Методические указания к лабораторным занятиям для студентов агрономического и агроэкологического факультетов
|
|
Скачать 0.82 Mb.
|
|
МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ  ГЛАВНОЕ УПРАВЛЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ, НАУКИ И КАДРОВ УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ «БЕЛОРУССКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ» |
© Составление О.С. Кильчевская, 2005 © Учреждение образования «Белорусская государственная сельскохозяйственная академия», 2005 |
^
В помещении микробиологической лаборатории должны строго соблюдаться порядок и чистота.
Находиться в лаборатории необходимо без верхней одежды и, по возможности, в белых халатах.
Приступая к лабораторным занятиям, студенты занимают постоянные места за учебными столами.
Рабочее место должно быть оборудовано всем необходимым для выполнения работы.
Студенты пользуются закреплёнными за ними микроскопами на протяжении всего курса и несут за них ответственность.
На рабочем столе не должно быть никаких лишних предметов.
Пред началом работы студенты заранее знакомятся с заданием.
Записи наблюдений и зарисовки в рабочих тетрадях обязательны.
После окончания работы препараты оставляют в эксикаторе, металлические предметы (петли, иглы, пинцеты) после употребления стерилизуют в пламени огня, пипетки помещают в стакан с дезинфицирующей жидкостью.
В лаборатории должны быть полотенце и мыло, чтобы после выполнения работ студенты мыли руки.
После окончания занятий рабочее место должно быть приведено в порядок.
При работе в газифицированных лабораториях студенты должны быть ознакомлены с правилами работы с газом и заполнить контрольный лист по технике безопасности.
^ : коробочка с предметными стёклами, корковые пробки, бактериологические петли, газовые горелки или спиртовки, спички, штатив с красками и иммерсионным маслом, ёмкость с водой и приспособлением для её слива, книжка из фильтровальной бумаги, эксикатор, микроскопы с хлопчато-бумажными тряпочками для протирания объективов.
^
Препарат-мазок. Для исследования микроорганизмов обычно используют фиксированные и окрашенные препараты, которые готовят следующим образом:
1. Обезжиривают предметное стекло. Для этого на него наносят каплю воды и растирают её корковой пробкой. Можно использовать для этой цели реактивы (спирт, эфир и т.д.).
2. Обеззараживают бактериологическую петлю – прокаливают её в пламени и дают остыть.
3. Берут подготовленной петлей микробный материал (из жидкой культуры или из колонии микробов на поверхности твердой питательной среды) и делают мазок – размазывают тонким слоем по стеклу, после чего петлю сразу прокаливают.
4. Высушивают мазок на воздухе или держат стекло высоко над пламенем, но не допуская закипания материала.
5. Фиксируют высушенный мазок, проводя стекло тыльной стороной 3-4 раза в пламени. Можно использовать фиксатор. Микробы при этом погибают и закрепляются на стекле.
6. Окрашивают препарат, нанося на него несколько капель красителя. Окраска кристаллвиолетом, например, производится в течение 30-60 с. При простом способе окраски используют один краситель, и весь материал получают одноцветным. При сложных способах окраски применяют несколько красок и реактивов. Это позволяет выявить строение клеток бактерий, так как различия в химическом составе частей клетки обеспечивают неодинаковые отношения к разным красителям и позволяют получить разноцветную картинку. К сложным способам окраски относятся окраска по Граму, капсул, спор, волютина.
7. Окрашенный препарат тщательно промывают водой.
8. Просушивают препарат, промакивая его между листами фильтровальной бумаги.
Микроскопирование. На готовый препарат наносят каплю иммерсионного масла. Препарат необходимо положить на столик микроскопа и зажать его двумя клеммами. Установить объектив 8х или 40х и, глядя в окуляр, навести свет, регулируя положение зеркала. Поднять конденсор до упора и открыть диафрагму. Препарат можно осветить, пользуясь настольной лампой или осветителем ОИ-19, а также ОИ-32, устанавливая его вместо зеркала.
При работе с сухими объективами (8× и 40х) между стеклом и линзами объективов находится воздух, в котором, как в среде менее плотной, чем стекло, часть лучей преломляется и рассеивается, не дойдя до объектива.
При рассмотрении препарата с помощью иммерсионной системы пользуются иммерсионными объективами. Иммерсия (от лат. immersion – погружение) означает, что объектив может работать только будучи погруженным в жидкость – масло (масляная иммерсия) или воду (водная иммерсия). При работе с масляной иммерсией часто используют кедровое масло, имеющее коэффициент преломления лучей 1,515, а коэффициент преломления стекла 1,52. Световые лучи при переходе из стекла в слой масла остаются в гомогенной по плотности среде, не преломляются и попадают в объектив. При этом улучшается освещенность и четкость изображения.
В лабораторной практике обычно используют масляную иммерсию. На оправе иммерсионного объектива имеется чёрная круговая нарезка, обозначение МИ – масляная иммерсия и цифра 90 – увеличение 90х. Для микроскопирования с иммерсией объектив погружают в каплю масла до соприкосновения с предметным стеклом. После этого, глядя в окуляр (15х), при помощи макрометрического винта медленно поднимают тубус до появления в поле зрения окрашенных клеток, затем микрометрическим винтом окончательно устанавливают резкость изображения. Таким образом, при работе с масляной иммерсией достигается увеличение 15 90.
Препарат необходимо просмотреть в разных полях зрения для полноты изучения материала, что достигается вращением двух винтов столика микроскопа, приводящих его вместе в препаратом в движение в двух взаимно перпендикулярных направлениях.
После окончания просмотра препарата необходимо макромет-рическим винтом поднять тубус, убрать препарат со столика микроскопа, а линзу иммерсионного объектива протереть мягкой чистой тряпочкой или марлей.
^
Работа 1. Основные формы бактерий
Бактерии – широко распространенные микроорганизмы. Они нахо-дятся в воздухе, почве, воде, на поверхности растений, в кишечнике животных и человека.
Одноклеточные бактерии по форме разделяются на три основные группы – шаровидные, палочковидные и извитые.
Выполнение. Готовят фиксированные и окрашенные кристаллвиолетом (30-60с) препараты-мазки: 1) кокков; 2) палочковидных бактерий; 3) спирилл; 4) зубного налета. Рассматривают с иммерсионной системой микроскопа.
Шаровидные бактерии называются кокками (от гр. kokkos – зерно). Они имеют круглую форму и очень мелкие. В зависимости от характера деления и поведения клеток после деления бывают:
микрококки (от гр. mikros – малый), или монококки (от гр. monos –один) – после деления клетки располагаются по одной;
диплококки (от гр. diploos – двойной) – после деления клетки остаются соединёнными по две;
стрептококки (от гр. streptos – цепочка) – деление происходит последовательно в одной плоскости, образующиеся после деления клетки остаются соединёнными в цепочки;
тетракокки (от гр. tetra – четыре) – деление клетки происходит в двух взаимно перпендикулярных плоскостях с образованием четырёх соединённых клеток;
сарцины (от лат. sarcio – соединяю) – деление клетки идёт последовательно и быстро в трех взаимно перпендикулярных плоскостях с образованием кубиков (пакетиков) из 8 клеток;
стафилококки (от гр. staphyle – виноградная гроздь) – деление клеток происходит беспорядочно в различных направлениях, что приводит к образованию скоплений, напоминающих гроздь винограда;
Палочковидные бактерии по форме напоминают палочку или цилиндр, бывают короткими и длинными, толстыми и тонкими, с краями различной формы. Палочки обычно крупнее кокков. Их подразделяют на бактерии (от гр. bakteria – палочка) – не образующие споры и бациллы ( от лат. bacillum – палочка) – образующие споры. Термин бактерии в узком смысле означает палочковидные, а в широком смысле вообще любые формы. Деление палочек происходит только поперёк, после чего они могут остаться соединёнными попарно (диплобактерии и диплобациллы) или в цепочки (стрептобактерии и стрептобациллы).
Извитые бактерии подразделяются по их извитости на:
вибрионы (фр. vibrion и от лат. vibrare – колебаться, дрожать) – слегка изогнутые клетки, по форме напоминают запятую, искривленность обычно меньше половины окружности;
спириллы (от лат. spirilla – уменьшительное от spira – изгиб) – число завитков от 1 до 6, обычно крупные;
спирохеты (от лат. spira и гр. chaite - волосы ) – тонкие, длинные, с большим количеством завитков.
Зарисовывают в тетради три поля зрения и делают в них рисунки с обозначением всех форм бактерий.
В препарате, приготовленном дополнительно из собственного зубного налета, можно найти разные формы бактерий – шаровидные, палочковидные, извитые (например, спирохеты кариеса) и нитчатые.
^ : выделенные культуры бактерий в пробирках – воздушные кокки, почвенные палочки и навозная жижа со спириллами; кристаллвиолет.
^
В 1884 г. датский ученый Г.Х. Грам предложил метод окраски, который позволил разделить все микроорганизмы на две группы – грамположительные (грам+) и грамотрицательные (грам-). Метод основан на различиях в химическом составе клеточной стенки. У грамположительных форм в состав клеточной стенки входит большое количество гетерополимера пептидогликана (муреина) и он локализуется в наружных слоях оболочки. У этих форм при окраске анилиновым красителем в присутствии йода образуется с муреином стойкое окрашенное соединение, нерастворимое в спирте. У грамотрицательных форм муреина в клеточной стенке нет или очень мало и он локализован в глубинных слоях, поэтому стойкого окрашенного комплекса при окраске по Граму не образуется. Такие клетки легко обесцвечиваются в спирте, их можно затем подкрасить другим красителем.
Окраска по Граму положена в основу систематики бактерий и используется при определении их вида.
Выполнение. Для приготовления препаратов используют микробный материал, состоящий из двух выделенных культур микроорганизмов, смешанных в одной пробирке, одна из которых грамположительная, а другая грамотрицательная. Делают мазок, высушивают, а затем фиксируют его в пламени.
Окраска по Граму заключается в следующем:
1. На фиксированный мазок накладывают бумажку Синёва, пропитанную кристаллвиолетом, добавляют несколько капель воды для извлечения краски и оставляют на 2-3 мин, после чего бумажку удаляют;
2. Наливают на препарат несколько капель раствора Люголя
(KJ +J) на 1-2 мин, а затем жидкость сливают;
3. Опускают предметное стекло в стаканчик со спиртом на время от 3-6 с до 30-60 с (в зависимости от качества спирта) для обесцве-чивания грамотрицательных форм;
4. Тщательно промывают препарат водой;
5. Окрашивают грамотрицательные бактерии фуксином 30-60 с;
6. Промывают водой.
Просушивают фильтровальной бумагой и рассматривают с иммерсионной системой микроскопа.
При просмотре препарата следует обратить внимание на то, что грамположительные формы окрашиваются в фиолетовый цвет кристаллвиолетом, а грамотрицательные – в красный или розовый цвет фуксином.
Грамположительные – хлебные (пекарские) дрожжи – Saccharomyces cerevisiae – клетки крупные и округлые, среди них много почкующихся.
Грамотрицательные – кишечная палочка – Escherichia coli – клетки мелкие и короткие, иногда собраны в цепочки.
Зарисовывают микробы в одном поле зрения цветными карандашами и делают пояснительные подписи.
^ : смесь культуры дрожжей и кишечной палочки, бумажки Синёва, раствор Люголя, водный раствор основного фуксина или фуксин Пфейффера, стаканчики с 96º-ным спиртом, красные и фиолетовые карандаши.
^
Некоторые бактерии способны на наружной поверхности клеточной стенки образовывать слизистое вещество – капсулу, что является видовым признаком. Капсула у бактерий может достигать значительных размеров и имеет определенную форму. Капсула выполняет защитную функцию. Химический состав её у различных бактерий различен. Капсульное вещество очень слабо воспринимает краску, поэтому при простом способе окраски капсула видна в виде слабоокрашенного ореола вокруг микробной клетки. Для обнаружения капсул лучше пользоваться негативными способами окраски, при которых окрашивается фон с контрастно выделяющимися неокрашенными капсулами, обрамляющими бактериальные клетки.
Выполнение. Для просмотра капсул используют культуру бактерий, образующих макрокапсулу.
1. Каплю исследуемого микробного материала наносят на край предметного стекла, добавляют к ней каплю туши и размазывают другим стеклом (можно со шлифованными срезанными краями), держа его под углом 45º, тонким слоем по предметному стеклу;
2. Высушивают на воздухе;
3. Фиксируют в пламени;
4. Окрашивают фуксином 30-60 с;
5. Промывают водой;
Просушивают на воздухе или осторожно фильтровальной бумагой. Рассматривают препарат с иммерсионной системой.
На фоне чёрной туши в препарате отчетливо выделяются розово-малиновые клетки азотобактера (Azotobacter chroococcum), окруженные бесцветными капсулами крупных размеров. Клетки палочковидные или в виде крупных кокков, соединенных попарно и покрытых общей капсулой. Зарисовывают в тетради цветными карандашами и подписывают.
^ : культура азотобактера, стёкла со шлифовальными срезанными краями, свежая неразведенная тушь, водный раствор основного фуксина или фуксин Пфейффера, красные и чёрные карандаши.
^
У бактерий могут образовываться споры, которые обладают высокой устойчивостью к неблагоприятным условиям внешней среды и выполняют защитную функцию. Образуют споры палочковидные бактерии. Палочка со спорой называется бациллой.
Споры покрыты плотной и многослойной оболочкой, содержат мало свободной воды, много липидов и термоустойчивых соединений. Споры кислотоустойчивы и плохо окрашиваются красителями. Для того, чтобы увеличить проницаемость споры, в краситель добавляют протравитель (карболовую кислоту) и окраску производят при нагревании. Спора красится труднее, чем вегетативная часть клетки, но и медленнее обесцвечивается в кислотах. Поэтому, если после окрашивания поместить препарат в серную кислоту на определенное время, можно добиться того, что спора останется окрашенной, а вегетативная часть клетки быстро обесцветится. Затем вегетативную клетку легко можно покрасить в контрастный по цвету краситель, чтобы спора и вегетативная часть клетки были окрашены в разные цвета, тогда расположение спор в клетках будет хорошо различимо.
Выполнение. Для знакомства с особенностями спорообразования у бактерий выделяют культуры трёх видов, которые условно обозначают: спора №1, №2 и №3. Готовят из этого микробного материала препараты-мазки. Мазок фиксируют в пламени дольше обычного (проводят стекло в язычке пламени раз десять), чтобы убить термоустойчивые споры.
Окраска спор заключается в следующем:
1. На фиксированный мазок накладывают кусочек фильтровальной бумаги и обильно смачивают её карболовым фуксином Циля. Препарат подогревают, держа высоко над пламенем, до появления паров, но не доводят до кипения краски на стекле. Когда бумажка подсохнет, подливают новую порцию красителя и опять подогревают. Эту процедуру проводят 3-4 раза, после чего бумажку выбрасывают;
2. Погружают препарат с помощью пинцета в стаканчик с 1 %-ным раствором серной кислоты на несколько секунд для обесцвечивания вегетативной части клетки;
3. Препарат после обработки кислотой тщательно промывают водой;
4. Подкрашивают клетки метиленовым синим 1-2 мин;
5. Промывают водой.
Просушивают препарат фильтровальной бумагой и исследуют под микроскопом с иммерсией.
Споры окрашиваются в розовый цвет фуксином, а вегетативная часть клеток – в голубой цвет метиленовым синим.
Расположение спор в клетке и внешний вид клетки со спорой – видовой признак. Форма спор округлая или овальная. Расположены они могут быть в центре (центральное положение), смещены ближе к одному из концов клетки (промежуточное, или субтерминальное положение) и находиться на одном из её концов (концевое, или терминальное положение).
По внешнему виду клетки со спорой различают следующие спорообразования:
бациллярное - присутствие споры не меняет внешнего вида клетки, т. к. её диаметр не больше диаметра вегетативной части клетки;
клостридиальное – диаметр споры больше диаметра вегетативной части и клетка расширена в месте нахождения споры, при этом клетка имеет вид веретена или лимона;
плектридиальное – спора находится на конце клетки, её диаметр больше диаметра клетки, а вегетативная часть при этом внешнего вида не меняет.
В работе используют следующий микробный материал:
спора 1 – Bacillus mycoides, спорообразование центральное, бациллярное;
спора 2 – Clostridium butyricum или Clostridium pasteurianum, спорообразование субтерминальное, клостридиальное;
спора 3 – Clostridium pectinovorum, спорообразование терминальное, плектридиальное.
Зарисовывают в тетради цветными карандашами бациллы с различным расположением спор и спорообразованием и делают пояснения к рисункам.
^ : культуры споровых форм бактерий в пробирках, фильтровальные бумажки размером 2 3 см, карболовый фуксин Циля, метиленовый синий, стаканчики с 1%-ной H2SO4, пинцеты, красные и синие карандаши.
^
Многие микроорганизмы в определенных условиях образуют запасные вещества в виде гранулярных включений. По химической природе это чаще всего полисахариды, липиды, полифосфаты, белки, а также сера, железо. К включениям микробных клеток относятся волютин, гликоген, гранулёза, жир, сера и др. Клеточные включения выявляются при помощи специальных способов окраски.
Волютин, или метахроматические зёрна (метахроматин) – запасное вещество, состоящее из полифосфатов и веществ, близких к нуклеиновым кислотам. В них сосредоточены запасы органического фосфора. Волютин имет сродство с метиленовой синью, но при окрашивании ею приобретает фиолетово-чёрный цвет. Способность приобретать иной цвет, чем цвет окрашивающего вещества, называется метахромазией. Название «волютин» произошло от Spirillum volutans, в клетках которой он был впервые обнаружен.
Волютин в виде крупных гранул находится в вакуолях дрожжей или цитоплазме бактерий (уксуснокислых, молочнокислых, азотфиксирующих) и актиномицетов.
Выполнение. Окраска волютина производится на культуре дрожжей, из которой готовят фиксированный в пламени препарат-мазок.
Окрашивают уксуснокислым синим 1-2 мин.
Промывают препарат водой.
Окрашивают раствором хризоидина 20-30 с.
Промывают водой.
Просушивают фильтровальной бумагой и исследуют под микроскопом с иммерсией.
Протоплазма дрожжей окрашивается в жёлтый или светло-коричневый цвет, а зерна волютина – в фиолетовый.
Зарисовывают клетки хлебных (пекарских) дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) с волютином в тетради цветными карандашами и делают пояснения.
^ : жидкая культура дрожжей в пробирках, уксуснокислый синий, хризоидин, жёлтый или коричневый и фиолетовый или чёрный карандаши.
^
Актиномицеты, или лучистые грибы (от лат. actis – луч и myces – гриб) занимают промежуточное положение между бактериями и грибами (грибобактерии). В систематике их относят к грамположительным бактериям. Как и бактерии они прокариоты ( не имеют дифференцированного ядра), на питательных средах образуют колонии, подобные бактериальным. Как и грибы они образуют мицелий, хотя гораздо тоньше, и способны размножаться спорами. Мицелий у актиномицетов может быть двух видов: субстратный, или питательный (погружен в питательную среду и выполняет функции питания) и воздушный (находится над питательной средой, на нем формируются споры и он выполняет функцию размножения, придает колонии лучистый вид).
К высшим актиномицетам относят стрептомицеты, проактиномицеты, микромоноспоры, франки. К низшим актиномицетам относят микобактерии и микококки, у которых мицелий в зачаточном состоянии. Актиномицеты широко распространены в почве и придают ей специфический землистый запах.
Стрептомицеты имеют два вида мицелия. Субстратный просматривается в виде тонких разветвлённых нитей, воздушный образует споры.
У проактиномицетов (нокардий) воздушный мицелий отсутствует или слабо развит, а субстратный выполняет функции и питания, и размножения. Он хорошо виден в виде длинных и коротких нитей, которые на определенных стадиях расчленяются на палочковидные фрагменты, в дальнейшем переходящие в палочки, которые затем становятся в спорами, а они потом вновь образуют мицелий.
У микромоноспоры мицелий тоже только субстратный, на гифах которого образуется по одной споре, дающей затем начало новому мицелию.
Актиномицеты выращивают на питательной среде Чапека или крахмало-аммиачном агаре. Колонии актиномицетов обычно некрупные, разноцветные (розовые, жёлтые, коричневые, красные, чёрные, белые), плотные, кожистые, пушистые, тестообразные, срастающиеся с субстратом.
Выполнение. Колонии актиномицетов извлекают со средой с помощью бактериологической петли или препаровальных игл и кладут на обезжиренное предметное стекло. Размазывают петлей или другим стеклом. Фиксируют в пламени. Окрашивают 30-60 с. кристаллвиолетом. Рассматривают с помощью иммерсионной системы микроскопа.
Зарисовывают в тетради стрептомицеты, проактиномицеты, микромоноспоры. Отмечают виды мицелия, споры.
Материалы и оборудование: культуры актиномицетов в чашках Петри, препаровальные иглы, кристаллвиолет.
^
Для наблюдения за движением, питанием, размножением, действием различных веществ на микроорганизмы необходимо исследовать живые клетки. Для этого готовят нефиксированные и неокрашенные препараты двумя способами: «раздавленной» и «висячей» капли.
В живом виде исследуют плесневые грибы, которые образуют налёт (пушок) на поверхности различных субстратов, например хлеба. Плесени состоят из разветвлённых гифов, составляющих мицелий. Они достаточно крупные, чтобы их можно было рассматривать даже при малом увеличении, кроме того, плохо красятся.
Выполнение. 1. Готовят препарат «висячая капля» из навозной жижи. Для приготовления этого препарата необходимо предметное стекло с углублением (лункой) в центре. Каплю жидкой культуры наносят на покровное стекло, смазывают его края вазелином, накрывают предметным стеклом выемкой вниз, чтобы она накрывала каплю. Благодаря вазелину предметное и покровное стекла склеиваются. Переворачивают препарат, чтобы капля свободно свисала в углублении, не касаясь стенок или дна. Этот препарат имеет то преимущество, что микробы совершенно не травмируются и препарат не высыхает длительное время.
Для исследования препарата на покровное стекло наносят каплю иммерсионного масла и рассматривают иммерсионным объективом. Просмотр ведут при сниженном конденсоре или закрытой диафрагме, чтобы неокрашенные препараты не были совершенно прозрачными, свет должен быть рассеянным.
При просмотре обращают внимание на форму, размеры, способность клеток к движению. Определяют к какой группе микробов они относятся (бактерии, простейшие, плесневые грибы).
Зарисовывают в тетради, подписывают и отмечают направление движения микробов навозной жижи.
2. Исследуют плесневый гриб мукор (головчатая плесень) – Mucor mucedo – для этого препаровальными иглами берут кусочек мицелия и переносят на предметное стекло. Рассматривают при увеличении 15 8.
Зарисовывают мицелий, спорангиеносцы, спорангий, споры и подписывают.
3. Исследуют культуру плесневого гриба пенициллиума (кистевика) – Penicillium glaucum – для этого препаровальными иглами извлекают кусочек мицелия на границе между зелёным и белым участками колонии и переносят на предметное стекло. Рассматривают при увеличении 15 8.
Зарисовывают мицелий, конидиеносцы и конидии в тетради и подписывают.
^ : навозная жижа, культуры плесневых грибов на хлебе, стёкла с выемкой, покровные стёкла, препаровальные иглы, баночки с вазелином, цветные карандаши (чёрный, зелёный).
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям