Методические указания к лабораторным занятиям для студентов агрономического и агроэкологического факультетов
|
|
Скачать 0.82 Mb.
|
|
^
Работа 8. Питательные среды для микроорганизмов Для выращивания микроорганизмов в лабораторных условиях, а также для изучения их физиологических свойств пользуются питательными средами. Выполнение. Ознакомиться с принципами классификации питательных сред и приготовлением основных питательных сред для выращивания микроорганизмов (МПБ, МПА, МПЖ). ^ По химическому составу питательные среды разделяются на естественные, искусственные и синтетические. К естественным средам относятся почва, молоко, мясо и др. Искусственные среды готовят из естественных с добавлением химических веществ. Они могут быть животного (МПБ, МПА, МПЖ) и растительного (пивное сусло, картофельный агар) происхождения. Синтетические среды готовят по рецепту, их состав точно известен (среда Эшби, Чапека, Омелянского и др.). По физическому состоянию, или консистенции питательные среды делятся на жидкие и твёрдые (плотные). В жидких средах (МПБ, ПВ, молоко) накапливают и выявляют физиолого-биохимические особенности микроорганизмов, но их трудно выделить. Плотные среды готовят из жидких, добавляя к ним 1,5-2 % агар-агара или 10 % желатина. Их используют для выделения чистых культур, количественного учета и диагностики микрофлоры. Реже используют полужидкие (с 0,1-0,2 % агар-агара) и сыпучие среды. По назначению питательные среды могут быть общего назначения, на которых может развиваться большое количество микроорганизмов (почва, МПБ, МПА и др.), и элективные (избирательные) (от лат. electus – избираю), подходящие для одного вида микроорганизмов. Впервые элективные среды были предложены С.Н. Виноградским (безазотистая среда для азотфиксаторов и без органического углерода для автотрофных нитрифицирующих бактерий). ^ Мясопептонный бульон (МПБ) – среда искусственная, жидкая, общего назначения. Для её приготовления используют мясо – говядину, телятину, конину и др. Из мяса получают фарш, заливают его холодной водопроводной водой (на 1 кг фарша 2 л воды), настаивают при температуре 5-7 ºС 18-24 ч для выделения экстрактивных веществ. Затем мясной настой кипятят 15-30 мин, охлаждают и фильтруют через полотно. К 1 л полученного бульона добавляют 5 г NaCl и 10 г пептона. Сухой пептон представляет собой жёлтый липкий порошок – продукт неполного распада белков. Соль и пептон растворяют при нагревании, доводят щелочью рН до 7,2-7,4 (слабощелочная реакция среды благоприятна для большинства микроорганизмов). Среду разливают в колбы и стерилизуют в автоклаве. Используют для приготовления МПА и МПЖ, для накопительной культуры аммонифицирующих бактерий. ^ – среда искусственная, твёрдая, общего назначения. Представляет собой плотную студнеобразную массу. Эта питательная среда широко применяется в лабораторной практике для выращивания микроорганизмов. Для её приготовления используют сухой агар-агар (по малайски агар-агар – желе) – полисахарид с низким содержанием азотистых веществ и не представляющий питательной ценности для микроорганизмов. Агар-агар имеет вид серых листовидных пластинок. Добывается он из морских водорослей багрянок. Это отличное гелеобразующее вещество – обладает способностью набухать и растворяться при нагревании, а после застывания образовывать плотную студенистую массу. Для приготовления этой среды к 1 л МПБ добавляют 15-20 г агар-агара. Замачивают несколько часов для набухания агара, кипятят на слабом огне до полного его растворения, после этого доводят объём жидкости до первоначального дистиллированной водой, фильтруют через марлевый фильтр, смоченный предварительно горячей водой. Среду в горячем виде разливают в стеклянные колбы и стерилизуют в автоклаве. Готовый МПА имеет точку плавления 96-100 ºС и температуру застывания около 40 ºС, т. е. при комнатной температуре он всегда представляет собой твердую питательную среду. Используют для количественного анализа микрофлоры воздуха и почвы. ^ - среда искусственная, твёрдая, общего назначения. Это плотная питательная среда, для приготовления которой используют сухой желатин. Желатин - вещество белковой природы, кислый азотсодержащий продукт, добываемый путём вываривания костей, хрящей. Для приготовления МПЖ к 1 л МПБ добавляют 100-150 г желатина, настаивают несколько часов для набухания желатина и затем нагревают до его полного растворения. Используют щелочь для доведения реакции среды до слабощелочной. Фильтруют горячую среду через складчатый бумажный фильтр, разливают в колбы и стерилизуют дробно текучим паром в аппарате Коха. Применение МПЖ ограничено в связи с тем, что он разжижается под действием протеолитических ферментов, выделяемых многими микроорганизмами. Кроме того, образуемый желатином гель плавится уже при 23-25 ºС и застывает при 20 ºС и ниже, а большинство микробов развивается при 30-37 ºС. Используют для выявления культуральных и биохимических признаков идентифицируемых микроорганизмов. ^ – среда синтетическая, твёр-дая, элективная. Имеет следующий состав, г: крахмал – 10, (NH4)2SO4 – 2, K2HPO4 – 1, MgSO4 – 1, CaCO3 – 3, агар-агар – 20, вода дистил-лированная – 1000 мл. Агар растворяют в 300 мл воды. Отдельно растворяют крахмал в 100 мл воды. В остальных 600 мл воды растворяют соли, нагревают до кипения и в кипящий раствор при непрерывном помешивании вливают крахмал, затем добавляют воду с агаром и стерилизуют в автоклаве. Используют для выращивания актиномицетов. ^ - среда синтетическая, твёрдая, элективная. Имеет следующий состав, г: глюкоза – 14,0; CaCO3 – 0,7; KNO3 – 0,7; MgSO4 – 0,35; NaCl – 0,35; K2HPO4 – 0,35; FeSO4 – следы; агар-агар – 20,0; вода дистиллированная – 1000 мл. Агар отдельно растворяют в 300 мл воды. Затем всю смесь кипятят, разливают в колбы и стерилизуют в автоклаве. Используют для выращивания актиномицетов. ^ - среда синтетическая, твердая, элективная. Имеет следующий состав, г: пептон – 10, лактоза – 10, K2HPO4 – 3,5, NaHSO3 – 2,5, агар-агар – 15,0, вода дистиллированная – 1000 мл. К среде добавляют 4 мл 10 %-ного спиртового раствора основного фуксина, поэтому она окрашивается в розово-кремовый цвет. Среду стерилизуют в автоклаве и сохраняют в темноте. Используют для выращивания кишечной палочки. Бактерии из рода Escherichia на этой среде образуют малиновые колонии с металлическим блеском. ^ - среда искусственная, жидкая, элективная. Для ее приготовления к 1 л воды добавляют 40 г пептона и 5 г NaCl, растворяют при нагревании, фильтруют, разливают в колбы и автоклавируют. Используют для выращивания аммонифицирующих (гнилостных) бактерий. ^ – среда синтетическая, полужидкая, общего назначения. Для её приготовления 0,1 г агар-агара растворяют в 100 мл воды при кипячении, фильтруют и автоклавируют. Используют для прямого подсчета числа микроорганизмов в почве по Виноградскому. Многие питательные среды (среда Эндо, сухой питательный агар, питательный бульон и др.) изготавливаются промышленным способом в виде сухих порошков. В лаборатории их доводят до готовности по рецепту, указанному на этикетке. Приготовление ряда элективных питательных сред описано в работах № 11, 12, 13, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23. ^ : колбы с мясопептонным бульоном, мясопептонным агаром, средой Чапека или КАА для актиномицетов, средой Эшби для азотобактера, средой Омелянского для целлюлозоразлагающих бацилл и др.; сухой пептон, агар-агар и желатин в баночках. ^ Работа 9. Стерилизация Стерилизация (от лат. sterilis – бесплодный) – это уничтожение микроорганизмов в различных объектах путем воздействия на них факторами, губительными для микробов. В зависимости от того, с помощью каких факторов убивают микроорганизмы, все методы стерилизации условно разделяют на термические и холодные. Выполнение. Знакомятся со способами термической и холодной стерилизации. Термическая стерилизация. Термическая (горячая) стерилизация основана на уничтожении микробов с помощью высоких температур. Это легко выполнить и широко используется в практической деятельности человека. При этом нужно помнить, что у вегетативных (неспоровых) клеток денатурация белков и гибель клеток начинается уже при температуре 56-60 ºС. Более термоустойчивые споры погибают в сухой атмосфере при температуре 160 ºС в течение 1-2 ч, а во влажной среде гибель происходит при температуре 112-120 ºС в течение 20-30 мин. Способы термической стерилизации: 1. Фламбирование (от лат. flamma – пламя и фр. flambé – гореть)– стерилизация путем прокаливания в пламени мелких металлических или стеклянных предметов. Таким способом стерилизуют бактериологические петли, металлические пинцеты, стеклянные шпатели и трубочки, предметные стекла и др. Температура пламени около 1000ºС. При прокаливании сгорают все микроорганизмы (вегетативные и споровые формы). Это быстрый и надежный способ стерилизации. 2. Кипячение. Является одним из самых простых способов стерилизации. Проводится в стерилизаторе – металлической прямоугольной коробке с крышкой и сеткой на дне для укладывания стерилизуемых предметов. Наливают в него воду и нагревают до кипения (нагрев электрический или на огне). Кипячение может длиться от 15-30 мин до 2 ч при температуре около 100 ºС. Стерилизуют мелкие металлические или стеклянные предметы – шприцы, иглы, стеклянные трубки и др. При этом погибают вегетативные формы микроорганизмов и часть спор. Практикуют также ошпаривание кипятком стерилизуемого материала. 3. ^ Производится горячим воздухом в печи Пастера или сушильном шкафу. Печь Пастера представляет собой шкаф с двойными стенками, покрытый снаружи асбестом для теплоизоляции. Внутри шкафа устроены металлические полки с отверстиями, на которые помещают стерилизуемый материал. Нагрев электрический. Стерилизация проводится при температуре 160-180 ºС в течение 1-2 ч с момента достижения этих температур (контроли-руется по термометру). Стерилизуют сухим жаром главным образом стеклянную посуду – чашки Петри, пипетки, шпатели (обернутые в бумагу), а также пробирки, колбы. Этот прием надежный – погибают неспоровые и споровые формы микроорганизмов. Обернутый в бумагу и простерилизованный материал можно хранить. 4. ^ . Проводится горячим влажным воздухом в аппарате Коха. Аппарат (кипятильник) Коха представляет собой металлический цилиндр, который может быть на ножках и покрыт линолеумом. В аппарат наливают столько воды, чтобы она не доходила до выступа, на который помещают металлический кружок с отверстиями и сверху на него стерилизуемый материал. Аппарат плотно закрывают конической крышкой с отверстием посередине для выхода пара и нагревают на огне. Когда вода закипит, горячий водяной пар с температурой около 100 ºС «потечёт» сильной струей из отверстия крышки. С этого момента отмечают время начала стерилизации. Стерилизация текучим паром продолжается от 45 мин до 1,5 ч в зависимости от объёма стерилизуемого материала. Стерилизуют питательные среды, которые нельзя нагревать выше 100 ºС, например МПЖ (при температуре выше 100 ºС он разжижается и не застывает). Этот способ стерилизации не вполне надежен – полностью погибают лишь вегетативные формы микроорганизмов, а споры сохраняются. Для достижения полной стерилизации сред в аппарате Коха применяют дробную стерилизацию. 5. ^ Проводится насыщенным водяным паром в автоклаве. Автоклав бывают разной конструкции. Вертикальный автоклав представляет собой массивный двухстенный котёл, окруженный снаружи металлическим кожухом, с тяжелой откидывающейся крышкой, плотно привинчивающейся к котлу болтами. В нижней части котла имеется воронка и кран, через которые наливается вода в свободное пространство между внутренним котлом и кожухом. На дно котла укладывают стерилизуемый материал, крышку плотно завинчивают, включают электрический нагрев. Когда вода закипает, пар проходит во внутренний котел. Давление в автоклаве поднимается, одновременно повышается температура. Когда манометр покажет, что давление в котле достигло заданной величины, отмечают время начала стерилизации. Давление поддерживается на определенном уровне с помощью предохранительного клапана. Обычно в лабораторной практике стерилизация под давлением производиться при 1,5-2 атм и температуре около 115-120 ºС в течение 20-30 мин. По истечении времени стерилизации нагрев прекращают, открывают паровой клапан и спускают пар. Стерилизуют паром под давлением питательные среды МПБ, МПА, стеклянную посуду с водой, перевязочный материал, хирургические инструменты и др. Автоклавирование является быстрым и надёжным способом стерилизации, при котором погибают все формы микроорганизмов, даже самые устойчивые споры. 6. Пастеризация. Этот прием частичной стерилизации назван в честь предложившего его французского ученого Л. Пастера. Способ заключается в том, что жидкость, налитую в стерильную посуду, прогревают на водяной бане при температуре 60-90 ºС в течение 10-30 мин. Применяется для жидких сред, которые изменяют свои физико-химические свойства при высоких температурах. Пастеризуют молоко, сливки, вино, пиво, соки и др. При этом сохраняются витамины и вкусовые качества продуктов. Пастеризованные продукты длительному хранению не подлежат, так как при этом способе стерилизации погибают лишь вегетативные формы микроорганизмов, а споры остаются. В лабораторной практике этим способом пользуются главным образом для отделения спорообразующих видов от неспорообразующих. 7. ^ . Основана на обработке стерилизуемого материала в несколько приемов. Дробным может быть кипячение или стерилизация текучим паром в аппарате Коха. Обычно стерилизацию проводят 3 дня по 30 мин ежедневно одним из указанных способов, а в перерывах оставляют среды при комнатной температуре. Это делается для провокации роста спор в вегетативные формы и их уничтожения при последующих обработках, что повышает надёжность этих приемов. 8. Тиндализация. Это разновидность дробной стерилизации (дробная пастеризация). Прием назван в честь предложившего его английского ученого Д. Тиндаля. Проводится в водяной бане при температуре 56-58 ºС в течение 1 ч с 5-7-кратным повторением через 24 ч. В интервалах между прогреваниями материал выдерживается при комнатной температуре. Тиндализации подвергают питательные среды, бедные микроорганизмами, а также содержащие вещества, легко разрушающиеся и денатурирующие при температуре выше 60 ºС (белки, витамины). Это сыворотка крови, яйца и др. В результате тиндализации достигается полное уничтожение микроорганизмов. Холодная стерилизация. Холодные способы стерилизации включают различные приемы уничтожения микроорганизмов. Называют их холодными условно, чтобы подчеркнуть, что они не основываются на действии высоких температур. При этом нужно помнить, что низкие отрицательные температуры не убивают, а только задерживают рост и развитие микроорганизмов. К холодной стерилизации относятся: 1. ^ – это уничтожение патогенных (болезнетворных) микроорганизмов с помощью химически ядовитых веществ (антисептиков). Метод используют в медицине. К антисептикам, или дезинфицирующим средствам относятся мыла, красители (зелёнка), соли тяжёлых металлов, окислители (хлор, йод, перекись водорода, перманганат калия), формалин , формальдегиды, спирты и др. 2. ^ : стерилизация ультрафиолетовыми лучами (УФ) – используют при кварцевании, ультразвуком (УЗ), током ультравысокой частоты (УВЧ) и др. Эти приемы широко используют в медицине. 3. ^ . Механическое освобождение от микроорганизмов путем фильтрации различных жидких сред через фильтры, задерживающие микробы. К таким мелкопористым фильтрам, у которых размеры пор меньше размеров бактерий, относятся фильтры Шамберлана из каолина, пластинчатые асбестовые фильтры Зейтца, мембранные фильтры из нитроцеллюлозы. Их используют для обработки легко портящихся от нагревания жидкостей. Фильтры Шамберлана называют фильтровальными свечами, потому что они представляют собой высокие полые цилиндры из высококачественной мелкопористой глины – каолина. В горлышко колбы с носиком вставляют резиновую пробку с отверстием, куда устанавливают свечу. Стерилизуют аппарат в автоклаве. Место соприкосновения свечи и пробки заливают парафином. На носик колбы надевают резиновую трубку и подсоединяют к насосу. Фильтруемую жидкость наливают в свечу. Из колбы насосом выкачивают воздух, поэтому жидкость под давлением фильтруется в колбу. В фильтрате могут быть только вирусы и фаги – ультрамикроорганизмы, поэтому этим приемом обычно пользуются в вирусологии для отделения вирусов от более крупных микроорганизмов. Свечу после термической обработки можно использовать многократно. Для работы в стерильных условиях используют прибор ламинар. ^ : приборы для стерилизации – медицинский стерилизатор (кипятильник), печь Пастера, аппарат Коха, автоклав, фильтровальная свеча в колбе с носиком. ^ Работа 10. Количественный учёт и определение качественного состава микрофлоры воздуха и почвы методом агаровых пластинок Анализ микрофлоры воздуха Воздух – неблагоприятная среда для микроорганизмов. Он не является средой постоянного обитания, а только временного нахождения или переноса микроорганизмов. В воздухе нет питательных веществ, постоянной оптимальной температуры, часто отсутствует влага, губительно действуют на микробы солнечные лучи. Микроорганизмы попадают в воздух главным образом с пылью или каплями жидкости с поверхности почвы, растений, животных, транспорта, водной поверхности. Микробы в воздухе распространены неравномерно. Количественный и качественный состав микрофлоры воздуха находится в прямой зависимости от микрофлоры почвы, над которой берут пробу воздуха. Количество микроорганизмов зависит от погоды (в дождливую их меньше, чем в сухую), от времени года (летом их больше, чем зимой) и места взятия пробы (над крупными населенными пунктами микробов больше, чем над сельской местностью). Микроорганизмов мало в воздухе над лесами, садами, лугами, озёрами, океаном, высоко в горах и на севере. Микрофлора воздуха характеризуется наличием большого количества шаровидных бактерий (микрококков, диплококков, сарцин, стафилококков), устойчивых к недостатку влаги и ультрафиолетовым лучам и образующих разноцветные пигментированные колонии на питательной среде, встречаются также палочковидные формы и плесневые грибы. За сутки через легкие человека проходит 12-14 тыс. литров воздуха. Воздушным путем распространяются возбудители гриппа, туберкулёза, оспы, пневмонии, коклюша, ангины, катара верхних дыхательных путей и др. ^ . Наиболее простым способом определения общего количества микроорганизмов в воздухе является метод оседания микробов на агаровую пластинку, предложенный Р. Кохом. Метод заключается в том, что чашку Петри с мясопептонным агаром открывают в исследуемом помещении на 5 мин, после чего закрывают крышкой, оборачивают бумагой, переворачивают вверх дном во избежание размыва колоний конденсационной водой, подписывают и помещают в термостат при 28-30 ºС для выращивания микробов, которые оседают на питательную среду вместе с пылью. По количеству выросших колоний можно судить о степени загрязненности воздуха микроорганизмами. ^ . Р.Кох экспериментально установил, что за 5 мин на поверхность 100 см2 оседает столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л, или 0,01 м3 воздуха. Рассчитывают, сколько микробов содержится в 1 м3 воздуха над открытой при посеве чашкой Петри с МПА. Для этого: 1. Через 5-7 дней после посева подсчитывают число выросших в чашке колоний (n). Колония – это потомство одной микробной клетки на питательной среде. 2. Узнают площадь чашки Петри, для чего измеряют диаметр внутренней чашки со средой (5 см2) и рассчитывают по формуле: S чашки Петри = π r2 = 3,14 52 = 78,5 см2. 3. Определяют число микроорганизмов в 1 м3 воздуха. Зная, сколько микробов выросло на площади 78,5 см2, можно пересчитать, сколько их было бы на 100 см2, а это, по методике Коха, соответствует их содержанию в 0,01 м3, значит в 1 м3 их должно быть в 100 раз больше. Рассчитывают число микроорганизмов в 1 м3 воздуха (x) по формуле:  .Воздух считается загрязнённым, если в 1 м3 более 4,5 тыс. микроорганизмов. Делают вывод о количестве микробов в помещении, где проводился анализ микрофлоры воздуха. ^ . Под качественным анализом микрофлоры понимается описание культуральных и морфологических признаков микроорганизмов, что служит основой для определения их видовой принадлежности. Культуральные признаки – это внешний вид колоний при выращивании на различных питательных средах. К культуральным признакам колонии относятся: 1) размер – крупные (диаметр 4-6 мм и более), средние (2-4 мм), мелкие (1-2 мм) и точечные (не более 1 мм) колонии; 2) форма – круглая, овальная, неправильная, амёбовидная, ветвистая, ризоидная и др.; 3) цвет – белый, розовый, жёлтый, оранжевый, красный и др.; 4) профиль или рельеф – плоский, выпуклый, кратеровидный, конусовидный, изогнутый и др.; 5) поверхность – блестящая, матовая, морщинистая, гладкая и др.; 6) консистенция – жидкая, вязкая, пастообразная, сухая, плотная и др. (устанавливается прикосновением к поверхности колонии бактериологической петлей); 7) край – ровный, волнистый, лопастной, бахромчатый и др. (рассматривают, пользуясь лупой или под микроскопом). К морфологическим признакам микробов относятся форма, характер деления и размер клеток, особенности спорообразования и жгутикования, наличие капсулы, включений, окраска по Граму и др. Для описания морфологических признаков из доминирующих колоний готовят препараты-мазки – петлей берут немного микробного материала и тщательно размазывают по стеклу, фиксируют в пламени, окрашивают кристаллвиолетом 30-60 с и рассматривают, пользуясь иммерсионной системой микроскопа. Отмечают форму клеток, наличие или отсутствие спор, капсул и зарисовывают в тетради. Делают выводы о преобладающих формах микроорганизмов в воздухе. Анализ микрофлоры почвы Почва является благоприятной средой для развития микроорганизмов, она обильно населена ими и является основным источником распространения микробов. В почве есть всё необходимое для жизнедеятельности микроорганизмов – органические и минеральные вещества, влага, здесь они защищены от губительных ультрафиолетовых лучей солнца. Количество микробов в почве и их видовой состав зависят от различных почвенно-климатических факторов – механического состава почвы, её влагоёмкости, кислотности вида, обработки, времени года и др. В почве много палочковидных бактерий, актиномицетов, плесневых грибов. ^ . Для определения количества микроорганизмов в 1 г почвы применяют метод питательных агаровых пластинок – поверхностный посев на МПА в чашках Петри, используя предварительное разведение. Из средней пробы исследуемой почвы в день анализа берут навеску 1 г и переносят её в колбу со 100 мл стерильной воды. Колбу взбалтывают 10 мин и дают 1 мин отстояться, получают разведение 1:100 (в 1 мл воды находится 0,01 г почвы). Готовят 4 пробирки с 9 мл воды в каждой и заранее стерилизуют их в автоклаве. Из колбы пипеткой набирают 1 мл почвенной суспензии и переносят в пробирку № 1, раствор при этом разбавляется в десять раз (разведение 1:1000). Другой пипеткой продувают полученную смесь для равномерного перемешивания, затем набирают 1 мл и переносят в пробирку № 2, получая при этом десятикратное разведение предыдущего раствора (1:10 000). Новой пипеткой сначала продувают полученный почвенный раствор, а потом набирают 1 мл и переносят в пробирку № 3 (разведение 1: 100 000). Затем, поступая аналогично, переносят 1 мл из пробирки № 3 в пробирку № 4 (разведение 1:1 000 000), а из неё набирают градуированной пипеткой и переносят на поверхность МПА в чашке Петри 0,1 мл (разведение 1:10 000 000). Стерильным стеклянным шпателем почвенную суспензию растирают лёгкими круговыми движениями досуха по поверхности среды, не повреждая её при этом. Чашки в момент посева только слегка приоткрывают под углом, во избежания посева микробов из воздуха. Посев из каждого разведения желательно проводить хотя бы в две чашки. Чашки Петри с МПА после посева закрывают, оборачивают бумагой, переворачивают вверх дном, чтобы избежать попадания конденсационной воды на поверхность агара, подписывают и помещают в термостат при температуре 28-30 ºС. ^ . Через неделю после посева подсчитывают число выросших на среде колоний. Для удобства подсчитанные колонии можно отмечать тушью на наружной стороне дна чашки. При правильно произведенном посеве число колоний не должно быть более 50-200. Для определения числа микроорганизмов в 1 г почвы нужно умножить число колоний на разведение (на 10 000 000 при посеве из пробирки № 4). ^ . Выбирают наиболее типичные колонии и описывают их культуральные признаки. Готовят из этих колоний препараты-мазки, фиксируют в пламени, окрашивают кристаллвиолетом и рассматривают с помощью иммерсионной системы микроскопа. Описывают и зарисовывают в тетради морфологические признаки почвенных бактерий. Делают выводы о преобладающих в почве формах микроорганизмов. Выделение чистых культур микроорганизмов Чистой культурой называют культуру микроорганизма, полученную из одной клетки или отдельной колонии. Для выделения чистой культуры выбирают изолированную колонию и пересеивают её штрихом на косой МПА в пробирки и культивируют в термостате. Определение вида микроорганизма Конечная цель микробиологического исследования – определение вида выделенного микроорганизма. Для того, чтобы это сделать, необходимо знать: 1) культуральные признаки колонии (только по внешнему виду колоний на МПА можно легко идентифицировать некоторые микроорганизмы, например, Bacillus mycoides образует ветвистые стелящиеся по мясопептонному агару колонии, напоминающие мицелий гриба); 2) морфологические признаки микроорганизмов (по культуральным и морфологическим признакам, часто можно определить лишь род микробов); 3) биохимические признаки - отношение к различным источникам питательных веществ – углеводам, белкам, жирам и др. (для этого чистую культуру пересевают на «пёстрый ряд» различных сред с индикаторами) и физиологические признаки – отношение к кислороду, температуре и кислотности среды. Используя полученную информацию и пользуясь определителем для бактерий, устанавливают род и вид выделенного в чистой культуре микроорганизма. ^ чашки Петри со стерильным мясопептонным агаром, колбы со 100 мл стерильной воды, заражённые 1 г почвы, пробирки с 9 мл воды, простерилизованные в автоклаве (по 4 штуки на стол), стерильные пипетки на 1 мл и шпатели, бумага для обвёртывания чашек, кристаллвиолет. ^ Метод прямого микроскопического учёта количества почвенных микробов предложен С.Н. Виноградским. Выгодно отличается от других методов быстротой анализа и позволяет сделать подсчёт бактерий без приготовления питательных сред и длительного выращивания на них микроорганизмов. При этом учитываются как живые, так и мёртвые микробные клетки. В основе метода лежит использование карболового эритрозина, который окрашивает клетки микробов в розовый цвет, но не окрашивает минеральные почвенные частицы и органическое вещество почвы. Выполнение. 1. 10 г почвы вносят колбу со 100 мл стерильной воды, взбалтывают 5 мин и дают отстояться 30 с. 2. Из жидкой части болтушки стерильной микропипеткой набирают почвенную взвесь. 3. По чистому и хорошо обезжиренному стеклу равномерно распределяют 0,01 мл на площади 4 см2. Для этого подкладывают под стекло миллиметровую бумагу с очерченным прямоугольником размером 14 см. 4. Полученный мазок высушивают на воздухе. 5. Наносят на мазок 1-2 капли полужидкого агара, равномерно распределяют и дают агару подсохнуть. 6. Мазок фиксируют спиртом – покрывают несколькими каплями спирта и ожидают его полного улетучивания. 7. Окрашивают препарат карболовым эритрозином от 30 мин до 24 ч, после чего краску сливают. 8. Препарат очень осторожно промывают тонкой струйкой воды. 9. Просушивают на воздухе, можно аккуратно промакнуть фильтровальной бумагой. 10. Пользуясь иммерсионной системой микроскопа, подсчитывают число клеток в 10-100 полях зрения. Определяют среднее число клеток, приходящееся на одно поле зрения. ^ . Обозначим среднее число микроорганизмов в одном поле зрения через а. Известно, что в 4 см2 содержится 25 000 полей зрения. Следовательно, на площади 4 см2 число микробов составляет 25 000 а штук. На этой площади распределяется сотая миллиметра (0,01 мл). Десять граммов почвы находится в ста миллилитрах воды, следовательно, 1 г почвы – в 10 мл. Чтобы узнать сколько микроорганизмов в 1 г почвы, надо найти, сколько их в 10 мл. В 0,01 мл –25 000 а микробов, значит в 10 мл их в 1 000 раз больше. Таким образом, число микроорганизмов в 1 г почвы (x) рассчитывают по формуле: x = 25 000 000 а, где а – среднее число микробных клеток в одном поле зрения, шт. Готовят препарат, просматривают его в микроскоп, подсчитывают число микробов, хотя бы в 10 полях зрения. Строят в тетради таблицу и заносят в неё свои данные, выводят среднее число микроорганизмов в одном поле зрения, а затем рассчитывают по формуле, сколько микробов содержится в 1 г анализируемой почвы. ^ : колбы со 100 мл воды, простерилизованные в автоклаве, в которые вносят 10 г почвы, полоски миллиметровой бумаги с очерченным прямоугольником размером 1 4 см, стерильные микропипетки на 0,1 мл, баночки с 96º-ным спиртом, полужидким агаром (1:1 000), карболовым эритрозином. ^ Углерод является одним из важнейших элементов, он входит в состав органических веществ. В природе происходит круговорот углерода. Растения строят органическое вещество из углекислого газа атмосферы, превращая лучистую энергию солнца в скрытую энергию химических связей (осуществляют фотосинтез). Только небольшая часть бактерий может использовать солнечную энергию (фотолитоавтотрофы) или энергию окисления неорганических веществ (хемолитоавтотрофы) для самостоятельного синтеза органических веществ из углекислоты. В воздухе содержится 0,03 % СО2. Атмосфера пополняется углекислым газом при вулканических извержениях, сжигании топлива, в результате дыхания людей, животных, растений и микроорганизмов. Почвенная микрофлора разлагает органические вещества, осуществляя минерализацию растительных и животных остатков до углекислого газа. Микробы получают энергию в основном при освобождении ее из безазотистых органических веществ. Различают две формы катаболизма (энергетического обмена): брожение – без доступа свободного кислорода и дыхание, или окисление – с кислородом. При дыхании энергия освобождается полностью и конечными продуктами явялются СО2 и Н2О. Брожение – это разложение органических безазотистых веществ без доступа кислорода с выделением энергии и образованием продуктов, которые дальше в среде без кислорода не разлагаются. Название брожения дается по конечным продуктам (спиртовое, маслянокислое, молочнокислое и др.). ^ Спиртовым брожением называется процесс разложения сахара под действием микроорганизмов на этиловый спирт и углекислый газ. Суммарное уравнение спиртового брожения: С6Н12О6 2СН3СН2ОН + 2СО2. Спиртовое брожение лежит в основе виноделия, пивоварения, хлебопечения. ^ . Для изучения спиртового брожения пользуются синтетической средой следующего состава, г: сахароза (или глюкоза) – 15,0; дрожжи – 0,5; КН2РО4 – 0,3; MgSО4 – 0,1; вода дистиллированная – 100 мл. В колбу вносят дрожжи, добавляют часть отмеренной цилиндром воды и тщательно взбалтывают для лучшего растворения, а затем прибавляют все по рецепту. Колбу закрывают пробкой, в которую вставлена изогнутая трубочка. В открытый конец трубки капают серную кислоту, а затем закрывают его фольгой. В результате этого из колбы будет легко выходить выделяющийся при брожении углекислый газ, но задерживаться пары воды. Колбу взвешивают на технических весах с точностью до 0,01 г, прикрепляют этикетку, на которой указывают массу колбы, номер группы, факультет и фамилию исполнителя, и помещают в термостат при температуре 25 ºС. Элективные условия для прохождения спиртового брожения: 1) высокая концентрация сахара; 2) присутствие в опыте дрожжей – возбудителей спиртового брожения; 3) анаэробные условия; 4) кислая среда за счет КН2РО4; 5) накопление в процессе опыта значительного количества спирта. ^ . Брожение обычно продолжается 2-3 дня. Конец брожения устанавливается по прекращению газообразования. Определение интенсивности брожения. Под интенсивностью брожения понимают количество сброженного сахара в процентах от исходного за определенный промежуток времени. Чтобы определить интенсивность спиртового брожения, необходимо выполнить ряд операций: 1. Определяют массу выделенного углекислого газа. Это можно сделать, подсчитав разность массы бродильной колбы при постановке опыта и после его окончания. а = m1 – m2, где а – масса выделенной углекислоты; m1 – масса колбы при постановке опыта; m2– масса колбы после окончания брожения. По массе выделившегося СО2 можно определить количество образовавшегося в опыте спирта и сброженного сахара, пользуясь суммарным уравнением спиртового брожения С6Н12О6 2С2Н5ОН + 2СО2.
Например, а = 7 г – выделилось 7 г СО2. 2. Рассчитывают массу образовавшегося спирта (x1). 88 г СО2 – 92 г С2Н5ОН; 7 г СО2 – x1г С2Н5ОН. x1  7,3 г спирта.3. Рассчитывают массу сброженного сахара (х2). 88 г СО2 – 180 г С6Н12О6; 7 г СО2 – х2г С6Н12О6. х2 =  14,3 г сахара.4. Определяют интенсивность брожения (х3). Если в 100 мл среды по рецепту 15 г сахара (100 %), то 14,3 г сброженного сахара составляет х3 %. 15 г С6Н12О6 - 100 %; 14,3 г С6Н12О6 - х3 %.  х3  95 %,т. е. интенсивность брожения в примере составляет 95 %. Взвешивают колбы и рассчитывают интенсивность брожения в собственных бродильных колбах. Микроскопирование дрожжей производят методом «раздавленной капли». Для этого со дна сброженной жидкости берут петлей немного осадка и наносят на предметное стекло, добавляют каплю раствора метиленового синего, накрывают покровным стеклом, сверху капают иммерсионное масло и рассматривают с помощью иммерсионного объектива. При просмотре обращают внимание на дрожжевые клетки, находящиеся в стадии почкования. Определяют процентное содержание живых и мёртвых дрожжевых клеток. Мёртвые клетки окрашиваются метиленовым синим, живые не окрашиваются. Делают подсчеты живых и мёртвых клеток в 10 полях зрения, выводят средние значения этих показателей в одном поле зрения и рассчитывают соотношение живых и мёртвых дрожжевых клеток в процентах. Результаты записывают в табл. 1. Таблица 1 ^
Можно приготовить препарат-мазок из колбы, фиксировать в пламени, красить метиленовым синим 2-3 мин. и рассматривать с иммерсией. Возбудителями спиртового брожения являются главным образом дрожжи, реже некоторые плесневые грибы и бактерии. Однако практическое значение имеют только дрожжи. Они встречаются на поверхности растений, плодов, ягод, зерна, в воздухе и почве. Характеристика дрожжей. Относятся к микроскопическим грибам и являются эукариотами. Принадлежат главным образом к роду Saccharomyces. Хлебные (пекарские) дрожжи Saccharomyces cerevisiae одноклеточные, немицеллярные. Клетки их округлой, овальной или слегка удлиненной формы, диаметр 8-10 мкм, имеют хорошо заметное под микроскопом ядро. Дрожжи содержат много запасных веществ – волютин, гликоген, капли жира, зерна белковых веществ. Размножаются обычно почкованием, но могут размножаться спорами. При половом размножении споры образуются после слияния содержимого двух клеток и их деления в сумке, или аске. Неподвижные. Факультативные анаэробы. Хорошо сбраживают моносахариды и дисахариды. Аминогетеротрофы. Ауксоавтотрофы. Мезофилы. Зарисовывают дрожжи в тетради и записывают их характеристику. ^ : колбы на 100 мл и каучуковые пробки с изогнутыми (s-образными) трубками, сахароза или глюкоза, пептон, КН2РО4,MgSО4, дрожжи, колбы с дистиллированной водой, мерные цилиндры на 100 мл, крепкая серная кислота (H2SO4), кусочки фольги, этикетки, покровные стёкла, метиленовый синий. ^ Молочнокислым брожением называется процесс анаэробного разложения углеводов молочнокислыми бактериями с образованием молочной кислоты: С6Н12О6 2СН3СНОНСООН. молочная кислота Молочнокислое брожение лежит в основе переработки молока в молочнокислые продукты, а также силосования и квашения овощей. Для изучения молочнокислого брожения лучше всего в качестве питательной среды пользоваться молоком. В нем имеются все питательные вещества для развития молочнокислых бактерий (лактоза, казеин, кальций, фосфор, витамины). Приготовление молочнокислых продуктов Свежее молоко разливают в три стакана и закрывают их бумажными крышками. В этих стаканах будут готовиться следующие молочнокислые продукты. В первом стакане – простокваша – продукт только молочнокислого брожения в результате естественного скисания молока под действием находящихся в нем молочнокислых бактерий. Крышку стаканчика с молоком подписывают и оставляют при температуре 25-30 º на 18-24 ч для скисания. Во втором стакане – кефир – продукт смешанных брожений (молочнокислого и спиртового). Для его получения стакан с молоком пастеризуют в водяной бане при температуре 60 ºС в течение 30 мин для уничтожения собственных молочнокислых бактерий, затем охлаждают до 25-30ºС и заквашивают кефирными зернами, представляющими собой симбиоз молочнокислых бактерий и кефирных дрожжей (1-2 чайные ложки кефирной закваски на 100 мл молока (молоко можно не пастеризовать)). Подписывают и оставляют при температуре 25-30 ºС на 12-24 ч для скисания. В третьем стакане – ацидофилин – продукт только молочнокислого брожения. Для его приготовления стакан с молоком пастеризуют в водяной бане при температуре 60 ºС в течение 30 мин, затем охлаждают до 35-40 ºС и заквашивают ацидофильной закваской (1 чайная ложка на 100 мл молока). Подписывают и помещают в термостат при температуре 40-45 ºС на 8-12 ч. Все полученные после скисания молочнокислые продукты затем хранят в холодильнике. Исследование молочнокислых продуктов Определение кислотности. Кислотность молока и молочных продуктов выражается в процентах накопившейся молочной кислоты или в градусах Тернера. Градусы Тернера (ºТ) - это величина, показывающая объём децинормальной (0,1 н.) щёлочи (в мл), пошедшей на нейтрализацию кислотности 100 мл молочного продукта. Отмеряют 10 мл молочного продукта цилиндром и переносят в колбу для титрования, добавляют 20 мл дистиллированной воды (пред-варительно ополоснув цилиндр, которым отмеряли молочный продукт), приливают 1-2 капли фенолфталеина и титруют 0,1 н. раствором NaOH при постоянном взбалтывании до появления устойчивой слабо-розовой окраски. Объём щёлочи, пошедшей на титрование, умножают на 10. Определяют кислотность во всех трех стаканах с готовыми молочнокислыми продуктами (простокваша, кефир, ацидофилин). Контролем служит свежее молоко. Если на поверхности продуктов образовалась плёнка, то прежде, чем взять сгусток для титрования, её снимают, затем разбивают сгусток и перемешивают содержимое. Микроскопирование. Молоко – среда, богатая белком и жиром. При высоких температурах происходит денатурация белков, поэтому препараты из молочнокислых продуктов не фиксируют в пламени. 1. Мазок делают очень тонким слоем на сухом обезжиренном стекле. 2. Высушивают мазок только на воздухе (нельзя держать над пламенем). 3. Фиксируют в фиксаторе, состоящем из равных объёмов (1:1) спирта и эфира, погружая препарат в стакан с фиксатором 3-4 раза. Спирт убивает и закрепляет микробный материал на стекле, а эфир обезжиривает препараты. 4. После фиксации дожидаются полного испарения со стекла спирта и эфира. 5. Окрашивают препарат метиленовым синим 2-3 мин. 6. Промывают препарат водой. Просушивают фильтровальной бумагой. Просматривают препараты, пользуясь иммерсионной системой. В образовании молочнокислых продуктов участвуют гомофермен-тативные молочнокислые бактерии. Простокваша содержит почти чистую культуру молочного стрептококка Streptococcus lactis. Клетки молочного стрептококка мелкие (диаметром до 1 мкм), имеют овальную форму, у молодых культур в виде коротких цепочек, а у старых - соединены попарно. Кислотность простокваши 90-120 ºТ. Кефир - молочнокислый продукт смешанных (комбинированных) брожений. Содержит возбудителей молочнокислого брожения – молочный стрептококк Streptococcus lactis (в кефире образует довольно длинные цепочки) и казеиновую палочку Lactobacterium casei, а также возбудителей спиртового брожения – кефирные дрожжи Saccharomyces kefire. Кислотность кефира составляет 80-110 ºТ. Ацидофилин (ацидофильная простокваша) – содержит только молочнокислую бактерию – ацидофильную палочку Lactobacterium acidophilum (длиной 4-5 мкм). Кислотность ацидофилина может достигать 250-300 ºТ. Характеристика молочнокислых бактерий. Грамположительные. Могут быть кокками и палочками. Содержат запасные вещества волютин и гликоген (поэтому хорошо красятся метиленовой синью). Неподвижные, неспоровые, факультативные анаэробы (аэротолеран-ты). Среди них есть мезофилы и термофилы. Источник углерода моно- и дисахариды (глюкоза, фруктоза, лактоза). Источник азота – белки (казеин молока) – аминогетеротрофы. Требовательны к фос-фору, кальцию, витаминам – ауксогетеротрофы. Ацидофилы. Результаты исследований заносят в табл. 2. Таблица 2 ^
Делают рисунки микрофлоры молочных продуктов – простокваши, кефира и ацидофилина и записывают характеристику молочнокислых бактерий. Материалы и оборудование: свежее молоко, стаканы ёмкостью 100 мл, закрытые бумажными крышками с резинками, водяная баня, стаканы с закваской кефирных зерен и ацидофильной палочки, чайные ложки, бюретки для титрования, 0,1 н. раствор NaOH, колбы для титрования, фенолфталеин, фиксатор (смесь спирта и эфира 1:1), метиленовый синий. ^ Маслянокислое брожение – это процесс анаэробного разложения углеводов маслянокислыми бактериями с образованием масляной кислоты и других продуктов по уравнению: С6Н12О6 СН3СН2СН2СООН + СН3СООН +СО2 +Н2. масляная кислота уксусная кислота В природе маслянокислое брожение имеет большое значение как звено в цепи превращений соединений углерода. В то же время в народном хозяйстве маслянокислые бактерии приносят значительный ущерб, вызывая вспучивание сыров, прогоркание молока, порчу консервов, силоса, овощей, картофеля и других продуктов. Вместе с тем масляная кислота требуется для некоторых промышленных целей– её широко применяют в технике, кондитерской и парфюмерной промышленности. Маслянокислое брожение лежит в основе брожения (анаэробного разложения) полисахаридов – крахмала, клетчатки, пектиновых веществ. Брожение крахмала. Крахмал – это полисахарид, запасное ве-щество растительных клеток. Особенно много крахмала в клубнях картофеля. Химизм анаэробного разложения, или брожения крахмала, состоит из двух фаз. Первая фаза – это гидролиз крахмала под действием выделяемых микробами экзоферментов до α-глюкозы: α и β мальтаза (С6Н10О5) n + nН2О n С12Н22О11 + n Н2О nС6Н12О6 крахмал амилаза мальтоза α-глюкоза Вторая фаза – это маслянокислое брожение поглощенной микробами α-глюкозы: С6Н12О6 СН3СН2СН2СООН + СН3СООН +СО2 +Н2. α-глюкоза ^ . Для изучения маслянокислого брожения крах-мала опыт ставят на среде с картофелем. Сырой неочищенный картофель нарезают мелкими кубиками, заполняют ими высокую пробирку на 1/3, добавляют немного мела для нейтрализации масляной кислоты, заливают водой до 2/3 объёма пробирки, закрывают ватной пробкой, оборачивают пробку бумагой, подписывают и пастеризуют пробирку в водяной бане при температуре 80 ºС 10 мин, а затем помещают в термостат при 30-35 ºС. Элективные условия для прохождения в опыте маслянокислого брожения: 1) наличие крахмала как специфического источника углерода, который используется только микроорганизмами, содержащими фермент амилазу, вызывающую гидролиз крахмала до глюкозы; 2) присутствие маслянокислых бацилл на кожуре картофеля; 3) анаэробные условия под высоким столбиком жидкости; 4) нейтральная среда за счёт внесения мела; 5) пастеризация, позволяющая отделить маслянокислые бациллы от неспоровых форм. ^ . Через 5-6 дней брожения отмечают, что часть картофеля под действием СО2 и Н2 всплывает на поверхность среды. Хорошо различим неприятный запах масляной кислоты. Микроскопирование. Исследование маслянокислых бацилл проводят в «раздавленной капле». Для этого петлей делают мазок по стенке в нижней части пробирки со средой и переносят каплю жидкости на предметное стекло. Добавляют к ней каплю крепкого раствора Люголя (KJ + J), накрывают покровным стеклом, сверху на него наносят каплю иммерсионного масла и исследуют препарат. При просмотре обращают внимание на крупные, подвижные палочки, которые под действием йода постепенно замедляют движение и останавливаются. Йод проникает внутрь клеток и окрашивает гранулёзу в сине-фиолетовый цвет (характерная качественная реакция йода на растительный крахмал). На фоне окрашенной части клеток отчетливо выделяется неокрашенная или слегка желтоватая спора. Можно приготовить также препарат-мазок, фиксированный в пламени и окрашенный кристаллвиолетом. Возбудителями маслянокислого брожения являются маслянокислые бациллы. Они были открыты Л. Пастером в 1861 году. Широко распространены в почве, навозе, воде, на разлагающихся органических остатках. Все они относятся к роду Clostridium. Характеристика маслянокислых бацилл. Грамположительные. Представляют собой палочки, подвижные (перитрихи – двигаются кувыркаясь), содержат гранулёзу, споровые – у типичных спора расположена клостридиально, у нетипичных – плектридиально. Облигатные анаэробы. Аминоавтотрофы. Ауксоавтотрофы. Среди них есть мезофилы и термофилы. Брожение крахмала вызывают типичные маслянокислые бациллы Clostridium butyricum. Это крупные палочки (1×8 мкм). Подвижные. В клетках накапливается много запасного крахмалоподобного вещества гранулёзы. При спорообразовании клетки приобретают верете-новидную форму – спора расположена терминально или субтерми-нально, спорообразование клостридиальное. В качестве источника углерода могут использовать моно-, ди- и полисахариды (декстрины, крахмал). Мезофилы. Облигатные анаэробы. Зарисовывают маслянокислые бациллы в тетради, подписывают и приводят их характеристику. ^ : высокие пробирки с ватными пробками, картофель, подставки для резки, скальпели, чашечки с мелом и ложечки, колбы с дистиллированной водой, полоски бумаги для обёртывания пробок, водяная баня, покровные стёкла, крепкий раствор Люголя для окраски гранулёзы или кристаллвиолет. ^ Пектиновые вещества – это межклеточные вещества растительных тканей, склеивающие волокна. У технических культур (лён, конопля, кенаф, джут, канатник и др.) лубяные волокна соединены с кострой и паренхимой при помощи пектиновых веществ. Пектиновые вещества являются сложными полисахаридами. Имеются три типа пектиновых веществ: 1) протопектин – водо-нерастворимая часть клеточной стенки; 2) пектин – водорастворимый полимер галактуроновой кислоты, содержащий метилэфирные связи; 3) пектиновая кислота – водорастворимый полимер галактуроновой кислоты, свободный от метилэфирных связей. Пектиновые вещества разлагаются микроорганизмами. Брожение пектиновых веществ происходит в две фазы. Первая фаза – гидролиз пектиновых веществ до моносахаров под действием экзоферментов, выделяемых микроорганизмами: протопектиназа пектаза Протопектин + nН2О пектин + nН2О пектиназа С46Н68О40 + 10Н2О 4СНО(СНОН)4СООН + С6Н12О6 + пектиновая галактуроновая галактоза кислота кислота С5Н10О5 + С5Н10О5 + 2СН3СООН + 2СН3ОН арабиноза ксилоза уксусная кислота метиловый спирт Вторая фаза - это маслянокислое брожение образовавшихся моносахаров (галактозы, арабинозы, ксилозы): С6Н12О6 (С5Н10О5) СН3СН2СН2СООН + СН3СООН +СО2 + Н2 Брожение пектиновых веществ происходит при водяной мочке льна. ^ . Для изучения брожения пектиновых веществ в лабораторных условиях воспроизводят процесс водяной мочки льняных стеблей. Для этого готовят снопики из сухой льняной соломки (высотой 6-8 см и толщиной соразмерно с диаметром пробирки), перевязывают их в двух местах нитками и кипятят 3-5 мин для удаления экстрактивных (легко сбраживающихся) веществ. Вода при этом становится жёлто-зелёного цвета. Помещают снопики в высокие пробирки, заливают на 2/3 их объёма водой, закрывают ватными пробками и прогревают в кипящей водяной бане до появления в жидкости пузырьков. Затем пробирки охлаждают под краном и в снопик вводят свежий длинный стебель льняной соломки для заражения. Пробирки вновь закрывают ватными пробками, оборачивают их бумагой, подписывают и помещают в термостат при температуре 28-30 ºС. Элективные условия для брожения пектиновых веществ: 1) питательная среда – льняные волокна, освобожденные кипячением от экстрактивных веществ; 2) присутствие бацилл мочки льна на стеблях и особенно на соломке, используемой для заражения; 3) анаэробные условия благодаря высокому столбику жидкости в пробирке; 4) устранение после кипячения и пастеризации неспоровых форм. ^ . Брожение пектиновых веществ заканчивается в пробирках через 7-8 дней. Снопики всплывают, вытесняемые образовавшимися при брожении газами. Так как брожение пектиновых веществ сводится к маслянокислому брожению, неприятный запах масляной кислоты легко улавливается. Микроскопирование возбудителей брожения пектиновых веществ. Готовят препарат-мазок. Для этого извлекают снопик из пробирки, достают из него соломинку и теребят. Затем растрёпанным участком делают мазок по предварительно обезжиренному предмет-ному стеклу. Мазок высушивают, фиксируют в пламени и окрашивают кристаллвиолетом 30-60 с. Рассматривают с помощью иммерсионной системы микроскопа. Брожение пектиновых веществ осуществляют бациллы мочки льна. Они были открыты С.Н. Виноградским в 1895 г. К бациллам мочки льна относятся Clostridium pectinovorum и Clostridium felsineum. Характеристика бациллы мочки льна. Являются нетипичными маслянокислыми бактериями. Углерод используют только в виде пектиновых веществ. Грамположительные. Подвижные палочки размером 10-15 мкм. Спорообразование плектридиальное – спора находится на конце клетки, и они имеют вид ракетки или барабанной палочки. Содержат гранулёзу. Clostridium pectinovorum представляют собой крупные палочки с длинной вегетативной частью. Clostridium felsineum – палочки меньшего размера с более короткой вегетативной частью, эти бактерии более кислотоустойчивые. В процессе водяной мочки льна они сменяют предыдущие бактерии, поэтому встречаются чаще в перекисших пробирках. Бациллы мочки льна – облигатные анаэробы. По отношению к источнику азота малотребовательны, способны усваивать любые его формы. Зарисовывают бациллы мочки льна в тетради, подписывают и дают им характеристику. ^ : льняная соломка, высокие пробирки с ватными пробками, ножницы, нитки, пинцеты, водяная баня, кристаллвиолет. Работа 16. Брожение клетчатки Клетчатка, или целлюлоза представляет собой сложный поли-сахарид (С6Н10О5)n, входящий в состав оболочек растительных клеток. Растения на 40-70 % состоят из клетчатки. На долю этого вещества приходится более 50 % всего органического вещества биосферы. Ог-ромное количество целлюлозы в виде растительных остатков и отхо-дов попадает в почву и водоёмы, где разлагается микроорганизмами – бактериями, актиномицетами, микроскопическими грибами. В анаэробных условиях происходит брожение клетчатки. Химизм разложения состоит из двух фаз. Первая фаза – гидролиз клетчатки под действием экзоферментов, выделяемых микроорганизмами, до глюкозы: целлюлаза целлобиаза (С6Н10О5)n + nН2О nС12Н22О11 + nН2О nC6Н12О6. целлюлоза целлобиоза β-глюкоза Вторая фаза - это дальнейшее сбраживание глюкозы по типу маслянокислого брожения с образованием различных органических веществ: С6Н12О6 СН3СН2СН2СООН + СН3СООН + СН3^ β-глюкоза масляная кислота уксусная кислота молочная кислота СН3СН2ОН + НСООН + СО2 + Н2. муравьиная кислота ^ . Для получения накопительной культуры анаэробных целлюлозоразлагающих бактерий пользуются питательной средой Омелянского следующего состава, г: (NH4)3PO4 – 1,0, K2HPO4 – 1,0, MgSO4 – 0,5, NaCl – 0,1, CaCO3 – 2,0, FeSO4 – 2 капли 1%-ного раствора, пептон – 0,6, дистиллированная вода – 1000 мл. При подготовке опыта среду разливают в колбы на 2/3 объема. Добавляют 0,5-1 г почвы и кипятят колбы со средой и почвой 5 мин для уничтожения неспоровых форм. Вносят в колбу несколько полосок фильтровальной бумаги. Доливают доверху питательную среду и закрывают колбу пробкой с затвором для выхода газов. Помещают в термостат при температуре 30-35 ºС. Элективные условия для развития целлюлозоразлагающих бацилл: 1) источник углерода – клетчатка (фильтровальная бумага); 2) внесение целлюлозоразлагающих бацилл с почвой; 3) анаэробные условия; 4) минеральные элементы и пептон для питания; 5) освобождение от неспоровых форм при кипячении. ^ . Опыт продолжается 2-3 недели. Микроскопирование. Со дна колбы извлекают пинцетом кусочек разлагающейся бумаги и делают ею мазок по обезжиренному предметному стеклу. Высушивают, фиксируют в пламени, окра-шивают кристаллвиолетом (30-60 с) и исследуют с помощью иммер-сионной системы микроскопа. Брожение целлюлозы вызывают целлюлозоразлагающие бациллы. Они широко распространены в почве, навозе, речном иле, сточных водах. К целлюлозоразлагающим бациллам относятся: Clostridium omelianskii (открытый В.Л. Омелянским в 1902 г.) и Clostridium dissolvens – эти две формы мезофилы – оптимальная температура для их развития 30-40 ºС. К термофильным относится Clostridium thermocellum – оптимальная температура около 60 ºС. В приготовленной колбе при невысоких температурах инкубации будут развиваться первые две формы. Характеристика целлюлозоразлагающих бацилл. Относятся к маслянокислым бактериям, но нетипичным – углерод используют только в виде клетчатки. Это грамположительные длинные палочки, подвижные, спорообразование плектридиальное (крупная спора находится на конце тонкой вегетативной клетки), облигатные анаэробы. Clostridium omelianskii – имеет круглую правильной формы спору, а у Clostridium dissolvens – спора грушевидной, чуть сплюснутой формы. Зарисовывают в тетради и описывают целлюлозоразлагающие бациллы. ^ : колбы ёмкостью 100 мл с резиновой пробкой и затвором, (NH4)3PO4, K2HPO4, MgSO4, NaCl, FeSO4, CaCO3, пептон, почва, полоски фильтровальной бумаги, пинцеты, кристаллвиолет. ^ Аэробное разложение, или окисление клетчатки (целлюлозы) проходит в две фазы. Первая фаза – это гидролиз под действием выделяемых микроорганизмами экзоферментов до β-глюкозы, а вторая фаза – это полное окисление поглощенной микробами β-глюкозы до углекислого газа и воды: целлюлаза целлобиаза (С6Н10О5)n + nН2О nС12Н22О11 + nН2О целлюлоза целлобиоза nC6Н12О6 + О2 СО2 + Н2О. β-глюкоза ^ . В работе используют метод почвенных пластинок Кристенсена. Чашку Петри заполняют почвой слоем около 1 см, предварительно увлажнённой водой или средой Гетчинсона следующего состава, г: NaNO3 – 2,5, K2HPO4 – 1,0, MgSO4 – 0,3, CaCl2 – 0,1, NaCl – 0,1, FeCl3 – 0,01, вода дистиллированная – 1000 мл. Поверхность почвы выравнивают шпателем, сверху накладывают кружок фильтровальной бумаги и плотно прижимают к поверхности среды, чашки помещают в термостат, при 27-30 ºС. Периодически смачивают почву в чашке водой, но не допускают того, чтобы вода полностью заливала фильтровальную бумагу, и не развивались бы на фильтровальной бумаге анаэробные целлюлозоразлагающие бактерии. ^ . Через 4-5 суток после постановки опыта на бумаге появляются пигментные зоны и ослизненные участки, указывающие на разрушение клетчатки. Через 1,5-2 недель их можно микроскопировать. Микроскопирование. Для микроскопического изучения аэробных целлюлозоразлагающих бактерий бактериологической петлей берут немного слизи, покрывающей фильтровальную бумагу, растирают её на предметном стекле, фиксируют мазок в пламени и окрашивают кристаллвиолетом 30-60 с. Препарат рассматривают, пользуясь иммерсионной системой микроскопа. Возбудителями аэробного разложения клетчатки являются бактерии, актиномицеты, плесневые грибы. Наибольшее значение имеют бактерии. К ним относятся миксобактерии, цитофаги и вибрионы. Миксобактерии образуют яркоокрашенные слизистные плодовые тела на разлагающейся древесине. На фильтровальной бумаге в нашем опыте развиваются в основном цитофаги и вибрионы. Цитофаги – Cytophaga – крупные длинные слегка изогнутые палочки с острыми краями. Вибрионы: Cellvibrio – мелкие тонкие изогнутые клетки и Cellfalcicula – мелкие короткие толстые изогнутые клетки с заостренными концами. Характеристика аэробных целлюлозоразлагающих бактерий: грамотрицательные, палочки и вибрионы, подвижные, неспоровые. Зарисовывают и описывают аэробные целлюлозоразлагающие бактерии в тетради. ^ : чашки Петри, среда Гетчинсона, дистиллированная вода, почва, простерилизованные кружки фильтровальной бумаги, шпатели, кристаллвиолет. ^ Типичным примером процессов неполного окисления является окисление спирта в уксусную кислоту: СН3СН2ОН + О2 СН3СООН + Н2О. При неполном окислении вещества окисляется не до СО2 и Н2О, а до различных органических кислот, имеющих применение в народном хозяйстве. Окисление спирта в уксусную кислоту используют в производстве уксуса из вина и спирта. ^ . В колбы наливают по 30-50 мл непасте-ризованного пива или лёгкого вина (виноградного, яблочного или ягодного) и добавляют 5-10 мл 10 %-ной уксусной кислоты для подкисления среды. Помещают в термостат при температуре 25-30 ºС. ^ . Через несколько дней (2-6) на поверхности среды появляется серовато-белая плёнка уксуснокислых бактерий. Препаровальными иглами переносят небольшие кусочки плёнки с поверхности скисшего пива или вина в фарфоровую чашку и на предметное стекло. Определение вида уксуснокислых бактерий. Добавляют к плёнке в фарфоровой чашке несколько капель раствора Люголя и устанавливают реакцию на йод. Микроскопирование. Для микроскопического исследования бактериальную пленку на предметном стекле аккуратно расправляют, фиксируют в пламени, окрашивают кристаллвиолетом 30-60 с, рас-сматривают с иммерсией. Уксуснокислые бактерии широко распространены в природе, встречаются на зрелых плодах, ягодах, в квашеных овощах, вине, пиве, квасе. Они были открыты Л. Пастером в 1868 г. На пиве и вине хорошо развиваются: Acetobacter aceti – типичные уксуснокислые бактерии, образуют на поверхности гладкую слизистую пленку, окрашивающуюся йодом в жёлтый цвет. Развиваются при относительно низких температурах (20-22 ºС); Acetobacter pasteurianum – образуют на поверхности среды морщинистую сухую плёнку, окрашивающуюся йодом в синий цвет. Оптимальная температура развития 30-34 ºС. Характеристика уксуснокислых бактерий. Грамотрицательные. Представляют собой короткие палочки, расположенные цепочками, неспоровые, в основном подвижные, строгие аэробы – образуют плёнки на поверхности среды, отличаются высокой устойчивостью к кислотам (ацидофильные). Зарисовывают и описывают уксуснокислые бактерии в тетради. ^ : пиво или лёгкое вино в плоскодонных колбах на 100 мл, 10 %-ная уксусная кислота, цилиндры, препаровальные иглы, кристаллвиолет, раствор Люголя, фарфоровые чашки. ^ Жир входит в состав клеток всех организмов как конституционное и запасное вещество. В почву жир попадает с растительными, животными и микробными остатками. Микроорганизмы, окисляющие жир, выделяют фермент липазу, который вызывает гидролиз жира до глицерина и жирных кислот. Продукты гидролиза в дальнейшем постепенно полностью окисляются до углекислого газа и воды: липаза С3Н5(С17Н35СОО)3 + 3Н2О С3Н5(ОН)3 + тристеарин глицерин 3С17Н35СООН + О2 СО2 + Н2О. стеариновая кислота Постановка опыта. Приготавливается среда Рана, г: К2НРО4 – 5; (NН4)3РO4 – 5; CaCl2 – 1; MgSO4 – 1; NaCl – следы; FeCl3 – следы; вода дистиллированная - 1000 мл. Среду наливают в колбы по 30 мл и заражают 1/3 чайной ложки почвы. Вносят 1 мл касторового (или подсолнечного) масла. Помещают в термостат при 25-30 ºС. ^ . На 7-10-е сутки по мере развития жироокисляющих микроорганизмов в прозрачном масле появляются белые хлопья нерастворимых в воде жирных кислот. Микроскопирование. Готовят препарат-мазок с поверхности среды в колбе, фиксируют в фиксаторе из спирта и эфира несколько минут, окрашивают фуксином (30-60 с), исследуют с иммерсионной системой. Кроме того, используется простокваша, которая хранится при комнатной температуре, на её поверхности появляется кремовая бархатистая морщинистая плёнка молочной плесени, из которой готовят препарат мазок, фиксируют в фиксаторе, окрашивают метиленовым синим (2-3 мин) и рассматривают с иммерсией. Окисление жира в почве происходит под действием некоторых бактерий и плесневых грибов. Из бактерий наиболее энергично в почве разлагает жиры Pseudomonas fluorescens – мелкая, подвижная, неспоровая аэробная палочка, образующая в питательной среде зеленоватый пигмент. На молочном продукте легко можно найти молочную плесень Oidium lactis – относится к дрожжеподобным грибам, растёт в виде крупных длинных нитей, размножается делением и почкованием. Зарисовывают все микробы в тетради и подписывают. ^ : колбы на 100 мл, среда Рана, касторовое или подсолнечное масло, стаканчик на 100 мл с простоквашей и плёнкой на её поверхности, фиксатор из спирта и эфира (1:1), фуксин, метиленовый синий. |
|||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям