов; конструкция измерительной кюветы позволяет исключить фоновое рассеяние; длинноволновый лазерный излучатель дает возможность исключить флуоресценцию. Поэтому этот метод детектирования нашел широкое применение в СЭХ водорастворимых полисахаридов для определения ММ, радиуса вращения и ММР [10–12, 26–29]. Недостатком детектора малоуглового лазерного светорассеяния является то, что СЭХ более низкомолекулярных фракций невоспроизводима и эта проблема увеличивается из-за более низкой интенсивности сканирования света [18, 26]. С помощью ФМЛС и рефрактометрического детектора в СЭХ можно определить абсолютные значения молекулярных масс исследуемых полимеров и не требуется провести калибровки колонок с полимерными стандартами [12, 18, 30, 31]. Используя такой хроматограф, авторы работы [28, 32, 33] для водорастворимых простых эфиров целлюлозы определили ММР, ММ и RG. При проведении СЭХ метилгидроксиэтилцеллюлозы (МГЦ) [28] элюент дегазировали с использованием дегазатора ERK 3315а. Пробы вводили через автоматизированный узел ввода НР серии 1100 (Хьюлетт Паккард). Непосредственно перед колонками установлен поликарбонатный фильтр с размерами пор 0,8 мкм (Nucleopore, Cornino Costar Bodenheim). Для фракционирования МГЦ использованы четыре TSK PW XL колонки, установленные в порядке уменьшения размеров пор (TSK G 6000 PW XL, G 5000 PW XL, G 4000 PW XL и G 3000 PW XL). Колоночный термостат служит для поддержки постоянной температуры 25 °С в эксклюзионных колонках. Детекторами служили ФМЛС и дифференциальный рефрактометр. Измеренные данные вносятся в стандартный персональный компьютер (ПК) с программой ASTRA 2.11в и просчитывается в версии ASTRA для Windows 4.73.04. Диаграмма элюирования раствора образца МГЦ с мономодальной кривой для концентрационного (рефрактометрического) (сплошная линия) и светорассеянного (пунктирная линия) сигналов показана на рисунке 3. На графике приведены также кривая для ММ (абсцисса слева) и радиус вращения в интервале от 100 до 30 нм (абсцисса справа). Отсюда определены средневесовая ММ Мw = 318 000 г/моль и средний радиус вращения RG= 67 нм [28]. В ФМЛС светорассеивающая кювета дает возможность on-line детектирования (т.е. «в темпе поступления информации») полимерных молекул в потоке элюента. Информация по ММ здесь может быть получена непосредственно как функция интенсивности рассеяния. Использование ФМЛС имеет то преимущество, что информация о радиусе вращения (RG) молекул больше, чем λ/20 может быть получена на угловой зависимости рассеяния света [18]:
где K = 4 π2 no2 (dn/dc)2/NAλ4, Rj = Ij h2/IoVs. Интенсивность рассеяния света при угле j, Ij вносится как понижающий параметр Rj, который нормализует до интенсивности падающего излучения Io и расстояние от детектора h, от рассеивающего объема Vs. Интенсивность рассеянного света зависит от ММ и от радиуса вращения RG. Необходимо учитывать, что определение функции распределения производных целлюлозы при сочетании рефрактометрического детектора с ФМЛС возможно лишь в случае изолированных клубков в системах растворителей, которые не формируют агрегаты, а образуют дисперсии.
|
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
 |
А. Б. Мулик Редакционный совет Физиология адаптации: Материалы 1-й Всероссийской научно-практической конференции, г. Волгоград,... |
|
Совет |
|
Севастопольский городской совет |
|
Экономический и Социальный Совет |
|
Экономический и Социальный Совет |
|
2 Совет, консультация по просьбе пациента 3,00 |
|
Нарвинский сельский совет депутатов |
|
Научный совет по медицинским проблемам питания |
|
Улан-удэнский городской совет депутатов |
|
Совет судей российской федерации постановление |
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям