Грамположительные кокки
|
|
Скачать 1.2 Mb.
|
|
Микробиологическая диагностика трихомониаза В связи с широким распространением трихомониаза мочеполовых органов, возможностью малосимптомного его течения, особенно у мужчин, тяжестью осложнений, в том числе развитием бесплодия, лабораторная диагностика этого заболевания занимает одно из ведущих мест в борьбе с ним. Клинический диагноз трихомониаза во всех случаях должен быть подтвержден обнаружением типичных форм влагалищных трихомонад при лабораторном исследовании. Материал для исследования: мазки со слизистой оболочки урогенитального тракта. Методы диагностики:
Микроскопическое исследование нативного препарата Методика: материал наносят на слегка подогретое предметное стекло, смешивают с каплей теплого изотонического раствора натрия хлорида, накрывают покровным стеклом и микроскопируют. Ввиду того, что при длительном пребывании препаратов при комнатной температуре трихомонады довольно быстро теряют подвижность, исследование следует проводить непосредственно после получения материала. ^ в нативных препаратах влагалищная трихомонада узнается по грушевидной или овальной форме тела величиной немного большей лейкоцита, характерным толчкообразным движениям и жгутикам, которые особенно хорошо видны в микроскопе с темнопольным или фазовоконтрастным конденсором. При исследовании нативных препаратов влагалищные трихомонады иногда путают со жгутиковыми семейства бодонидов, которые могут быть занесены в препарат из воды, загрязненной посуды и т.д. В отличие от трихомонад, бодониды имеют лишь 2 жгутика и очень быстро двигаются по прямой. Микроскопическое исследование окрашенного препарата Преимуществом исследования трихомонад в окрашенных препаратах является возможность изучения их спустя длительное время после взятия материала Методика: в повседневной практике наиболее широко применяют окраску высушенных на воздухе и фиксированных препаратов 1% раствором метиленового синего или по Граму, что позволяет выявлять трихомонады при одновременном исследовании мазков на гонококки. ^ в окрашенных препаратах трихомонады имеют овальную, круглую или грушевидную форму с хорошо выраженными контурами и нежно ячеистым строением цитоплазмы, ядро расположено эксцентрично и интенсивно окрашено. Для выявления более тонкого строения трихомонад применяют более сложные методики окраски препаратов (по Романовскому-Гимза, Лейшману-Романовскому), которые позволяют видеть жгутики, ундулирующую мембрану и т.д. Значительно повышают выявляемость трихомонад повторные анализы, в частности, с использованием провокации, а также применение культурального метода в комплексе с другими методами исследования. При обследовании на трихомониаз применяют только алиментарный и механический способы провокации (см. выше); инстиляции и смазывания препаратами серебра и раствором Люголя не проводят, так как последние губительно действуют на влагалищную трихомонаду и затрудняют ее обнаружение. ^ Наиболее широкое распространение для культуральной диагностики трихомониаза получили питательные среды, в состав которых входят асцитическая жидкость, солянокислый цистеин, сыворотки крови, пищевой белок (мясо, печень) и т.д. Общим недостатком таких сред является нестандартность их основы, трудоемкость приготовления, дефицит составных частей и ограниченные сроки хранения. Инкубируют в термостате при температуре 35- 37°С. При выращивании на жидких питательных средах влагалищные трихомонады дают придонный рост в виде плотного беловатого осадка, из которого пастеровской пипеткой берут материал для исследования в нативном препарате. Микроскопическое исследование культур следует производить на 3-5, а при отрицательных результатах - повторно на 7-9 и 11-17 день после посева, т.к. длительность цикла развития влагалищных трихомонад в культуре зависит от величины посевной дозы. ^ Предложены методики постановки реакции иммунофлюоресценции с сыворотками крови обследуемых лиц. Разработано несколько модификаций реакции со свежей кровью, взятой из пальца. Вследствие высокой чувствительности и специфичности данной реакции рекомендовано использовать ее в качестве отборочного теста на трихомониаз. Возможна постановка РИФ-абс с высушенной кровью и с определением титра антител. Концентрация антител в крови тем выше, чем длительнее протекает инфекция. Критерием излеченности РИФ-абс служить не может. ^ Разработана методика постановки внутрикожной пробы с аллергеном, приготовленным из влагалищных трихомонад методом щелочного экстрагирования. На большом клиническом материале была показана высокая чувствительность (92,%) и специфичность (93,%) пробы, что дает возможность рекомендовать ее в качестве отборочного теста на трихомониаз. Внедрение данной методики в практику тормозит отсутствие производственного выпуска трихомонадного аллергена. ^ Хламидии относятся к возбудителям, наиболее часто передающимся половым путем. Хламидийная инфекция среди пациентов дерматовенерологических учреждений встречается в 2-3 раза чаще гонореи. Вследствие малочисленности симптомов и несвоевременности выявления, заболевание нередко приобретает хроническое течение. Проявляющаяся патология распространяется от генитальных и брюшных поражений до конъюнктивита, пневмонии и артрита. По причине специфического внутриклеточного размножения хламидий, лечение антибиотиками не всегда может полностью уничтожить инфекцию. В обследовании на хламидиоз прежде всего нуждаются женщины (беременные и небеременные):
Исследование на хламидий у вышеуказанных женщин надо проводить независимо от картины влагалищного мазка и от наличия сопутствующей условно-патогенной микрофлоры в половых путях, так как доказано, что генитальный хламидиоз протекает преимущественно (почти у 80% больных) при нормальной картине влагалищного мазка. Диагноз хламидиоза ставится на основании анамнеза, оценки клинических признаков заболевания и лабораторных методов исследования в связи с тем, что для генитального хламидиоза более характерно малосимптомное и латентное течение. Микробиологическая диагностика имеет основное значение. ^ : соскобы (не мазки!) эпителия и секреты с пораженных слизистых оболочек урогенитального тракта; отделяемое и соскобы конъюнктивы глаз; соскобы прямой кишки; реже мокрота, кровь, пунктаты лимфоузлов. При болезни Рейтера хламидии выделяются из уретры, пораженных суставов и конъюнктивального мешка. ^ Перед взятием материала больные не должны принимать в течение месяца антибиотики тетрациклинового ряда, не должны мочиться в течение 1-1,5 часов. Оптимальными для персистенции и размножения C.trachomatis являются определенные участки цилиндрического эпителия мочеполовых путей (передняя уретра на глубине 2,5-4 см у мужчин и слизистая оболочка цервикального канала матки на глубине 1,5 см у женщин). Методы исследования:
Цитологическое исследование позволяет выявить хламидий не более чем в 40% случаев. Взятый соскобный материал помещают на предметное стекло, равномерно распределяют тонким слоем и высушивают на воздухе. Фиксация материала осуществляется безводным ацетоном, метанолом или этанолом посредством нанесения их на препарат в количестве 2-3 капель или путем погружения препарата в раствор фиксатора на 30 секунд. Хранить и транспортировать препараты рекомендуется при комнатной температуре. Обрабатывать следует в течение 7 дней. Окрашиваются соскобные препараты по Романовскому-Гимзе. Окраска меняется на разных стадиях развития: ядра клеток (клеток, в которых находятся включения) имеют вишневый оттенок; цитоплазма окрашивается в нежно-голубой цвет; элементарное тельце - в розовый, пурпурный или фиолетово-розовый цвет; ретикулярные тельца - в голубой или синий. Окраска раствором Люголя позволяет дифференцировать C.trachomatis и C.psittaci. Первые содержат гликоген и поэтому окрашиваются йодом; вторые гликоген не содержат и поэтому йодом не окрашиваются. Результат исследования считается достоверным только при наличии характерных включений в эпителиальных клетках. Диагноз считается положительным, если в препарате обнаруживают не менее 10 не вызывающих сомнения телец хламидий. Окрашенные по Романовскому-Гимзе препараты просматривают в темнопольном микроскопе на присутствие включений при увеличении в 400 или 600 раз. В темном поле включения хламидий дают желто-зеленую флюоресценцию. ^ Хламидий не растут на искусственных питательных средах. Одним из лучших, но в то же время наиболее трудоемким, является метод диагностики хламидийной инфекции посредством изоляции возбудителя на культуре клеток, обработанных различными антиметаболитами (Золотой стандарт). Для этой цели обычно используют культуру клеток McCoy, обработанных циклогексамидином. ^ -ростовая среда: среда Игла без глютамина - 400 мл, 3% глютамин 5 мл, эмбриональная сыворотка теленка 4% от общего объема, гентамицин 40 мкг/мл. -изолирующая среда (среда с антибиотиками для заражения клеток клиническим материалом): среда Игла без глютамина - 400 мл, 3% глютамин 5 мл, эмбриональная сыворотка теленка 8% от общего объема, гентамицин 40 мкг/мл, 10% глюкоза 5 мл. -транспортная среда (для забора и хранения клинического материала): фосфатный буфер с сахарозой. Методика: готовят раствор циклогексимидина на изолирующей среде. В стерильные плоскодонные пробирки с помещенными в них покровными стеклами добавляют клеточную суспензию и ставят их на 16-24 часа в термостат при температуре 37°С. Во флаконы с транспортной средой, содержащей клинический материал, при интенсивном встряхивании добавляют свежеприготовленную изолирующую среду. В это время из пробирок с монослоем удаляют ростовую среду, не разрушая монослоя. Затем распределяют изолирующую среду из флаконов с инфекционным материалом в плоскодонные пробирки с монослоем и центрифугируют, затем инкубируют в термостате при 37°С в течение 2-х часов, удаляют изолирующую среду и добавляют новую порцию изолирующей среды с циклогексамидином. Материал инкубируют в термостате при 37°С 48-72 часа. После инкубации приготовленные препараты окрашивают по Романовскому-Гимзе и определяют включения возбудителя ИФМ. Выделение хламидий в культуре клеток позволяет выявить жизнеспособные хламидий и определить их чувствительность к антимикробным препаратам. Исключить артефакты, возникающие при диагностике хламидиоза люминесцентными методами, позволяет дополнительный тест. Предложенный проф. В.В. Делекторским тест основан на том, что элементарное тельце хламидий представляет собой кристаллоид, что является следствием макромолекулярной упаковки ДНК. Перефокусировка люминесцентного микроскопа приводит к возникновению по периферии элементарного тельца четкого дифракционного кольца (кольцо Френеля). Другие микроорганизмы, а также ретикулярное тельце хламидий, дифракционное кольцо не образуют. Достоверность метода не требует находки 10 элементарных телец в микроскопе. Диагноз считается положительным, если в препарате обнаруживается 2-3 элементарных тельца, образующих при фокусировке дифракционные кольца. Наличие дифракционного кольца у исследуемых структур является дополнительным диагностическим тестом, позволяющим исключить ошибки диагностики. Следует особенно отметить, что при наличии смешанного процесса, в частности гонорейно-хламидийного, диагностика хламидиоза ИФМ затруднена. Это связано с тем, что при гонорее за счет большого количества лейкоцитов слизистые покрыты слоем белка, следствием чего является большое количество ложноотрицательных результатов. Инкубационный период при гонорейной и хламидийной инфекциях различен, поэтому при одновременном инфицировании этими двумя микроорганизмами, хламидии могут выявляться значительно позже. ^ используется как дополнительный метод для обоснования диагноза. Серодиагностика основана на определении антител к хламидиям в сыворотке крови методами ИФА, РСК, РНГА. В качестве антигенов используются родоспецифические антигены (ЛПС), полученные из хламидий, диагностический титр 1:64. ИФА применяют так же как дополнительный серологический метод при дифференциальной диагностике инфекций, вызванных хламидиями и микоплазмами. ^ Метод гибридизации ДНК. Из исследуемых образцов выделяют суммарную ДНК. Образцы исследуемой ДНК и контрольные образцы денатурируют кипячением, фиксируют на нитроцеллюлозном фильтре и гибридизируют с предварительно денатурированным биотированным ДНК-зондом. Несвязавшийся зонд удаляют путем отмывки фильтра. На следующем этапе фильтр обрабатывают конъюгатом стрептовидина с щелочной фосфатазой. На заключительном этапе вносят субстратный раствор. Окрашивание соответствующих точек свидетельствует о наличии тестируемой ДНК в исследуемом материале. Рабочие растворы готовят согласно инструкции предприятия изготовителя тест-системы. Гинекологические мазки переводят в физиологический раствор и центрифугируют, надосадочную жидкость сливают, а оставшуюся суспензию клеток хранят в замороженном виде до проведения анализа. Результаты гибридизации оцениваются визуально путем сравнения с интенсивностью окраски пятен контрольных проб. Положительными считаются образцы, имеющие окраску пятна, отчетливо отличающуюся вследствие большей интенсивности от фоновой окраски. ПЦР: в настоящее время ПЦР является наиболее распространенной и объективной методикой - диагностики хламидийной инфекции. Клинический материал для ПЦР собирают в пробирки с буферным раствором и хранят в морозильных камерах (повторное замораживание-оттаивание не допускается). Исследуемый материал используют для обнаружения ДНК возбудителя. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить предварительный диагноз. Критерии излеченности при хламиднозе: Все пациенты после окончания лечения проходят клинико-лабораторный контроль. Первый контроль - сразу после завершения лечения. Если обнаруживаются единичные элементарные тельца, то курс лечения можно продолжить не более, чем на 10 дней. У женщин контрольное исследование проводится во время 1-2 ближайших менструальных циклов. Мужчины клинико-лабораторный контроль проходят в течение 1-2 месяцев. При наличии поражения глаз и суставов схема лечения удлиняется до 21 дня. ^ Клиническая диагностика невозможна из-за полиморфизма проявлений заболевания, поэтому большое значение имеют лабораторные методы диагностики. ^ : выделения и мазки со слизистой оболочки мочеиспускательного канала, сперма, выделения из шейки матки, осадок мочи. Методы диагностики:
Микроскопическое исследование Исследование нативных препаратов не дает положительных результатов. Фиксированные в ацетоне мазки окрашиваются по Романовскому-Гимзе или обрабатываются мечеными антителами и микроскопируются в люминесцентном микроскопе. Возбудители выявляются на мембранах эпителиальных клеток и в межклеточном пространстве. ^ проводят путем посева исследуемого материала на богатые элективные питательные среды сложного состава, содержащие нативные добавки (экстракт из плаценты, триптический перевар бычьего сердца, сыворотку и т.д.). Для посева исследуемого материала используют плотные, полужидкие и жидкие среды. В последнем случае в среду добавляют индикатор для контроля роста, поскольку накопление микоплазм и уреаплазм не сопровождается выраженным помутнением. С целью подавления роста других бактерий добавляют антибиотики группы пенициллина (100 ЕД/мл), не активные в отношении микоплазм и уреаплазм. Посевы инкубируют при 37°С в течение 48 часов. На плотных средах микоплазмы и уреаплазмы образуют микроколонии в виде яичницы-глазуньи с врастающим в среду центром и полупрозрачной периферией, которые обнаруживают путем микроскопии посевов при малом увеличении. Идентификацию выделенной культуры возбудителя проводят по биохимическим (ферментация углеводов, разложение аргинина) и антигенным свойствам в реакции ингибирования роста культуры специфической сывороткой и нейтрализации метаболизма аргинина той же сывороткой. Возбудитель микоплазмоза M.hominis в отличие от других видов микоплазм не ферментирует углеводы и разлагает аргинин. Уреаплазмы вызывают гидролиз мочевины. ^ Серологические исследования проводятся только в динамике заболевания, т.к. противомикоплазменные антитела в невысоких титрах встречаются у 60-80% здоровых лиц. Диагностическим считается нарастание титра антител в 4 и более раз. При вялотекущих заболеваниях антигены и антитела находятся в составе циркулирующих иммунных комплексов. Диссоциация таких комплексов в сыворотке крови с помощью буфера с рН2,4 позволяет выявлять антигены микоплазм и уреаплазм в высоких титрах. Для обнаружения антител в сыворотке крови больных используют реакцию агглютинации эритроцитов 1-й группы крови микоплазмами на холоду; РСК со специфическим диагностикумом: РИГА, РТГА, ИФА, РП. Для выявления антигена в культуре, материале, сыворотке крови больного используют ИФМ и ИФА. ИФА используется также как дополнительный серологический метод при дифференциальной диагностике урогенитальных инфекций, вызванных хламидиями и микоплазмами. Литература:
Б.Н. Козьмин-Соколов, И.С. Фрейдлин. - М. : Медицина. - 1993. - 240 с.
/ Н.П. Елинов, Н.А. Заикина, И.П. Соколова. - М. : Медицина. - 1988. - 206 с.
/ Т.С. Костенко, В.Б. Родионова, Д.И. Скородумов - М.: «Колос», 2001. – 344 с.
/ Л.Б.Борисов, А.М.Смирнова, И.С. Фрейдлин и др. - М. : Медицина, 1994. - 528с
О.К. Поздеев - М. : ГЭОТАР МЕДИЦИНА. - 1998. - 1200 с.
|
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
 |
●Условно-патогенные кокки, способные вызывать заболевания различной локализации: Стафилококки Стрептококки |
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям