Методические указания к лабораторным занятиям для студентов агрономического и агроэкологического факультетов

Скачать 0.82 Mb.

Название	Методические указания к лабораторным занятиям для студентов агрономического и агроэкологического факультетов
страница	3/3
Дата	05.05.2013
Размер	0.82 Mb.
Тип	Документы

Содержание

Работа 20. Аммонификация белковых веществ
Постановка опыта
Результаты опыта
Материалы и оборудование
Работа 21. Нитрификация
Постановка опыта
Результаты опыта
Наблюдение за ходом нитрификации
Материалы и оборудование
Работа 22. Денитрификация
Постановка опыта
Результаты опыта
Материалы и оборудование
Работа 23. Свободноживущие азотфиксирующие микроорганизмы
1. Аэробный свободноживущий азотфиксатор Clostridium pasteurianum
Постановка опыта
Результаты опыта
2. Аэробный свободноживущий азотфиксатор Азотобактер (Azotobacter chroococcum)
Постановка опыта
Результаты опыта
...
Полное содержание

1 2 3

Раздел 6. ПРЕВРАЩЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМАМИ АЗОТА

Азот – один из элементов-органогенов, он входит в состав аминокислот, белков, мочевины, хитина, нуклеиновых кислот и других органических веществ. Его значение в питании растений велико. В почве азот находится в первом минимуме. В воздухе атмосферный молекулярный азот (N₂) составляет 78,1 %, но растения не могут его усваивать. Растениям недоступен и органический азот, они могут усваивать только минеральные формы азота (аммиачный, нитратный, нитритный). Превращение форм азота в почве осуществляется микроорганизмами и состоит из следующих этапов:

аммонификация;

2) нитрификация;

3) денитрификация:

4) биологическая азотфиксация.

^ Работа 20. Аммонификация белковых веществ

Аммонификация – это разложение органических азотсодержащих веществ с выделением азота в виде аммиака (NH₃). Этот процесс называется также минерализацией азота или гниением. В почву белковые вещества попадают с остатками отмерших растений, животных, микроорганизмов, с органическими удобрениями. При аммонификации белковых веществ выделяется аммиак, углекислый газ, при анаэробном распаде могут образовываться дурнопахнущие продукты – сероводород, меркаптаны, скатол, индол, кадаверин (трупные яды).

^ Постановка опыта. Для выращивания аммонифицирующих бактерий используют мясопептонный бульон (МПБ) с 3 % пептона или пептонную воду. Среду разливают в маленькие пробирки с ватными пробками чуть больше, чем наполовину их объёма, добавляют немного почвы для заражения, закрепляют две индикаторные бумажки: розовую лакмусовую – индикатор на аммиак, а полоску фильтровальной бумажки, пропитанную в растворе уксуснокислого свинца – индикатор на сероводород (бумажки не должны касаться среды). Пробирки закрывают ватными пробками, плотно оборачивают пробки пергаментной бумагой, подписывают и помещают в термостат при температуре 25-30 ºС.

Элективные условия для аммонификации:

1) обилие в среде белковых форм азота;

2) высокий столбик среды позволяет развиваться на поверхности среды аэробам, в середине толщи среды – факультативным анаэробам, а на дне пробирки - облигатным анаэробам.

^ Результаты опыта. Через неделю делают выводы о продуктах, выделяемых при аммонификации белковых веществ и микроскопируют возбудителей этого процесса.

Определение аммиака и сероводорода.

Посинение розовой лакмусовой бумажки свидетельствует о выделении аммиака.

Почернение фильтровальной бумажки, смоченной уксуснокислым свинцом, говорит о выделении сероводорода, а если она еще и покроется серебристым налетом, значит наряду с сероводородом выделяются и меркаптаны.

Отмечают в опытных пробирках изменение цвета индикаторных бумажек и делают выводы о выделяющихся в результате аммонификации белковых веществ газах.

Микроскопирование. Готовят препарат-мазок, для этого бактериальную петлю опускают почти до самого дна пробирки и удерживают там несколько секунд, потом медленно поднимают петлю, задерживаясь посередине толщи среды еще на несколько секунд, а затем извлекают из пробирки и делают мазок, чтобы в готовом препарате можно было найти разных по отношению к кислороду микробов. Фиксируют в пламени, красят кристаллвиолетом (30-60 с) и рассматривают с иммерсией.

Белки могут разлагаться бактериями, актиномицетами, грибами. Среди аммонифицирующих (гнилостных) бактерий встречается большое разнообразие, различных по форме и по-разному относящихся к кислороду. Среди них есть легко узнаваемые по ряду морфологических признаков:

Аэробы. Bacillus mycoides – грибовидная бацилла – небольшие палочки (0,8×5-7 мкм), подвижные, спорообразование центральное, бациллярное, клетки соединены в длинные цепочки. (На твёрдых питательных средах дают характерные грибовидные колонии).

Bacillus mesentericus – картофельная палочка – крупные палочки (0,6×8-10 мкм) с бациллярным спорообразованием, с закругленными концами, одиночные или соединенные в цепочки.

Факультативные анаэробы. Proteus vulgaris - протей обыкновенный – тонкие, подвижные, неспоровые палочки различной длины (0,3×4-6 и более мкм). Из-за своей полиморфности названы в честь мифического бога Протея.

Escherichia coli – кишечная палочка – подвижные, мелкие, короткие, неспоровые палочки (0,5×2-4 мкм).

Облигатные анаэробы. Clostridium putrificus – гнилостная палочка – подвижные палочки с плектридиальным расположением споры (спора на конце клетки, которая имеет вид барабанной палочки).

Clostridium sporogenes – спорогенная палочка –палочки округлой формы (5-6 мкм), подвижные, спорообразование клостридиальное (спора занимает почти всю центральную часть клетки, имеющий вид лимона).

Характеристика аммонифицирующих (гнилостных) бактерий: среди них есть грамположительные и грамотрицательные формы, они представляют собой палочки, подвижные, споровые и неспоровые, аэробы, факультативные анаэробы и облигагатные анаэробы, гетеротрофы.

Зарисовывают найденные аммонифицирующие бактерии в тетради и подписывают.

^ Материалы и оборудование: питательная среда (МПБ с 3 % пептона или ПВ), разлитая в малые пробирки с ватными пробками, фарфоровые чашки с почвой и ложечками, чашки Петри с розовой лакмусовой бумагой и полосками фильтровальной бумаги, пропитанные раствором уксуснокислого свинца Pb(CH₃COO)₂, кристаллвиолет.

^ Работа 21. Нитрификация

Нитрификация – это процесс окисления аммиака (или аммиачных форм азота) сначала в азотистую кислоту (или нитриты), а затем в азотную кислоту (или нитраты). Этот процесс идет в две фазы:

I фаза – 2NH₃ + 3O₂ = 2HNO₂ + 2H₂O + 275 кДж,

II фаза – 2HNO₂ + O₂ = 2HNO₃ + 87 кДж.

^ Постановка опыта. Для исследования процесса нитрификации готовят питательную среду Виноградского по табл. 3.

Таблица 3

Питательная среда для нитрификации

Состав питательной среды	Концентрация, %	Объём рабочих растворов, мл	Объём среды, мл
^(NН₄⁾₂ ^SO₄ К₂НРО₄ ^MgSO₄ ^NaCl ^FeSO₄ ^CaCO₃ ^(сухой)	0,2 0,1 0,05 0,2 0,04 0,5	5 5 5 5 5 0,13 г	25

Питательную среду наливают в плоскодонные колбы Виноградского или Эрленмейера, заражают 0,1 г почвы, плотно закрывают ватными пробками, подписывают и помещают в термостат при температуре 25-30 ºС.

Элективные условия для нитрификации:

1) присутствие в среде аммиачной формы азота;

2) отсутствие в среде органических форм углерода, так как нитрифицирующие бактерии строгие автотрофы;

3) аэробные условия за счёт тонкого слоя среды на большой поверхности дна колбы;

4) нейтральная среда за счёт внесения мела;

5) набор минеральных элементов питания.

^ Результаты опыта. Нитрификация проходит очень медленно. В почве обе фазы идут одновременно, а в жидких питательных средах фазы нитрификации проходят последовательно. Пока есть аммиак, идет первая фаза его окисления в азотистую кислоту, и только после полного исчезновения аммиака начинается вторая фаза – окисление азотистой кислоты в азотную.

Для наблюдения за ходом нитрификации на 7, 14, 21 и 28-й день производят капельные реакции на аммиак, азотистую и азотную кислоты.

Проба на аммиак. В фарфоровую чашечку вносят 2-3 капли жидкости из колбы и 1 каплю реактива Несслера. В присутствии аммиака появляется желто-оранжевое окрашивание, при его избытке – коричневые хлопья.

Проба на азотистую кислоту или нитриты. В фарфоровую чашечку вносят 2-3 капли жидкости из колбы, каплю 20 %-ной серной кислоты и 1-2 капли реактива цинк-йод-крахмал. В присутствии азотистой кислоты появляется синее окрашивание.

Проба на азотную кислоту или нитраты. Делают при отсутствии аммиака (в присутствии нитритов можно добавить для их нейтрализации несколько кристаллов мочевины). В фарфоровую чашечку вносят 2-3 капли жидкости из колбы и 1-2 капли дифениламина в крепкой серной кислоте. В присутствии азотной кислоты появляется синее окрашивание.

Результаты капельных реакций заносят в табл. 4.

Таблица 4

^ Наблюдение за ходом нитрификации

Дата	Результаты капельных реакций на:			Вывод о ходе нитрификации
Дата	NН₃	HNO₂	HNO₃	Вывод о ходе нитрификации

Условные обозначения:

+ + очень сильная реакция,

+ положительная реакция,

+ – неопределенная реакция,

– отрицательная реакция.

Микроскопирование. После завершения первой фазы нитрификации (на 21-й или 28-й день) готовят препарат-мазок с поверхности среды. Фиксируют в пламени, окрашивают кристаллвиолетом (30-60 с), исследуют под микроскопом с иммерсией.

Нитрификацию вызывают нитрифицирующие бактерии, которые были впервые получены в чистой культуре в 1890г С.Н Виноградским. Нитрификаторы распространены почти повсеместно. Особенно их много в хорошо обработанных плодородных почвах, а в кислых почвах они отсутствуют.

Нитрифицирующие бактерии строго специфичны в отношении окисляемого вещества. Нитрифицирующие бактерии первой фазы окисляют аммиак в азотистую кислоту и не способны окислять азотистую кислоту в азотную. Они называются нитрозными бактериями. К ним относится Nitrosomonas europaea – европейский нитрозомонас – это мелкие (1-1,5 мкм), подвижные, округлые палочки.

Нитрифицирующие бактерии второй фазы способны окислять только азотистую кислоту в азотную и не развиваются в присутствии аммиака. Они называются нитратными бактериями. К ним относится Nitrobacter winogradskii – нитробактер Виноградского – это мелкие

(1 мкм) палочки клиновидной (грушевидной) формы – один конец у них более узкий, неподвижные.

Характеристика нитрифицирующих бактерий: грамположительные, среди них встречаются кокки, палочки, извитые и другие формы, бывают подвижные и неподвижные формы, неспоровые, строгие аэробы и автотрофы (хемолитоавтотрофы) – осуществляют хемосинтез – энергию, получаемую при окислении аммиака или азотистой кислоты используют для построения из СО₂ органического вещества.

Находят и зарисовывают нитрифицирующие бактерии первой и второй фазы в тетради.

^ Материалы и оборудование: колбы Виноградского или Эрленмейера на 250 мл с ватными пробками, штативы с пробирками с приготовленными растворами (NH₄)₂SO₄, К₂НРО₄, MgSO₄, NaCl, FeSO₄ и пустыми подписанными пробирками-подставками с пипетками на 5 мл, фарфоровые чашки с почвой и ложечками, а также мелом и ложечками, карандаши по стеклу, фарфоровые чашечки для капельных реакций, длинные пипетки, реактив Несслера, цинк-йод-крахмал, 20 %-ная Н₂SО₄, дифениламин, кристаллвиолет.

^ Работа 22. Денитрификация

Денитрификация – это процесс восстановления нитратов и нитритов до молекулярного азота (N₂). При этом происходит потеря почвой доступных растениям минеральных форм азота. Это явление носит отрицательный характер. Денитрификация делится на прямую, или микробиологическую – это биологическое восстановление нитратов, и косвенную, или химическую – это химическое восстановление нитратов (происходит в кислой среде).

Прямая денитрификация осуществляется денитрифицирующими бактериями и происходит в анаэробных условиях в результате их нитратного дыхания, когда микроорганизмы используют для окисления органического вещества не свободный молекулярный кислород, а при его отсутствии связанный кислород нитратов или нитритов.

^ Постановка опыта. Для наблюдения за процессом денитрификации готовят питательную среду следующего состава, г: сегнетовая соль (калий натрий виннокислый) - 20,0; KNO₃ – 2,0; K₂HPO₄ – 0,5; MgSO₄ – 0,1; вода дистиллированная – 1000 мл.

Среду наливают в колбу на половину её объёма, добавляют 0,5 г почвы, тщательно перемешивают для удаления пузырьков воздуха, затем наполняют колбу питательной средой до самых краёв и закрывают пробкой, в которую вставлена открытая с двух сторон стеклянная трубка, расширенная в средней части. Пробка вытесняет часть жидкости из колбы в стеклянную трубку. Наливают в трубку несколько капель вазелинового масла, чтобы создать в колбе анаэробные условия. Колбу подписывают и помещают в термостат.

Элективные условия для денитрификации:

1) нитратная форма азота в среде;

2) анаэробные условия;

3) набор элементов питания для денитрифицирующих бактерий.

^ Результаты опыта. Через неделю опыт завершается. Отмечают появление пузырьков газов (СО₂ и N₂) и изменение цвета среды. Чтобы доказать, что нитраты исчезли, делают капельную реакцию на нитраты с дифениламином (см. лабораторную работу 21) и запи-сывают вывод в тетради.

Микроскопирование. Для знакомства с денитрифици-рующими бактериями берут пробу петлей из нижней части колбы и делают препарат-мазок. Фиксируют в пламени, красят кристал-лвиолетом (30-60 с), рассматривают с иммерсионной системой микроскопа.

К денитрифицирующим бактериям относятся:

Paracoccus denitrificans, Pseudomonas studzeri, Pseudomonas fluorescens (последний вызывает позеленение среды, т. к. выделяет зеленый флуоресцирующий пигмент).

Характеристика денитрифицирующих бактерий: грамотрица-тельные, мелкие палочки и кокки, подвижные, неспоровые, факультативные анаэробы – в аэробных условиях они осуществляют аэробное дыхание, а при отсутствии кислорода – анаэробное (нитратное) дыхание, гетеротрофы.

Зарисовывают в тетради возбудителей денитрификации.

^ Материалы и оборудование: питательная среда для денитрифицирующих бактерий, колба на 100 мл с затвором, вазелиновое масло, почва, этикетка, фарфоровые чашки, дифениламин, пипетки, кристаллвиолет.

^ Работа 23. Свободноживущие азотфиксирующие микроорганизмы

Микроорганизмы, обитающие в почве самостоятельно и способные использовать молекулярный азот атмосферы для построения своего органического вещества, называются свободноживущими азотфиксаторами. После их отмирания в почве происходит минерализация органического азота до аммиака, доступного для питания растений. Масштабы поступления биологического азота в почву за счёт деятельности свободноживущих в ней азотфиксаторов значительны и могут составлять 15-50 кг азота на гектар и более.

Свободноживущие азотфиксирующие микроорганизмы делятся на анаэробные и аэробные.

^ 1. Аэробный свободноживущий азотфиксатор Clostridium pasteurianum

Этот микроб был открыт в 1893 г. С.Н. Виноградским и назван в честь Л. Пастера. Энергию, получаемую в результате маслянокислого брожения органических форм углерода (моно-, ди- и полисахаридов), использует на связывание молекулярного азота. Азотфиксирующая способность составляет 10-12 мг азота на 1 г сброженного сахара. Эти микроорганизмы встречаются во всех почвах.

^ Постановка опыта. Для создания накопительной культуры Clostridium pasteurianum используют безазотистую среду Виноградского следующего состава, г: глюкоза – 20,0; К₂НРО₄ – 1,0; MgSO₄ – 0,5; NaCl – 0,5; вода дистиллированная – 1000 мл.

Среду разливают в высокие пробирки на 2/3 их объема, добавляют 0,5 г мела (для нейтрализации масляной кислоты) и заражают 1 г почвы. Пробирки закрывают ватными пробками, оборачивают пробки бумагой, подписывают. Подготовленные пробирки пастеризуют при температуре 60 С в течение 30 мин, а затем помещают в термостат при 25-30 С.

Элективные условия для развития Clostridium pasteurianum:

1) отсутствие в среде азота;

2) анаэробные условия за счёт высокого столбика среды в пробирке;

3) присутствие глюкозы, необходимой для маслянокислого брожения;

4) нейтральная среда за счёт мела;

5) необходимый набор элементов минерального питания;

6) пастеризация уничтожает неспоровые формы, а бациллы остаются.

^ Результаты опыта. Через неделю пробирки исследуют. Отмечают выделение газов и масляной кислоты в результате брожения.

Микроскопирование. Для исследования микробов бактериологической петлей проводят по стенке в нижней части пробирки, где в осадке мела, часто покрытые пленкой, накапливаются клостридиумы. Быстро переносят микробы на предметное стекло и готовят препарат-мазок, фиксированный в пламени и окрашенный кристаллвиолетом (30-60 с). Рассматривают, пользуясь иммерсионной системой микроскопа.

Характеристика Clostridium pasteurianum. Являются типичными маслянокислыми бациллами. Грамположительные. Клетки представляют собой крупные палочки шириной 0,8-1,3 и длиной 1,5-8 мкм, подвижные (перитрихи), споровые (спорообразование клостридиальное, клетки имеют вид веретена), откладывают в теле гранулёзу, облигатные анаэробы, гетеротрофы.

Зарисовывают в тетради споровые формы.

^ 2. Аэробный свободноживущий азотфиксатор Азотобактер (Azotobacter chroococcum)

Азотобактер впервые выделен в чистой культуре голландским ученым М. Бейеринком в 1901 г. В настоящее время известно около 10 видов азотобактера. Наиболее распространенным и хорошо изученным является Azotobacter chroococcum – обитатель почв всех типов, кроме кислых. Образует на плотной питательной среде Эшби колонии с бурым, почти чёрным пигментом. Для Azotobacter agilis характерны бесцветные колонии, Azotobacter vinelandii дает флуоресцирующую желтовато-зеленоватую окраску колоний. Азотфиксирующая способность у азотобактера составляет 15-20 мг азота на 1 г потребляемого органического вещества.

^ Постановка опыта. Для выявления азотобактера в почве и определения относительного его содержания пользуются методом почвенных комочков. Для этого используют агаризованную питательную среду Эшби следующего состава, г: маннит или глюкоза – 20,0; К₂НРО₄ – 0,2; MgSO₄ – 0,2; NaCl – 0,2; K₂SO₄ – 0,1; CaCO₃ – 5,0; агар-агар – 20,0; вода дистиллированная – 1000 мл.

Приготовленную среду разливают в чашки Петри и дают ей застыть. Для оценки плодородия почв по плотности населения в них азотобактера можно использовать две различные по плодородности почвы. Тогда дно чашки карандашом по стеклу делят на две равные части и отмечают их цифрами (1 и 2). Производят посев комочков почвы диаметром примерно 2 мм с помощью стеклянной палочки, смоченной в воде (25 комочков почвы № 1 на половину чашки с номером один и 25 комочков почвы № 2 на половину чашки с номером два). Комочки раскладывают на некотором расстоянии друг от друга и хорошо смачивают водой.

Чашки закрывают, оборачивают бумагой, подписывают и помещают в термостат при температуре 28-30 С.

Элективные условия для развития азотобактера:

1) отсутствие в среде азота;

2) аэробные условий, так как посев поверхностный;

3) присутствие в среде маннита, фосфора и минеральных элементов для питания;

4) нейтральная среда за счёт мела;

5) достаточная влажность при хорошем увлажнении комочков.

^ Результаты опыта. Посеянные чашки исследуют через неделю.

Определение плотности населения азотобактера. Подсчитывают комочки почвы, вокруг которых появились густослизистые бесцветные, светло-коричневые или тёмно-бурые колонии азотобактера. Выражают число комочков обрастания в процентах от общего количества разложенных комочков отдельно для каждой почвы. Сравнивают эти показатели у анализируемых почв и делают выводы об их плодородии.

Азотобактер очень требователен к плодородию почвы. Почва должна быть нейтральной (рН 7,2-7,4), структурной (аэрируемой), с влажностью 60-80 % ПВ, богатой органическим веществом, фосфором, микроэлементами (Мо, В). Присутствие азотобактера в почве является показателем её окультуренности и плодородия.

Микроскопирование. Для знакомства с азотобактером из неподсохших блестящих слизистых колоний готовят препарат-мазок, фиксированный в пламени и окрашенный метиленовым синим

(2-3 мин). Рассматривают с иммерсией.

В нашем опыте хорошо развивается Azotobacter chroococcum.

Характеристика азотобактера: грамотрицательный, по форме встречаются кокки, палочки и цисты. Имеет ясно выраженный цикл развития. В молодой культуре клетки имеют форму крупных, коротких палочек с закругленными концами (размером 3×6 мкм), подвижные (перитрихи), неспоровые. С возрастом клетки азотобактера принимают округлую форму, становятся крупными кокками (диаметром 4 мкм) и теряют подвижность. Кокки соединены по две или четыре клетки и покрыты общей толстой слизистой капсулой. Содержат запасные вещества волютин и гликоген. Именно эти клетки и фиксируют азот атмосферы. Азотобактер очень влаголюбив – при нехватке влаги становится цистами – покоящимися клетками, покрытыми плотной оболочкой. Аэроб. Гетеротроф.

Из Azotobacter chroococcum готовят бактериальное удобрение – азотобактерин (ризофил), которым обрабатывают семена различных культур (овощных, картофеля, зерновых) перед посевом для улучшения азотного питания растений и ростстимулирующего действия в результате деятельности микроорганизмов.

Зарисовывают в тетради азотобактер и делают поясняющие подписи.

^ Материалы и оборудование: для посева клостридиума - колбы со средой Виноградского, фарфоровые чашки с почвой и ложечками, а также чашки с мелом и ложечками, высокие пробирки с ватными пробками, полоски бумаги для обертывания пробирок, водяная баня;

для посева азотобактера – чашки Петри со средой Эшби, две чашки Петри с различными почвами и два стаканчика с дистиллированной водой и стеклянными палочками, бумага для обёртывания чашек;

для микроскопирования – кристаллвиолет и метиленовый синий.

^ Работа 24. Клубеньковые бактерии бобовых растений

Клубеньковые бактерии относятся к симбиотическим азотфиксаторам. Они живут в клубеньках на корнях бобовых растений и способны фиксировать азот атмосферы только в таком симбиозе. Клубеньки у одних растений (горох, бобы) крупные, у других (клевер) мелкие, у некоторых могут иметь вид больших бородавчатых наростов на главном корне (люпин).

Клубеньковые бактерии характеризуются специфичностью – заражают только определенные виды бобовых растений; вирулентностью – проникают в ткань корня, где размножаются и вызывают образование клубеньков; активностью – способны использовать молекулярный азот.

Наиболее энергично процесс усвоения азота в клубеньках отмечается в фазе бутонизации и цветения бобовых, когда клубеньковые бактерии принимают форму бактероидов. Однолетние бобовые растения способны в симбиозе с клубеньковыми бактериями накапливать за вегетационный период на 1 га от 50 до 100 кг азота, а многолетние – 150-300 кг.

Микроскопирование. Для знакомства с клубеньковыми бактериями готовят препараты-отпечатки или мазки из клубеньков бобовых растений. Для этого отделяют клубеньки от корней, помещают на предметное стекло и другим предметным стеклом раздавливают и размазывают по поверхности. У люпина надрезают нарост на корне и делают мазок обнажённой тканью. Фиксируют в пламени, окрашивают кристаллвиолетом (30-60 с), рассматривают с помощью иммерсионной системы. В препаратах отыскивают мелкие, неспоровые палочки и крупные бактероиды.

Клубеньковые бактерии относятся к роду Rhizobium. В клубеньках люпина развиваются Rhizobium lupini, клевера – Rhizobium trifolii, гороха и бобов – Rhizobium leguminosarum.

Характеристика клубеньковых бактерий бобовых растений. Грамотрицательные. В почве они представляют собой подвижные или неподвижные палочки и кокки, азот фиксировать не могут. Проникая и развиваясь в клетках корней, они становятся сначала неподвижными палочками, которые с возрастом накапливают запасные вещества и переходят в состояние так называемых опоясанных палочек (такие клетки особенно хорошо видны у гороха). Затем из этих клеток образуются бактероиды – клетки крупных размеров, неподвижные и различной формы, специфичной для разных видов клубеньковых бактерий: У-образной, Т-образной, нитевидной, грушевидной и др. Именно бактероиды обладают азотфиксирующей способностью. Клубеньковые бактерии неспоровые, аэробы и гетеротрофы.

Из клубеньковых бактерий готовят бактериальное удобрение – нитрагин (ризоторфин, ризобин, сапронит), которым обрабатывают семена бобовых растений перед посевом для ускорения образования клубеньков и улучшения азотного питания растений. Бактеризация культур производится специфичными им расами клубеньковых бактерий.

Зарисовывают в тетради и подписывают бактероиды различных видов клубеньковых бактерий.

^ Материалы и оборудование: зафиксированные в формалине корни бобовых растений с клубеньками (горох, бобы, люпин, клевер), маленькие пинцеты, лезвия, кристаллвиолет.

^ Раздел 7. МИКРОБИОЛОГИЯ КОРМОВ

Работа 25. Исследование силоса, сенажа и квашеных продуктов

Силос

Силосование – это способ консервирования влажной зеленой растительной массы. Силос (от исп. silos – яма) один из древнейших видов корма. В основе силосования (заквашивания) лежит молочнокислое брожение. Силосованный корм сохраняет сочность, приобретает кислый вкус, становится более мягким, лучше поедается скотом и может храниться продолжительное время. Силос имеет влажность 70-80 % и кислотность (рН) 4,0-4,2.

Для оценки качества силоса проводят органолептические, химические и микробиологические исследования.

К органолептическим показателям качества силоса относятся цвет, запах, консистенция и вкус.

Цвет должен быть ближе к цвету растений, из которых приготовлен силос. Доброкачественный силос имеет оттенки зелёного, жёлто-зелёного, коричнево-зелёного цвета. У испорченного силоса преобладает тёмно-коричневый и чёрный цвет.

Запах доброкачественного силоса должен быть приятным, напоминающим запах свежеиспечённого хлеба, мочёных яблок. При порче силоса появляется запах уксуса и неприятный запах масляной кислоты.

Консистенция у доброкачественного силоса должна быть выраженной. У испорченного силоса растительная масса делается ослизнённой, листочки не отделяются друг от друга.

Вкус доброкачественного силоса слабокислый, приятный. У испорченного силоса вкус резко кислый с горьковатым привкусом.

Важнейшим химическим показателем качества силоса является его кислотность. У силоса хорошего качества рН должна быть около 4,0-4,2.

^ Микробиологическая оценка качества силоса проводится по его микрофлоре. В силосе хорошего качества должны быть молочнокислые бактерии и немного дрожжей, не должно быть маслянокислых, гнилостных бактерий и плесневых грибов.

Выполнение. Для анализа из торцовой части траншеи, ямы или наземных буртов берут среднюю пробу силоса и помещают в стерильный кристаллизатор. Исследования рекомендуется проводить не позднее 1-2 суток после взятия пробы.

Определение рН силоса. Навеску силоса 1 г растирают в фарфоровой ступке с 10 мл дистиллированной воды. Настаивают около 5 мин и определяют кислотность полученной вытяжки с помощью индикаторной бумаги для определения рН силоса (цвет опущенной в вытяжку бумажки сравнивают со шкалой).

Оценка качества силоса. Для определения качества исследуемого силоса используют метод его балльной оценки органолептических и химических показателей, предложенный А.Н. Михиным (табл. 5).

Таблица 5

^ Оценка качества силоса по А.Н. Михину

Показатели

Балл

^ Цвет:

зелёный

жёлто-зелёный или коричневый

чёрно-зелёный

чёрный

Запах:

ароматический, фруктовый, слабокислый, хлебный

слабоароматический, уксуснокислый, огуречный

резко уксуснокислый, запах масляной кислоты

затхлый, навозный, сильный запах масляной кислоты

Величина рН:

4,2 и ниже

4,3-4,5

4,6-5,0

5,1-6,0

6,1-6,3

6,4 и выше

3

2

1

0

4

3

2-1

0

5

4

3

2

1

0

Данные балльной оценки при определении цвета, запаха и рН суммируют и получают общий балл, по которому определяют качество силоса: 11-12 баллов – силос очень хорошего качества, 9-10 – хорошего качества, 7-8 – среднего качества, 4-5 – плохого качества.

Силос, имеющий оценку 3 балла и ниже, считается очень плохим и к скармливанию животным непригоден.

Производят оценку указанных показателей в баллах и делают вывод о качестве исследуемого силоса.

Микроскопирование. Для знакомства с микрофлорой силоса из него готовят препарат-отпечаток следующим образом. Берут пинцетом наиболее сочный стебель и плотно прижимают его к предметному стеклу. Можно положить силос на предметное стекло и прижать его другим стеклом, тогда сразу на двух стеклах получится отпечаток. Использованный растительный материал удаляют со стекла, а мазок сушат, фиксируют в пламени и окрашивают кристаллвиолетом

30-60 с. Рассматривают препараты, пользуясь иммерсионной системой микроскопа.

На поверхности растений находится эпифитная микрофлора – гнилостные, молочнокислые бактерии, дрожжи, плесневые грибы. При силосовании измельченная растительная масса помещается в ямы, траншеи или башни, спрессовывается и изолируется от доступа воздуха. Накопление молочной и уксусной кислот под действием молочнокислых бактерий обуславливает сохранность силоса, потому что нежелательные для силосования бактерии (маслянокислые, гнилостные) не могут развиваться в среде с кислой реакцией. Критические значения рН для развития различных групп бактерий: молочнокислых – 3,5-4,0, маслянокислых – 4,7-5,0, гнилостных – 5,0-5,5. Кислую среду (рН 4,0) хорошо переносят плесневые грибы, но они являются строгими аэробами и в хорошо укрытом засилосованным корме в анаэробных условиях развиваться не могут. Кислотоустойчивость свойственна также дрожжам, они встречаются в силосе обычно в небольших количествах. Дрожжи сбраживают сахара до спирта, что придает корму приятный запах и вкус, продуцируют витамины и другие биологически активные вещества.

В препарате находят гомоферментативные молочнокислые бактерии: растительную палочку - Lactobacterium plantarum – тонкие неспоровые палочки, варьирующие в размере, и молочный стрептококк – Streptococcus lactis – короткие цепочки или пары кокков. Иногда встречаются клетки почкующихся дрожжей. В силосе низкого качества обнаруживаются маслянокислые бациллы, гнилостные бактерии и плесневые грибы.

Зарисовывают и подписывают микрофлору силоса в тетради.

Сенаж

Сенажирование – это способ консервирования провяленных растений, главным образом бобовых, убранных в начале стадии бутонизации. Сначала растительная масса 1-2 суток лежит в валках, а затем ее подбирают, измельчают, загружают в траншеи или башни, , уплотняют и изолируют от воздуха. Влажность сенажа (сено-силоса) составляет 40-60 %. Сохраняется под влиянием «физиологической сухости» и биохимических процессов, вызываемых микроорганизмами.

При подсушивании растений повышается осмотическое давление их клеток и водоудерживающая сила растений может превышать сосущую силу микробов. У гнилостных и маслянокислых бактерий осмотическое давление меньше, чем у молочнокислых, поэтому при подсушивании растительной массы гнилостные и маслянокислые бактерии не развиваются, но действуют молочнокислые бактерии, которые вызывают молочнокислое брожение. Однако микробиологические процессы при сенажировании протекают медленно. Сенаж содержит в 2,4 раза меньше молочной кислоты, чем силос, нет масляной кислоты, рН сенажа составляет 4,7-5,0. Микрофлора сенажа такая же, как у силоса, но количественно микробов меньшее.

Выполнение. Для исследования сенажа определяют рН и готовят препарат-отпечаток как и при исследовании силоса.

Зарисовывают в тетради микрофлору сенажа и отмечают его кислотность.

Квашеные продукты

Молочнокислое брожение лежит в основе квашения капусты, огурцов и др. Микробиологические процессы при этом такие же , как и при силосовании.

Выполнение. Для исследования выжимают сок из квашеных продуктов и определяют его кислотность с помощью индикаторной бумаги для определения рН силоса. Затем делают препараты-отпечатки как и при исследовании силоса. Микрофлора квашеной капусты и солёных огурцов такая же, как и в силосе.

В квашеной капусте развивается молочный стрептококк – Streptococcus lactis, капустная палочка (разновидность растительной) – Lactobacterium plantarum var. brassica и дрожжи Saccharomyces cerevisiae.

В солёных огурцах – молочный стрептококк - Streptococcus lactis, огуречная палочка (разновидность растительной) - Lactobacterium plantarum var. cucumis и дрожжи - Saccharomyces cerevisiae.

В более кислых продуктах больше палочковидных молочнокислых бактерий, а в менее кислых – шаровидных. Число дрожжевых клеток также может быть различным – это зависит от содержания в растениях сахара. Заполняют табл. 6.

Таблица 6

^ Результаты исследования квашеных продуктов

Название продукта	Кислотность, рН	Название микрофлоры
Квашеная капуста
Солёный огурец

Зарисовывают в тетради микрофлору квашеных продуктов.

^ Материалы и оборудование: силос или сенаж, квашеная капуста, солёные огурцы, ступки с пестиками, цилиндры на 100 или 50 мл, дистиллированная вода, индикаторная бумага для определения рН силоса со шкалой, кристаллвиолет.

Приложение

^ Приготовление красителей и индикаторов

Кристаллвиолет (метиловый фиолетовый), водный раствор: метиловый фиолетовый кристаллический – 7 г, этиловый спирт

96-ный – 100 мл, вода дистиллированная – 900 мл. Раствор устойчив.

^ Фуксин основной, насыщенный спиртовой раствор: фуксин основной кристаллический – 10 г, этиловый спирт 96-ный – 100 мл. Раствор может хранится долгое время в бутылке из тёмного стекла.

^ Фуксин основной карболовый – фуксин Циля: фуксин основной кристаллический – 1 г, карболовая кислота (фенол) – 5 г, этиловый спирт 96-ный – 10 мл, вода дистиллированная – 100 мл. К спиртовому раствору основного фуксина приливают 5%-ный раствор фенола (воду для его приготовления подогревают до 50С), добавляют несколько капель глицерина. Настаивают в термостате 48 ч и фильтруют через бумажный фильтр. Раствор устойчив. Хранят в укупоренной таре.

^ Фуксин Пфейффера: карболовый фуксин Циля – 1мл, вода дистиллированная – 9 мл. Готовят на срок не более 10 дней.

Фуксин основной, водный раствор: фуксин основной, насыщенный спиртовой раствор – 1 мл, вода дистиллированная – 9мл. Раствор устойчив.

^ Метиленовый синий, насыщенный спиртовой раствор: метиленовый синий кристаллический – 10 г, этиловый спирт 96-ный – 100 мл. Оставляют на 2-3 дня в термостате, периодически встряхивая, а затем фильтруют. Раствор устойчив.

^ Метиленовый синий, водный раствор: насыщенный спиртовой раствор метиленового синего – 1 мл, вода дистиллированная – 9 мл. Раствор устойчив.

Уксуснокислый синий Нейссера: готовят два раствора –

1. Метиленовый синий кристаллический – 0,1 г, этиловый спирт 96-ный – 2 мл, уксусная кислота ледяная – 5 мл, вода дистиллированная – 100 мл;

2. Метиловый фиолетовый кристаллический – 0,1 г, этиловый спирт 96-ный – 1 мл, вода дистиллированная – 30 мл. Перед употреблением смешивают две части первого раствора с одной частью второго. Раствор неустойчив.

^ Раствор хризоидина: хризоидин кристаллический – 1,0 г, вода дистиллированная горячая – 300 мл. Горячий раствор фильтруют через бумажный фильтр, после охлаждения готов к употреблению.

^ Эритрозин карболовый, г: эритрозин кристаллический – 3, фенол (карболовая кислота) – 5, вода дистиллированная – 100 мл. Карболовую кислоту растворяют в воде, нагретой до 50 С, добавляют эритрозин, отстаивают и фильтруют через бумажный складчатый фильтр.

^ Раствор Люголя (для окраски по Граму), г: йод кристаллический– 1, калий йодистый – 2, вода дистиллированная – 300 мл. Навеску йода и йодистого калия растирают в ступке пестиком, доливают 1 мл воды и растирают, добавляют еще 5 мл воды, продолжая растирать. Когда кристаллы растворятся, доливают всю оставшуюся порцию воды. Хранят в темной посуде. Срок годности не более 30 дней.

^ Раствор Люголя (крепкий, для выявления гранулёзы), г: йод кристаллический – 7, калий йодистый – 20, вода дистиллированная – 100 мл. Раствор готовят так же, как и предыдущий.

^ Бумажки Синёва: нарезают кусочки фильтровальной бумаги размером 2×3 см; готовят 0,5%-ный спиртовой раствор кристаллвиолета; пропитывают бумажки 2-3 раза в этом растворе, высушивают; хранят защищенными от действия света.

Реактив Несслера, г: KJ – 7, HgJ₂– 10, KOH – 10. Готовят два раствора: 1. Навески KJ и HgJ₂ растворяют в 40 мл дистиллированной воды. 2. Навеску КОН растворяют в 40 мл дистиллированной воды. Растворы 1 и 2 смешивают и доводят общий объём до 100 мл. Хранят в темной стеклянной посуде. В продаже имеется готовый реактив Несслера.

Цинк-йод-крахмал: 2 г хлористого цинка (ZnCl₂) растворяют в 100 мл дистиллированной воды, нагревают до кипения и приливают растворённый крахмал (0,4 г крахмала в 10 мл воды). Объём смеси доводят водой до 100 мл, кипятят до тех пор, пока она не станет прозрачной, охлаждают (можно настаивать неделю) и добавляют 100 мл 0,2 %-ного раствора йодистого калия (0,2 г KJ в 100 мл воды) или йодистого цинка.

Дифениламин: 1 г дифениламина (С₆Н₅-NН-С₆Н₅) растворяют в 100 мл крепкой серной кислоты и полученный раствор приливают к

20 мл дистиллированной воды.

^ Уксуснокислый свинец: 10 г уксуснокислого свинца Pb (CH₃COO)₂ растворяют в 100 мл воды и приливают 10%-ный раствор NaOH (10 г щелочи на 100 мл воды) до исчезновения осадка.

ЛИТЕРАТУРА

Аристовская Т.В. и др. Большой практикум оп микробиологии. М.: Высшая школа, 1962.

Авраменко И.Ф. Микробиология. М.: Колос, 1979.

Асонов Н.Р. Практикум по микробиологии. М.: Агропромиздат, 1988.

Ежов Г.И. Руководство к практическим занятиям по сельскохозяйственной микробиологии. М.: Высшая школа, 1981.

Колешко О.И. Экология микроорганизмов почвы. Мн.: Вышэйшая школа, 1981.

Микробиология: Методические указания к лабораторным занятиям /БСХА. Сост. О.С. Кильчевская. Горки, 1995.

Мишустин Е.Н., Емцев В.Т. Микробиология. М.: Агропромиздат, 1987.

Разумовская З.Г., Чижик Т.Я., Громов Б.В. Лабораторные занятия по почвенной микробиологии. Л.: Изд-во ЛГУ, 1960.

Руководство к практическим занятиям по микробиологии /Под ред. Н.С. Егорова. М.: Изд-во МГУ, 1983.

Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. М.: Колос, 1993.

СОДЕРЖАНИЕ

^ ПРАВИЛА РАБОТЫ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ . . . 3

ТЕХНИКА ПРИГОТОВЛЕНИЯ ФИКСИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ . . . 4

Раздел 1. МОРФОЛОГИЯ И СИСТЕМАТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ . . 6

Работа 1. Основные формы бактерий . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

Работа 2. Окраска по Граму . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

Работа 3. Окраска капсул методом негативного контрастирования

(по Гинсу) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
^

Работа 4. Окраска спор у бактерий (по методу Циля-

Нильсена) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

Работа 5. Окраска волютина (по методу Нейссера) . . . . . . 12

Работа 6. Исследование актиномицетов. . . . . . . . . . . . . 13

Работа 7. Исследование микроорганизмов в живом виде . . 14

Раздел 2. ПИТАНИЕ МИКРООРАГНИЗМОВ. . . . . . . . . . . . . 15

Работа 8. Питательные среды для микроорганизмов. . . . . . . . . . 15

Раздел 3. МИКРОБЫ И ОКРУЖАЮЩАЯ СРЕДА. . . . . . . . . . . . 19

Работа 9.Стерилизация. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

Р.аздел 4. МИКРОБИОЛОГИЯ ВОЗДУХА И ПОЧВЫ . . . . . . . . . 23

Работа 10. Количественный учёт и определение качественного состава

микрофлоры воздуха и почвы методом агаровых пластинок. . 23

Работа 11. Прямой метод подсчёта числа микроорганизмов в почве по

Виноградскому. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

Раздел 5. ПРЕВРАЩЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМАМИ СОЕДИНЕНИЙ

УГЛЕРОДА. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

Работа 12. Спиртовое брожение. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

Работа 13. Молочнокислое брожение. . . . . . . . . . . . . . . . . 34

Работа 14. Маслянокислое брожение. . . . . . . . . . . . . . . . . 37

Работа 15. Брожение пектиновых веществ. . . . . . . . . . . . . . 40

Работа 16. Брожение клетчатки. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

Работа 17. Окисление клетчатки. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

Работа 18. Окисление спирта в уксусную кислоту. . . . . . . . . . . 46

Работа 19. Окисление микроорганизмами жира. . . . . . . . . . . . 47

Раздел 6. ПРЕВРАЩЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМАМИ АЗОТА. . . . . . 48

Работа 20. Аммонификация белковых веществ. . . . . . . . . . . . 49

Работа 21. Нитрификация. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

Работа 22. Денитрификация. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

Работа 23. Свободноживущие азотфиксирующие микроорганизмы. . . 55

Работа 24. Клубеньковые бактерии бобовых растений. . . . . . . . . . 59

Раздел 7. МИКРОБИОЛОГИЯ КОРМОВ. . . . . . . . . . . . . . . 61

Работа 25. Исследование силоса, сенажа и квашеных продуктов. . . . . 61

ПРИЛОЖЕНИЕ Приготовление красителей и индикаторов. . . . . . . 66

ЛИТЕРАТУРА . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

1 2 3

плохо

не очень плохо

средне

хорошо

отлично

Ваша оценка этого документа будет первой.

Ваша оценка:

	Методические указания к лабораторным занятиям по нормальной физиологии для студентов II курса Тирасполь,		Методические указания к практическим занятиям для студентов медицинских факультетов (модуль №1)
	Методические указания к практическим занятиям для студентов медицинских факультетов (модуль №2)		Методические указания к практическим занятиям по частной микробиологии для студентов 3 курса педиатрического
	Методические указания для студентов IV курсов медицинских факультетов по самостоятельной подготовке		Методические указания для студентов V курса медицинских факультетов по самостоятельной подготовке
	Методические указания для студентов V курса медицинских факультетов по самостоятельной подготовке		Методические указания для студентов IV курсов медицинских факультетов по самостоятельной подготовке
	Методические указания к лабораторным занятиям (Стоматология)		Методические рекомендации к лабораторным занятиям для студентов стоматологического факультета Часть

Методические указания к лабораторным занятиям для студентов агрономического и агроэкологического факультетов

Работа 4. Окраска спор у бактерий (по методу Циля-

Раздел 2. ПИТАНИЕ МИКРООРАГНИЗМОВ. . . . . . . . . . . . . 15

Похожие: