Н. Г. Базарнова Редакционный совет

Скачать 3.83 Mb.

Название	Н. Г. Базарнова Редакционный совет
страница	3/54
Дата	24.02.2013
Размер	3.83 Mb.
Тип	Документы

Содержание

2. Обобщенная схема пероксидазного окисления субстратов
3. Механизм пероксидазного окисления лигнина и родственных ему соединений

1 2 3 4 5 6 7 8 9 ... 54

2. Обобщенная схема пероксидазного окисления субстратов

Рассмотрим каталитический цикл окисления субстратов пероксидаз. Как было отмечено выше, сходство строения активного центра рассматриваемых грибных (LiP, MnP, лакказа) и растительных пероксидаз (HRP) дает основание предположить однотипность протекания процесса окисления ими ароматических субстратов различной природы.

Согласно литературным данным, рассмотренные выше ферменты катализируют окисление различных электрон–донорных субстратов пероксидом водорода. Механизм их пероксидазного окисления является трехстадийным, включающим образование двух промежуточных соединений (рис. 3) [8].

Каталитический цикл гемсодержащих пероксидаз включает следующие этапы:

1. Ферри-фермент подвергается двухэлектронному окислению пероксидом водорода, превращаясь в так называемое «Соединение 1»;

2. «Соединение 1» производит одноэлектронное окисление субстрата, восстанавливаясь в форму, называемую «Соединением 2»;

Рис. 3. Схема пероксидазного окисления субстрата (S), образующего катионрадикал

3. «Соединение 2» производит еще одно одноэлектронное окисление субстрата, восстанавливаясь в исходный ферри-фермент (табл. 2).

В соответствии с вышесказанным, процесс окисления лигнина и родственных ему соединений включает следующие элементарные стадии:

1) окисление фермента пероксидом водорода;

2) одноэлектронное окисление субстрата окисленными формами фермента с образованием субстратного катион-радикала;

3) депротонирование и/или фрагментация катион-радикала, приводящие к дочерним радикалам;

4) одноэлектронное окисление дочерних радикалов окисленными формами фермента;

5) окисление дочерних радикалов кислородом с промежуточным образованием гидроперекисей.

Подтверждением корректности применения представленной схемы пероксидазного окисления по отношению к модельным соединениям и препаратам лигнина могут служить данные следующих исследований.

Так, проведенный в работах [36, 37] анализ стационарной кинетики пероксидазного окисления вератрилового спирта показал, что данная реакция протекает по обычному для пероксидаз «пинг-понг» механизму, согласно которому реакция фермента с одним из субстратов (Н₂О₂) приводит к образованию окисленной формы фермента, которая в свою очередь, взаимодействует со вторым субстратом (вератриловым спиртом). Стехиометрия окисления в данном случае 1± 0,05 моль Н₂О₂ на 1 моль вератрилового спирта.

При окислении фенил-гваякола, а также фенольных олигомеров с β-О-4-связью (ди-, три-, и тетрамера) соединение LiP I существенно активнее соединения 2. Константы скоростей окисления этих субстратов соединением LiP I в ряду ди-, три-, и тетрамера снижаются от 12 до 3,6 ·10⁵ M^–1с^–1. Значения констант для соединений 2 тоже снижаются с увеличением размера субстрата. Однако диапазон изменения констант окисления олигомеров не превышает трех-четырех раз, что позволяет сделать предположение о несущественной роли длины субстрата в непосредственном окислении лигнина. Для стационарной реакции значения K_m и k_kat составляют 0,16 мМ и 7,7 с^–1 (в литературе представлены данные по активности пероксидазы хрена в отношении гваякола: для стационарной реакции значение К_m составляет 0,27 мМ) [45].

При окислении олигомерных фенольных моделей лигнина соединение 1 Мn-пероксидазы значительно реакционноспособнее соединения 2, но гораздо менее реакционноспособно, чем LiP I. Константы скоростей окисления этих субстратов MnPI варьируют от 1·10⁵ для гваяцильного димера до 1,1 ·10³ M^-1c^-1 для тетрамера. МnРII обладает незначительной активностью к этим субстратам [40].

Таким образом, окисление субстратов различными пероксидазами осуществляется однотипно, с образованием промежуточных соединений 1 и 2, однако в силу структурных особенностей и свойств данных ферментов, эти соединения образуются с различной скоростью, характеризующей полноту протекания процесса окисления.

Далее проанализируем механизм каталитических редокс-превращений лигнинных соединений в условиях пероксидазного окисления.

Таблица 2. Полосы поглощения в спектрах окисленных форм LiP [34] и HRP [35]

Фермент	Максимумы, нм
Фермент	Соединение 1	Соединение 2
LiP	408, 550, 608, 650	420, 525, 556
HRP	400, 557, 662, 650	420, 527, 554

3. Механизм пероксидазного окисления лигнина и родственных ему соединений

Согласно представленному выше механизму пероксидазного окисления различных субстратов их превращение начинается с одноэлектронного окисления, приводящего к образованию катион-радикала. Поэтому при рассмотрении химических аспектов пероксидазного окисления лигнина основным является вопрос о трансформации образующихся катион-радикалов лигнина и родственных ему соединений. На рисунке 4 представлены наиболее типичные примеры превращений синтетических моделей лигнина, окисляемых пероксидом водорода в присутствии лигнинпероксидазы.

Основная часть этих реакций (1–3) интерпретируется на основе схемы, предложенной Шумейкером для описания превращений катион-радикалов фенилкарбинолов (1) (рис. 5).

Такие катион-радикалы (2) либо отщепляют протон и подвергаются повторному одноэлектронному окислению в кетоны или альдегиды (3) (путь А), либо распадаются на фрагменты с разрывом С^α–С^β связи (путь В). Один из этих фрагментов представляет собой катион (4), теряющий далее протон и превращающийся в нейтральную молекулу (5), а другой – радикал (6), который окисляется ферментом или атмосферным кислородом. Соотношение этих альтернативных путей зависит от прочности С^α–С^β связи в первичном катион-радикале. У первичных фенилкарбинолов (в частности, у вератрилового спирта) оба пути совпадают.

Для окислительно-гидролитического деметилирования (реакция 4, рис. 4) ключевой стадией, по-видимому, является атака воды на катион-радикал. Об участии воды в этой реакции свидетельствует включение кислородной метки в хинон при проведении реакции в среде Н₂¹⁸O [38]. Последняя реакция (реакция 5, рис. 4), представляет собой окислительное сочетание фенолов при их окислении пероксидом водорода, которое катализируется многими пероксидазами.

Наличие большого объема исследований в данной области все же не дает полного понимания о механизме действия ферментов на сам лигнин. LiP, MnP и лакказы считаются ключевыми ферментами в окислении фенольных и нефенольных структур лигнина до катионрадикалов, подвергающихся затем серии неферментативных реакций, включающих расщепление С–С и С–О-связей и фрагментацию трехмерной сетки лигнина. Существует несколько мнений о действии ферментов на лигнин. Некоторые исследователи утверждают [8], что деполимеризация лигниновой матрицы и других высокомолекулярных субстратов опосредуется низкомолекулярным деметоксифенильным медиатором типа вератрола, образующим под действием фермента стабильную катионрадикальную частицу.


Рис. 4. Примеры превращений лигниноподобных соединений при лигниназном окислении

Рис. 5. Пероксидазное окисление арилкарбинолов [39]

Другие исследователи придерживаются иной точки зрения, что фермент способен непосредственно действовать на лигнин [40]. Известно, что окислительная деполимеризация ферментами модельных димеров лигнина с разными типами связей (рис. 6) не требует участия медиатора.

Далее рассмотрим более детально, как протекает пероксидазное окисление некоторых соединений, представляющих собой модели лигнина. В процессе окисления гваяцильных структур лигнина со свободной реакционной ОН-группой наблюдается инактивация фермента данными субстратами. Образующиеся при окислении данных фенольных субстратов феноксирадикалы не могут участвовать в реакциях переноса заряда, а в отсутствие катионрадикалов становится возможной реакция соединения II с пероксидом водорода с образованием неактивного соединения III [45].

Типичный пример данного явления – окисление фенольного субстрата феруловой (4-окси-3-метоксикоричной) кислотой. В ходе ее окисления наблюдается инактивация фермента по двум возможным путям. Первый – пероксид зависимая инактивация, вызванная накоплением соединения III даже при относительно низких концентрациях пероксида. Второй механизм инактивации включает взаимодействие феноксирадикалов или продуктов окисления феруловой кислоты с ферментом [47]. Так, в результате пероксидазного окисления феруловой кислоты пероксидом водорода наблюдается образование димеров и тримеров с последующей их дальнейшей полимеризацией (рис. 7) [48].

Данное явление наблюдается и для эвгенола, при окислении его пероксидом водорода в присутствии пероксидазы хрена (рис. 8) [49].

Гваякол (2-метоксифенол) также хорошо окисляется и соединением I и соединением II фермента, с образованием димера (рис. 9) [46]. Согласно представленной схеме, явление дальнейшей полимеризации не наблюдается, что объясняется строением данного соединения, а именно отсутствием заместителя в п-положении.

Данное предположение подтверждают работы [53, 54], в которых исследуется лигнинпероксидазное окисление препаратов лигнина, предварительно подвергнутых исчерпывающему метилированию. Этот процесс приводит не к конденсации, а к тем же низкомолекулярным продуктам деградации, что и окисление моделей лигнина.

Рис. 6. Модельные нефенольные димеры лигнина с разными типами связей: β-1 (1), β-О-4 (2) и β-5 (3)

Рис. 7. Образование димерных и тримерных структур в результате пероксидазного окисления феруловой кислоты пероксидом водорода

Рис. 8. Предполагаемая полимеризация структур, полученных в ходе пероксидазного окисления эвгенола пероксидом водорода

Рис. 9. Образования окрашенного продукта 3,3-диметокси-4,4-дибензохинона в ходе реакции пероксидазного окисления гваякола пероксидом водорода

Несколько иной характер носит ферментативное окисление диметоксилированных ароматических соединений. Так, 1,2,4,5-тетраметоксибензол окисляется пероксидом водорода в присутствии всех вышерассмотренных ферментов через катоионрадикал до 2,5-диметокси-п- и 4,5-диметокси-о-бензохинона в соотношении 4 : 1 с выделением двух молей метанола на моль субстрата. При этом в случае пероксидазы хинонные атомы кислорода заимствуются из молекул воды, т.е. происходит отщепление метоксильной группы как целого. Вообще, катионрадикалы являются короткоживущими промежуточными продуктами при окислении ди- и тетраметоксибензолов и их производных. Их образование включает как ферментативные так и целый ряд последовательных неферментативных стадий. Примером в данном случае может служить окисление 3,4-диметоксибензилового спирта (вератрола) до вератрового альдегида. В процессе окисления затрагивается не ароматическое кольцо, а, в основном, боковая цепь. Образующийся катионрадикал подвергается неферментативным превращениям в результате нуклеофильной атаки молекулой воды: происходит отщепление протона с образованием бензильного радикала (рис. 10) [44].

В аэробных условиях этот радикал может присоединять молекулу кислорода, образуя при этом оксибензилпероксирадикал. Разложение последнего дает супероксиданион и вератральдегид (до 83%).

Таким образом, при ферментативном окислении ароматических субстратов кислород отвечает за образование пероксирадикалов, которые могут затем вовлекать в цепные неферментативные реакции новые молекулы субстрата, значительно ускоряя его превращение. Но роль кислорода в данном процессе особенно важна, так как необходимо преодолевать явление рекомбинации углеродных радикалов, образуемых при выбросе протона катионрадикалами – непосредственными продуктами ферментативного окисления.


Рис. 10. Неферментативное превращение катионрадикала вератрола и образование вератральдегида в аэробных условиях

Рис. 11. Димеризация монолигнолов сирингильного типа под действием системы пероксид водорода + пероксидаза хрена

За последнее время активно стали развиваться исследования, направленные на получение «синтетического лигнина» – вещества, сходного по структуре, свойствам и строению с природным лигнином (так называемый дигидрополимер – ДГП). Он образуется при пероксидазном окислении мономерных структур как гваяцильного, так и сирингильного ряда. Примером может служить процесс синтеза лигнина при пероксидазном окислении монолигнола синапового спирта (рис. 11) [50].

ДГП как близкий аналог природного лигнина широко применяется в научных исследованиях, поскольку можно управлять его молекулярной массой и мономерным составом, а также включать в нужные места изотопные метки.

Показано, что данный полимер – аналог елового лигнина – разрушается пероксидазой напрямую, согласно рисунка 12 [41].

В литературе приведены сведения о процессе окисления димерных соединений, принадлежащих к классу β-О-4 моделей, лигнинпероксидазой [51, 52]. Данные модели имитируют наиболее распространенный в лигнинах тип димерных фенилпропановых блоков. В молекуле субстрата, принадлежащего к классу β-О-4 моделей, присутствуют два несопряженных диалкоксифенильных остатка, которые могут окисляться лигнинпероксидазой независимо. Если реакция начинается с одноэлектронного окисления диметоксифенильной части молекулы, происходит либо С^α–С^β -фрагментация первичного катион-радикала, приводящая к вератровому альдегиду (8) и продуктам (9), (10), либо его депротонирование и повторное окисление дочернего радикала в кетон (11) (рис. 13).

Если же реакция начинается с одноэлектронного окисления метоксифеноксильного фрагмента молекулы, то происходит гидролитическое расщепление С-О-связей в катион-радикале (в частности, ведущее к соединению (14)) или внутримолекулярная атака -гидроксильной группы с образованием промежуточного кеталя (15) (рис. 14).

Таким образом, катион-радикалам лигниноподобных веществ свойственно множество превращений. Выбор направления зависит от прочности С^α–С^β -связи (фрагментация), доступности для атаки воды (гидролитическое деметилирование), вероятности одноэлектронного окисления дочернего радикала (образование кетонов и альдегидов без фрагментации), а также вида самого фермента.

Рис. 12. Пероксидазное окисление структуры лигнина с образованием ряда продуктов

Данные схемы наглядно демонстрируют, что природа и положение заместителей определяют распределение электронной и спиновой плотности, пространственные взаимодействия, а значит и ход реакции пероксидазного окисления. Так, для модельных соединений лигнина, имеющих заместителей в п-положении, свойственна полимеризация мономерных структур с образованием димеров и тримеров, что существенно снижает скорость их ферментативного окисления.

Рис. 13. Лигнинпероксидазное окисление модели лигнина типа β-О-4 в аэробных условиях. Основные реакции с разрывом С–С связей

Рис. 14. Лигнинпероксидазное окисление модели лигнина типа β-О-4 в аэробных условиях. Основные реакции с разрывом С–О связей

1 2 3 4 5 6 7 8 9 ... 54

плохо

не очень плохо

средне

хорошо

отлично

Ваша оценка этого документа будет первой.

Ваша оценка:

	А. Б. Мулик Редакционный совет Физиология адаптации: Материалы 1-й Всероссийской научно-практической конференции, г. Волгоград,...		Совет
	Севастопольский городской совет		Экономический и Социальный Совет
	Экономический и Социальный Совет		2 Совет, консультация по просьбе пациента 3,00
	Нарвинский сельский совет депутатов		Научный совет по медицинским проблемам питания
	Улан-удэнский городской совет депутатов		Совет судей российской федерации постановление

Н. Г. Базарнова Редакционный совет

2. Обобщенная схема пероксидазного окисления субстратов

3. Механизм пероксидазного окисления лигнина и родственных ему соединений

Похожие: