Грамположительные кокки
|
|
Скачать 1.2 Mb.
|
^
Легионеллы относятся к отделу Gracilicutes, семейству Legionellaceae, роду Legionella, который представлен 9 видами: L.pneumophila, L.bozemanii, L.micdadei, L.dumoffii, L gormanii,L.longbeachae, L.jordanis, L.wadsworthii, L.oakridgensis. Легионеллы представляют собой мелкие грамотрицательные палочки длиной 2-3 мкм ( иногда выделяются более крупные формы до 20-50 мкм) с выраженной тенденцией к полиморфизму. Бактерии хорошо окрашиваются по Романовскому-Гимзе, содержат жировые включения, окрашиваемые суданом черным; по Граму окрашиваются отрицательно. Легионеллы подвижны, спор не образуют.. Бактериальная клетка легионелл обладает целым набором факторов патогенности (эндотоксин, цитотоксин, гемолизин, протеаза, действующая на белки сыворотки крови). Легионеллы являются аэробами, хорошо растут в присутствии СО2, весьма пребовательны к условиям культивирования; растут только на специальных сложных средах. Для культивирования требуются максимально обогащенные среды со специальными добавками, такими как L-цистеин, пирофосфат железа. Наиболее оптимальной средой является угольно-дрожжевой агар (УДА). В целом для всей группы легионелл наиболее надежным методом считается культивирование в куриных эмбрионах. Материал для исследований может быть представлен плевральной жидкостью, реже мокротой, кровью, мочой. Для исследований также используют транстрахеальный аспират, бронхоскопический. легочный биопсийный и аутопсийный материалы. В диагностике применяют бактериологический, биологический (более надежный), серологический методы. Микроскопический метод. Бактерии окрашиваются по Романовскому-Гимзе и Хименсу(исключение –нативный материал из мокроты). Для экспресс диагностики можно мазки импрегнировать серебром или люминесцентной сывороткой. Бактериологический метод. Первичный посев производят на забуференный УДА со всеми добавками и рН 6.9.первичный материал растет медленно, поэтому чашки инкубируют в течение 2-14 дней при 35°С во влажной атмосфере. Выросшие колонии обычно менее 2 мм в диаметре, полупрозрачные, бесцветные либо с сероватым оттенком, гладкие блестящие с приподнятым краем. На средах с тирозином образуют колонии с коричневым пигментом. Некоторые виды легионелл обладают аутофлюоресценцией – УФ лучи возбуждают бело-голубое свечение. Культуру, выросшую на УДА подвергают идентификации МФА (метод флюоресцирующих антител) с использованием люминисцирующих сывороток к основным серогруппам легионелл. В спорных случаях используют анализ жирных кислот, ДНК-гомологии, иммунологическое тестирование с набором поли- и моновалентных сывороток. Определение чувствительности к антибиотикам не рекомендуется, так как результаты исследований in vitro могут не совпадать с клинической эффективностью. Серологическая диагностика. Наиболее распространен непрямой вариант МФА и РНГА. Также используется ИФА. Четырехкратное нарастание титров антител (сероконверсия) свидетельствует о наличии активного инфекционного процесса и позволяет с высокой степенью надежности устанавливать или подтверждать диагноз. Недостатком этих методов следует считать ретроспективный анализ диагностики, так как выраженную сероконверсию можно выявить лишь на 2-3 неделе заболевания. ^ Убитую кипячением культуру легионелл наносят на предметное стекло и фиксируют. На препарат наносят сыворотку больного с разведением 1:32 и более. После 15 минут инкубации наносят люминесцирующий иммуноглобулин против глобулинов человека, повторно инкубируют, промывают в фосфатном буфере и микроскопируют. Максимальное разведение сыворотки, в котором обнаруживается специфическое свечение, является титром специфических антител (диагностический титр-1:64). ^ Наибольшее распространение получил прямой метод МФА, который используется для ранней диагностики легионеллеза и при проведении моторинга за различными водными системами и сооружениями на наличие легионелл. По чувствительности не уступает культуральному методу и позволяет обнаружить возбудителей в нативном материале (за исключением мочи) независимо от их жизнеспособности. На приготовленный из нативного материала и фиксированный в ацетоне мазок наносят каплю легионеллезной люминесцирующей сыворотки и инкубируют во влажной камере 15-20 минут при 37°С. После промывки в фосфатном буфере мазок просматривают в люминесцентном микроскопе. В положительных случаях обнаруживается изумрудно-зеленое свечение легионеллезных бактерий. ИФА позволяет выявить легионеллезный антиген в клиническом материале, включая мочу, и представляет собой прямой вариант реакции. ^ является специфическим и чувствительным методом определения легионелл в материале различного происхождения. В реакции используются золотистые стафилококки, меченные легионеллезными иммуноглобулинами. ^ Обоснование темы: Рост заболеваемости туберкулёзом и микобактериозами в России, выраженная резистентность микобактерий к ПТП (противотуберкулезным препаратам) обязывают всесторонне изучать биологию микобактерий, современные методы диагностики туберкулеза, микобактериозов, лепры. ^ �: сформировать представление о биологических свойствах возбудителей туберкулёза, микобактериозов, лепры, особенностях формирования инфекционного процесса, защитных реакций организма, научить микробиологической диагностике, основам рациональной антимикробной терапии, специфической профилактике. Студент должен знать:
Студент должен уметь:
4. Обогащать исследуемый материал, делать посевы на соответствующие питательные среды. ^ 1.Таксономическая характеристика, классификация микобактерий. 2.Роль микобактерий в патологии человека. 3.Биологические свойства микобактерий. 4.Патогенез поражений при туберкулезе, микобактериозах, лепре. 5.Особенности иммунитета при туберкулёзной инфекции и микобактериозах. 6.Микробиологическая диагностика туберкулёза, микобактериозов, лепры. 7.Антимикробная терапия, профилактика туберкулёза, микобактериозов, лепры. Резистентность микобактерий к ПТП (противотуберкулёзным препаратам). ^ 1. Промикроскопировать демонстрационный мазок, окрашенный по Цилю-Нильсену. 2. Провести обогащение (методами осаждения и флотации) мокроты. 3. Приготовить и окрасить мазок по Цилю-Нильсену, промикроскопировать. Зарисовать препарат. 4. Составить алгоритм бактериальной диагностики ТМБ и НТМБ. 5. Оценить рост ТМБ на среде Левенштейна-Йенсена. 6. Оценить чувствительность микобактерий к антимикробным средствам. 7. Оценить результат РНГА при диагностике туберкулеза. 8. Изучение биопрепаратов используемых для диагностики и профилактики туберкулёза. 9. Решение ситуационных задач. Вопросы для самоконтроля: - Каковы особенности морфологических и тинкториальных свойств возбудителя туберкулёза? - Для чего следует проводить обогащение исследуемого материала? - Какие существуют способы обогащения мокроты? - Каковы принципы конструирования сложных питательных сред для выделения микобактерий. - Каковы культуральные особенности возбудителя туберкулёза? - В чем состоит сущность метода Прайса? - Как выглядят вирулентные микробы при микроскопии? - Перечислите современные методы диагностики? - В каком возрасте проводят первичную вакцинацию против туберкулеза? - Какой характер иммунитета при туберкулёзе? - Каковы критерии устойчивости к ПТП? - Какие методы определения чувствительности микобактерий к ПТП вы знаете? - Какие микобактерии характеризует уреазная активность? - Какие микобактерии образуют желто-оранжевый пигмент при культивировании? - Какие микобактерии образуют никотиновую кислоту? - От чего зависит развитие туберкулоидной или лепроматозной формы проказы? - Какие из НТМБ способны инфицировать раны, полученные при купании в водоемах? ^ В состав рода микобактерий включены кислото - и спиртоустойчивые аэробные неподвижные грамположительные прямые или изогнутые палочковидные бактерии. Микобактерии являются возбудителями туберкулеза, микобактериозов, лепры. Их характеризует высокое содержание липидов и восков (до 60%) в клеточной стенке. Растут медленно или очень медленно. Забор материала. В качестве материала чаще используют мокроту, реже мочу, гной, спинномозговую жидкость, испражнения. Можно исследовать промывные воды бронхов (при ларингоскопии), экссудат из плевральной полости, пунктаты из закрытых натечников, асцитную жидкость, кровь, кусочки биопсируемых (при операции) тканей. Мокроту забирают в стерильную баночку или карманную плевательницу, закрывают пробкой. Прилагается бланк лечебного учреждения с названием материала, ФИО больного, возраст, группа диспансерного учета, указывается цель исследования и предполагаемый диагноз. Материал для транспортировки на дальние расстояния консервируют глицерином, 2% борной кислотой или 10% раствором фосфата натрия. Правила забора мокроты. 1. Утром больной должен тщательно почистить зубы, прополоскать рот . 2. Накануне и рано утром принять отхаркивающее. 3. При скудном отделении мокроты можно провоцировать усиленную секрецию с помощью ингаляции смеси (150г NaCl, 10г бикарбоната натрия в 1 литре воды). 4. Для исследования лучше брать утреннюю порцию мокроты. Однако можно собирать её и в течение суток, сохраняя на нижней полке холодильника (не замораживать!). У детей, не умеющих отхаркивать мокроту, исследуют промывные воды желудка, взятые натощак. Через толстый зонд предварительно вводят 100-150мл 1% раствора бикарбоната натрия (для нейтрализации кислой реакции). Исследовать в тот же день! При хранении происходит деструкция микобактерий под влиянием ферментов желудочного содержимого. Лабораторная диагностика включает бактериоскопический, бактериологический, биологический и аллергический методы и предусматривает 3 этапа идентификации микобактерий:
В целях повышения чувствительности метода применяют разнообразные способы обогащения материала (для мокроты метод гомогенизации и осаждения, флотации, обогащение мочи достигают центрифугированием, обогащение спинномозговой жидкости заключается в отстаивании в холодильнике 18-24 часа до образования фибриновой пленки, к которой прикрепляются микобактерии). Обогащение мокроты. Гомогенизация. К суточной порции мокроты добавляют равный объем 1% раствора едкого натра (или антиформина), флакон плотно закрывают пробкой и энергично встряхивают в течение 10-15 минут. После центрифугирования и нейтрализации кислотой из осадка готовят мазки и окрашивают по Цилю-Нильсену. ^ : мокроту гомогенизируют и прогревают при 55°С 30 минут на водяной бане. Затем добавляют 1-2 мл ксилола, дистиллированной воды, встряхивают 10 минут и отстаивают 20 минут при комнатной температуре. На поверхности жидкости появляется сливкообразный слой - флотационное кольцо, содержащее микобактерии туберкулёза. Кольцо отсасывается пастеровской пипеткой на 2 предметных стекла, нагретых до 60°С. На стёкла материал наносят 5-6 раз и окрашивают, после фиксации, по Цилю-Нильсену. В настоящее время наиболее результативным методом бактериоскопической диагностики является метод люминесцентной микроскопии, преимущество которого заключается в его высокой чувствительности, особенно при микроскопии материала, содержащего малое количество микобактерии, в возможности выявлять микобактерии с измененными культуральными и тинкториальными свойствами. ^ Посев патологического материала на искусственные питательные среды является обязательным в тех случаях, когда микроскопическое исследование дает отрицательный результат. Культуральные методы отличаются большей чувствительностью, чем бактериоскопия. Они позволяют выделить микобактерии при наличии в исследуемом материале нескольких десятков жизнеспособных микобактерий, однако методика предварительной обработки материала довольно сложна, для выделения требуются специальные питательные среды ( Среда Левенштейна-Йенсена - яично-картофельноглицериновая; среда Петраньяни - цельное молоко, картофельный крахмал, пептон, мелко нарезанный клубень картофеля, куриные яйца, глицерин, малахитовый зеленый; среда Гельберга - яично-молочно-картофельная среда; Финна II ( подобна среде Левенштейна-Йенсена, но вместо аспарагина в ней используют глутамин натрия). На яичных питательных средах растут все виды микобактерий, а также культуры родственных микроорганизмов - родококки, коринебактерии. Наибольшее распространение получила среда Левенштейна-Йенсена, которая рекомендована ВОЗ в качестве стандартной среды для выращивания бактерий туберкулёза. Недостатком метода является длительный период культивирования 1,5 до 12 недель. Основным преимуществом культурального метода является возможность получения чистой культуры микобактерий, что позволяет провести её идентификацию, изучение вирулентности. Посевы просматриваются каждую неделю, отмечая время появления микробного роста. Наиболее часто признаки роста микобактерий туберкулёза появляются на 20-40й день, в виде сухого бугристого налета, белого или слегка желтоватого цвета, напоминающего цветную капусту. Микобактерии встречаются в R и S-форме, более вирулентной является R-форма. При идентификации выделенной культуры и дифференциации её от других микобактерий учитывают морфологические, тинкториальные особенности, характер и скорость роста на питательных средах, биохимические свойства и вирулентность для лабораторных животных. Из биохимических свойств чаще всего определяют способность синтезировать никотиновую кислоту (проба Конно), что характерно для М.tuberculosis (к культуре в жидкой питательной среде +1мл раствора KCN и 1мл хлорамина, через несколько минут появляется ярко-желтая окраска). Для ускоренной диагностики используют метод Прайса и метод Школьниковой. Метод Прайса: на предметных стеклах (ближе к одному концу) делают толстые мазки из исследуемого материала. Высушенные мазки обрабатывают 2-6% Н2SO4 и нейтрализуют, опускают во флаконы с гемолизированной кровью, на 48-72 часа помещают в термостат, через 7-14 дней вирулентные штаммы образуют микрокультуры имеющие вид жгутов или кос (за счет корд-фактора). Метод Школьниковой: глубинный посев в гемолизированную кровь: обработанный серной кислотой материал сеют в пробирки с цитратной гемолизированной кровью. Через 6-8 дней пребывания в термостате материал центрифугируют, из осадка формируют толстый мазок, окрашивают по Циль-Нильсену. ^ : наиболее чувствительным методом выявления микобактерий туберкулёза в патологическом материале является заражение морских свинок - биологическая проба. Туберкулёзные изменения в органах морской свинки могут быть обнаружены при содержании в 1мл материала даже единичных (1-5) микобактерий. Исследуемый материал обрабатывают Н2SO4, нейтрализуют её и вводят 2-1,5мл двум морским свинкам с отрицательной туберкулиновой пробой подкожно в область паха. В месте введения на 6-10 день появляется уплотнение, увеличивающееся со временем, на месте которого образуется незаживающая язва, наблюдается увеличение регионарных лимфатических узлов. Если животное не гибнет, то через 3 месяца животное забивают, проводят макро- и микроскопические исследования органов, делают посевы. Кожная проба. Доступным, но имеющим ограниченное диагностическое значение, является метод кожных проб. Наиболее чувствительной является внутрикожная проба Манту. В России при массовой туберкулино-диагностике всё чаще стали использовать безигольный метод внутрикожного введения туберкулина с помощью механического инъектора БИ-1М, заряжённого определённой дозой туберкулина. Туберкулин - общее название препаратов, получаемых из культур микобактерий туберкулёза разных видов. (Впервые получен в 1870 году Р. Кохом.) Старый туберкулин Коха - АТК (Alt-tuberculinum Koch) - недостаток в большом количестве балластов. В 1934 году Сейберт и сотрудники получили PPD (Purificol Protein Derivative), представляющий собой дериват протеина микобактерии туберкулёза, обладающих стабильной биологической активностью, лишённый сенсибилизирующих свойств. Отечественный (ППД-Л) был приготовлен в 1939 году. М.А. Линниковой, который является препаратом массового применения. В практике туберкулин применяют в целях диагностики, для определения инфицированности населения, отбора лиц, подлежащих противо-туберкулёзной вакцинации, изучения её эффективности. Реакция считается отрицательной при отсутствии инфильтрата через 48-72 часа, уколочной при папуле в 1мм, сомнительной при папуле D 2-4мм, положительной - 5-10мм (нормэргическая), гиперэргической при папуле 17мм у детей и 21 мм у взрослых. ^ Используют РНГА, ИФА. Для выявления микобактерий рекомендуется высокочувствительная и высокоспецифическая ПЦР (метод генодиагностики). Микробиологическая диагностика лепры (болезни Хансена) Микобактерии лепры - прямые или слегка изогнутые палочки длиной от 1 до 8 мкм, диаметром 0,2-0,5 мкм, в мазках окрашенных по Цилю-Нильсену располагаются параллельными группами «пачки сигар» или шаровидными скоплениями до 200 мкм, окруженными полупрозрачной неокрашивающейся массой. Материал для исследований получают соскобом слизистой оболочки носовой перегородки, выделением тканевого сока после 2-3 мм надрезов пораженных тканей или пункцией увеличенных лимфатических узлов. Выращивание в искусственных условиях возможно на глицериново-картофельном и кровяных агарах, яичных средах. Наибольшее распространение получили агар, дополненный сывороткой человека и среда Вассерманна. Культуры развиваются медленно, рост наблюдается через 6-8 недель в виде сухого морщинистого налета. В 1960 году была создана экспериментальная модель на белых мышах с внесением материала в подушечки лапок, в 1971 году – на броненосцах. Для дифференциальной диагностики туберкулоидной формы применяют кожную пробу с аллергеном М.leprae (лепроминовая проба), которая всегда отрицательная при лепроматозной форме. ^ Обоснование темы. К зооантропонозам относится ряд заболеваний человека, при которых источником возбудителя являются инфицированные животные. Среди зооантропонозов отмечены заболевания, характеризующиеся высокой контагиозностью, тяжелой клинической картиной и высокой летальностью (особо опасные инфекции - /ООИ/). Цель обучения: раскрыть механизмы патогенеза заболеваний на основе биологических свойств микроорганизмов, показать особенности распространения инфекции, иммунного ответа организма. Дать основы лабораторной диагностики зооантропонозов. Студент должен знать:
Студент должен уметь
|
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
 |
●Условно-патогенные кокки, способные вызывать заболевания различной локализации: Стафилококки Стрептококки |
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям