Кабинет лабораторных исследований «овум»
|
|
Скачать 1.14 Mb.
|
|
Цитомегаловирус Цитомегаловирус (ЦМВ) - представитель группы β-герпесвирусов (вирус герпеса человека 5–го типа). ЦМВ широко распространен в человеческой популяции. ЦМВ инфицировано от 60-100% взрослого населения. ЦМВ может инфицировать широкий круг клеток (моноциты, макрофаги, гранулоциты, эпителиальные и эндотелиальные клетки, фибробласты, гладкомышечные клетки), которые трансформируются при репликации в них вируса в цитомегалические. Соответственно проявления ЦМВ очень разнообразны. Цитомегаловирус разрушает структуры человеческой клетки, вызывая образование комочков из ядер и других органелл клетки, подобные разрушения клетки приводят к тому, что она наполняется жидкостью и сильно разбухает, приобретая специфический вид "совиного глаза". Длительное время считалось, что цитомегалия- болезнь новорожденных, но в последнее десятилетие было доказано, что недуг является распространенной причиной различных заболеваний взрослых людей и, возможно, причиной развития синдрома хронической усталости. Заражение происходит при переходе через плаценту, с молоком матери, при прохождении через родовые пути, со спермой и выделениями влагалища, слюной. Заболевание ЦМВ может иметь несколько форм: 1- ОРЗ (острое респираторное заболевание); 2-множественное поражение внутренних органов при генерализации процесса; 3-воспаление органов мочеполовой системы; 4-пороки развития плода. В первом случае больные жалуются на слабость, недомогание, быструю утомляемость, головные боли, насморк, увеличение слюнных желез с обильным выделением слюны и белесоватыми налетами на деснах и языке. При генерализованной форме наблюдается воспаление ткани печени, почек, надпочечников, селезенки, поджелудочной железы. Ей сопутствуют частые «беспричинные» пневмонии, малое количество тромбоцитов в крови, поражение сосудов глаза, стенок кишечника, головного мозга и периферических нервов, увеличение слюнных желез, воспаления суставов, кожная сыпь. Третий вариант течения болезни предполагает развитие у женщин со стороны половых органов воспаления и эрозии шейки матки, внутреннего слоя матки (эндометрит), влагалища, яичников. Чаще заболевание протекает остро. Женщин беспокоят болевые ощущения и белесовато-голубоватые выделения из половых органов. У мужчин со стороны гениталий цитомегаловирусная инфекция течет, как правило, без симптомов или возможно проявление воспаления яичек. В ряде случаев наблюдается воспаление мочеиспускательного канала и неприятные ощущения при мочеиспускании. Как и все остальные герпесвирусы, ЦМВ, внедрившись в организм человека может перейти в латентное состояние, которое периодически сменяется его реактивацией с возможностью выделения вируса из организма с любыми биологическими жидкостями. ЦМВ наиболее опасен для беременных, так как при острой ЦМВ во время беременности вирус способен инфицировать плод в 50-60 % случаев, тогда как при активации латентной инфекции риск инфицирования составляет 0,5-2%. На фоне заболевания у будущего ребенка могут формироваться пороки развития головного мозга - аненцефалия, гидроцефалия и др. ^ 1-Для постановки диагноза острой ЦМВ наиболее эффективно выявление вируса методом ПЦР в биологических жидкостях и клеточных соскобах, чувствительность метода 95-99%. С целью диагностики возможного внутриутробного инфицирования плода у беременных женщин исследуются пробы крови с применением метода ПЦР «в реальном времени», который позволяет оценить вирусную нагрузку. Само обнаружение вируса в крови считается признаком манифестной инфекции. Критической считается нагрузка – более 10³ коп/мл, при которой опасность инфицирования плода возрастает в 60 раз. 2-Серологическая диагностика- ИФА. Протекание острой инфекции подтверждается наличием IgM к ЦМВ и/или увеличением концентрации IgG при исследовании парных образцов сыворотки, взятых с интервалом 10-15 дней, определение низкоавидных IgG к ЦМВ. Чувствительность метода около 80-95%. 3-Микроскопическим методом можно определить косвенные признаки цитомегаловирусного инфицирования - наличие в окрашенных препаратах «гигантских клеток» типа «совиный глаз»- увеличенные по сравнению с обычными клетки с увеличенными ядрами, с цитоплазматическими и ядерными включениями. Эти признаки служат поводом для проведения обследования высокочувствительными методами для исключения цитомегаловирусного инфицирования. ^ обследуют с целью выявления группы риска по инфицированию ВПГ и ЦМВ. При отсутствии специфических иммуноглобулинов класса IgG к ЦМВ и ВПГ женщина относится к группе риска. На протяжении беременности рекомендуется 1 раз в 3 месяца определять уровень специфических иммуноглобулинов классов IgM и IgG к ЦМВ и ВПГ с целью выявления случаев первичного инфицирования у группы риска или реактивации латентной инфекции. Определение только иммуноглобулинов класса IgG в одной сыворотке свидетельствует лишь об иммунном статусе пациента в отношении ЦМВ и ВПГ. Положительный результат анализа показывает инфицированность вирусом, но не дает информации о стадии заболевания. Для определения стадии заболевания необходимо исследование парных сывороток с интервалом в 2-3 недели или определение индекса авидности IgG. Только совокупность результатов комплекса лабораторных исследований, клинических и эпидемиологических данных позволяет поставить правильный диагноз. ^ Вирус папилломы человека относится к ИППП. Число инфицированных в мире, по данным Всемирной организации здравоохранения, составляет около 23,5% населения планеты. Вирус передается как половым путем, так и при тесном бытовом контакте. Возможен перенос ВПЧ от родителей к детям, а также вертикальный путь передачи инфекции. В настоящее время известно более 120 типов вирусов папилломы человека. Более 30 из них могут инфицировать генитальный тракт. Однако только некоторые типы вируса представляют значительную угрозу для здоровья, являясь важнейшим фактором в канцерогенезе шейки матки. Выделяют условно 2 формы папилломавирусной инфекции - экзофитную и эндофитную, которые могут встречаться как порознь, так и в разных сочетаниях. ^ - специфичным проявлением инфекции являются остроконечные кондиломы. Описаны случаи злокачественного перерождения кондилом, что послужило поводом считать их факультативным предраком. Инкубационный период после заражения колеблется от 1 до12 месяцев, в среднем- 3 месяца. Эндофитные кондиломы по строению являются плоскими. Они располагаются в толще эпителия и практически не видны невооруженным взглядом, при осмотре выявляются как мелкие шипообразные образования на поверхности слизистых внутренних половых органов. Озлокачествление плоских кондилом до степени внутриклеточного рака происходит у 4-10% женщин в течение 2 лет. Клинически все папилломавирусы разделяются по группам онкогенного риска: 1. «низкого риска» - типы 6,11,36,42,43,44,47,50 2. «высокого риска» - типы 16,18, 31,33,35,39,45, 51,52,56, 58,59, 66,68 Инфекция, вызванная ВПЧ низкого онкогенного риска, обычно протекает доброкачественно, с быстрым, в течение 12-18 месяцев, выздоровлением. Самым высоким онкогенным потенциалом обладают вирусы типа 16 и 18, которые обнаруживаются у 72% женщин с цервикальным раком. При этом ВПЧ 16, 18,31,33 и 45 типов выявляются более чем в 85 % случаев этого заболевания. За последнее десятилетие накоплены многочисленные цитологические, иммуногистохимические, молекулярно-биологические данные, указывающие на прямую связь между папилломавирусной инфекцией и возникновением рака шейки матки. По данным ВОЗ, ежегодно в мире регистрируется около 600000 случаев этого вида опухоли, и, несмотря на проводимые лечебные мероприятия, смертность от рака шейки матки составляет 45-50%. По мнению многих авторов, возникновение данного заболевания ассоциировано с вирусами папилломы человека, передающимися при половых контактах. Генитальная ВПЧ инфекция может длительное время существовать в латентном состоянии, не проявляясь клинически, причем это явление не зависит от пола пациента. У женщин вирус оказывает трансформирующее воздействие на клетки эпителия шейки матки и приводит к возникновению цервикальных карцином, если не предпринимаются своевременные меры по выявлению и лечению предраковых состояний. Особенности папилломавирусной инфекции С одной стороны: 1. При инфицировании большинство женщин (около 80%) излечиваются от ВПЧ в течение 9-15 месяцев от момента заражения без проведения лечебных процедур. 2. Инфекция приводит к развитию предрака и рака у малой части инфицированных женщин (около 0,5%). 3. От заражения до развития предрака и рака шейки матки в среднем проходит 20 лет. 4. Отсутствуют эффективные методы лечения на стадии латентной инфекции (нет цитологических изменений, но выявляется вирус). С другой стороны: 1. ВПЧ является основной причиной рака шейки матки. 2. Инфицированные женщины имеют в 300 раз более высокий риск развития рака. 3. Часто инфекция не вызывает жалоб у пациента и не выявляется при осмотре до перехода в стадию инвазивного рака. 4. Клинические проявления ВПЧ могут маскироваться другими заболеваниями урогенитального тракта и поздно диагностироваться. ^ - Микроскопический метод - исследование мазков на онкоцитологию. С помощью данного метода можно лишь предположить наличие ВПЧ при обнаружении характерных изменений в клетках эпителия – «койлоцитарная атипия», определить различные степени дисплазии эпителия. Чувствительность данного метода диагностики составляет 60% относительно ПЦР- анализа. - Метод ПЦР позволяет с высокой чувствительностью обнаружить участки ДНК вируса папилломы человека в пробе пациента и провести генотипирование вируса. ПЦР- является ранним методом диагностики развития цервикальной патологии, так как ДНК вируса определяется еще до развития изменений в клетках эпителия. С целью проведения оптимального цервикального скрининга необходимо выявлять максимальное количество высоко онкогенных типов ВПЧ (не менее 10-12 генотипов). Типирование необходимо для установления персистенции вируса (когда один и тот же тип вируса определяется больше года). Персистенция вируса опасна в плане развития диспластических изменений, в отличие от недавнего инфицирования новым типом вируса, так как у 80% женщин собственная иммунная система в течение года справляется с вирусом без какого- либо лечения. При инфицировании несколькими генотипами одновременно наблюдается менее благоприятный прогноз течения заболевания и более высокий риск персистенции. Применение количественного варианта «Real-time» ПЦР- анализа позволяет оценить степень цитопатического эффекта, риск развития персистенции. Критической концентрацией считается 103 коп/мл. Оптимальным для проведения цервикального скрининга является, наряду с мазками на цитологию, определение ДНК высокоонкогенных типов ВПЧ методом ПЦР- анализа. Начало скрининга – 25-28 лет. При отрицательном результате обоих тестов скрининг надо повторять лишь через 3-5 лет. Наибольшей онкогенностью обладают типы вируса 16 и 18. При выявлении этих генотипов рекомендуется сразу проводить кольпоскопическое обследование, при выявлении других типов высокого онкогенного риска – сначала проводят цитологию и только при положительном результате цитологии проводят кольпоскопию. Алгоритм использования теста на ВПЧ совместно с цитологией на первом этапе скрининга Результат цитологии и ДНК ВПЧ: ^ Цитология (-) Цитология (-) ASC-US ASC-US или выше ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ Рутинный Повтор ДНК ВПЧ, цитологии Кольпоскопия Скрининг ↓ ↓ 6-12 мес 12 мес ^ Вирус папилломы человека признан важнейшим этиологическим агентом в канцерогенезе шейки матки. Одним из благоприятных условий для длительной персистенции и, следовательно, реализации онкогенного потенциала вируса, являются нарушения микроценоза влагалища. Поэтому важной мерой вторичной профилактики в распространении цервикальной неоплазии является определение ДНК вируса папилломы человека не только у женщин, имеющих признаки поражения шейки матки, но и у всех пациенток с нарушениями микроэкологии влагалища. Целью исследования было оценить уровнь инфицированности ВПЧ высокого онкогенного риска- 16, 18 и группы вирусов 30,31,52 типов женщин и мужчин репродуктивного возраста. Определить частоту ассоциации ВПЧ с другими урогенитальными инфекциями и нарушениями микроценоза влагалища у женщин. Нами было проведено обследование 832 женщин и 185 мужчин в возрасте от 17 до 39 лет обратившихся как с профилактической целью, так и с признаками урогенитальных инфекций в амбулаторно-поликлинические службы Кемерова. У женщин методом ПЦР исследовались соскобы из цервикального канала и заднего свода влагалища, у мужчин соскобы из уретры и эякулят на наличие урогенитальных инфекций. Пробоподготовка проводилась наборами «ДНКсорб -АМ» фирмы «АмплиСенс»(Москва), амплификация с использованием тест-систем фирм «ДНК-Технология» и «Литех»(Москва) на термоциклере « ТЕРЦИК», детекция методом гель- электрофореза, FLASH-методом на флуоресцентном детекторе «ДЖИН» по конечной точке и на «ДТ-322» с детекцией в режиме реального времени. Также каждому пациенту проводилось морфологическое исследование методом световой микроскопии. Исследовались окрашенные препараты мазков из уретры, секрета простаты и эякулята у мужчин; мазков из влагалища, цервикального канала и уретры у женщин. Исследование проводилось на микроскопе Axiostar Plus фирмы «Карл Цейс» (Германия), оценивалось наличие воспалительных изменений, клеточная реакция, количество и морфотипы бактерий. Результаты исследования: методом ПЦР инфицирование ВПЧ выявлено у 22,9 % (191) женщин и 17,4% (32) мужчин. Чаще других определялся ВПЧ 16-го типа, распределение генотипов ВПЧ среди инфицированных было следующим:
По данным морфологического метода исследования, у женщин, инфицированных ВПЧ в 43 % случаев (82 человека) регистрировался бактериальный вагиноз, в 25 % (48 человек) неспецифический бактериальный вагинит, в 15 % (29 человек) специфический вагинит, в 17 % (32 человека) - промежуточный тип микроценоза, в 73 % случаев (139 человек) определялся бактериальный цервицит. У мужчин, инфицированных ВПЧ, по данным морфологического метода исследования, в 44 % случаев (14 человек) регистрировался специфический уретрит, в 37,5 % (12 человек) неспецифический уретрит, в 18,5% (6 человек) воспалительных изменений в мазках из уретры выявлено не было, в 68,8% случаев (22 человека) определялся бактериальный простатит. По данным ПЦР - анализа, у женщин моноинфекция ВПЧ встречалась в 24% случаев (46 человек), инфицирование ВПЧ сочеталось с инфицированием chlamydia trachomatis в 7,9% (15 человек), с trichomonas vaginalis в 5,8% (11 человек), с neisseria gonorrhoeae в 2,6 % (5 человек), с сytomegalovirus в 4,7% (9 человек), с herpes simplex virus 1,2 types в 5,8% (11 человек). Наиболее часто, в 49,2% случаев (94 человека) инфицирование ^ и ureaplasma urealyticum в высоких концентрациях (105-1012 коп/мл). У мужчин, поданным ПЦР- анализа, моноинфекция ВПЧ встречалась в 6% случаев (2 человека), чаще обнаружение ВПЧ сочеталось с инфицированием безусловными патогенами: chlamydia trachomatis в 22% (7 человек), с trichomonas vaginalis в 16% (5 человек), с neisseria gonorrhoeae в 12,5 % (4 человек), с сytomegalovirus в 9% ( 3 человека), с herpes simplex virus 1,2 types в 18% (6 человек). В 16,5% случаев (5 человека) инфицирование ^ и ureaplasma urealyticum в концентрациях (102-106коп/мл). Выводы. Полученные данные свидетельствуют о широкой распространенности высокоонкогенных типов ВПЧ как среди женщин, так и среди мужчин репродуктивного возраста. В большинстве случаев инфицирование ВПЧ сочетается с качественными и количественными изменениями микрофлоры половых органов, воспалительными изменениями. При этом ИППП являются кофакторами инфицирования ВПЧ, приводят к снижению местного иммунитета, способствуя персистенции ВПЧ и реализации его канцерогенного эффекта. Результаты исследования указывают на необходимость обследования женщин с воспалительными и дисбиотическими изменениями влагалища и шейки матки с целью раннего выявления наличия высокоонкогенных типов ВПЧ. А также делают обязательным обследование полового партнера с целью выявления носительства вирусов папилломы человека. ^ Материалы предоставлены зав. отделением общей и инфекционной патологии №2 ГУЗ КемОПАБ, кандидатом медицинских наук Ю.М. Мительманом. Профилактика развития рака шейки матки предполагает раннее выявление и лечение лиц, имеющих предраковые изменения шейки матки с целью предупредить в последующем развитие инвазивного рака. Наиболее важным методом профилактики рака шейки матки является проведение скрининговых профилактических осмотров и цитологического исследования мазков, взятых с эпителиального покрова шейки матки. Цитологическое исследование мазков позволяет идентифицировать различные типы клеток, присущих соответствующим тканям организма. Характеризует типичные особенности их строения. Выявляет отклонения, свидетельствующие о нарушении нормального цикла развития и дифференцировки клеток, свойственных тем или иным формам патологии – воспалению, новообразованиям и др. Качество взятия образцов и приготовления препаратов для цитологического исследования является обязательной предпосылкой для получения адекватного результата исследования (Методические указания от 11.03.2003г. №2003/34 «Обеспечение качества подготовки образцов биологических материалов для цитологических исследований» МЗ РФ Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова). ^ Среди наиважнейших факторов получения адекватного материала из шейки матки является забор материала в обязательном порядке как из эктоцервикса, так и эндоцервикса. Причем именно в такой последовательности. По данным литературы, неполноценность цитологического материала считают до 39% ошибочно-отрицательных результатов при профилактических осмотрах. Адекватный мазок при этом обязательно содержит призматический эпителий, полученный из шеечного канала. При отсутствии в мазке призматического эпителия, необходимо повторить исследование. Для женщин в возрастной группе после 40 лет характерно смещение вверх стыка эпителиев, где рак развивается наиболее часто. Поэтому важно получить материал из глубины канала. Взятие материала проводится до бимануального обследования. При отсутствии видимых изменений со всей поверхности шейки матки получают легкий поверхностный соскоб, из наружного зева и шеечного канала - соскоб щеточкой или ложечкой Фолькмана. Соскоб берется без предварительного протирания шейки. Лишь в случае обильных выделений при наличии гнойно-некротического налета влагалище и шейку матки осторожно просушивают марлевым тампоном. Соскоб производится легким надавливанием на слизистую оболочку, избегая, насколько возможно, появления примеси крови. При взятии материала из цервикального канала слизистая пробка игнорируется, так как не содержит в себе клеточных элементов эпителиальной ткани и в связи с этим является диагностически неполноценной. Материал наносят на различные участки одного стекла, при этом каждый материал наносят в своем направлении: горизонтально или вертикально, либо готовят отдельный препарат из каждого участка шейки матки. Последнему варианту отдается предпочтение. Формы цитологических заключений, даваемые цитологом при исследовании гинекологических мазков на определение степени дисплазии: 1-цитограмма без особенностей 2-цитограмма воспаления 3-пролиферация цилиндрического эпителия 4-дисплазия -слабая (1-2) -умеренная (2) -выраженная (3) 5-резко выраженная (3-4) 6-дисплазия эпителия 4 ^ , рекомендованная цитологической лабораторией облонкодиспансера, разработанная Московским научно- исследовательским онкологическим институтом имени П.И. Герцена: 1. Заключение «цитограмма без особенностей» оценивается клиницистом в зависимости от результатов гинекологического осмотра: при отсутствии визуально определяемых изменений на шейке матки женщина признается здоровой и подвергается следующему профилактическому осмотру в зависимости от возраста. 2. Заключения 2,3 (цитограмма воспаления, пролиферация цилиндрического эпителия) при видимых изменениях шейки матки- требуют кольпоскопического исследования и соответствующего лечения. При отсутствии визуальных изменений и отрицательных данных кольпоскопического исследования- необходим обязятельный цитологический контроль через полгода. 3. Цитологическое заключение о любой степени дисплазии требует проведения кольпоскопии, далее тактика врача определяется в зависимости от визуальных и кольпоскопических данных. 4. Слабая и умеренная дисплазия: При отсутствии визуальных изменений и отрицательных данных кольпоскопического исследования- обязательный цитологический контроль через 6 месяцев (при слабой дисплазии), через 3 месяца (при умеренной дисплазии). При наличии визуальных изменений и отрицательной кольпоскопии- соответствующее лечение с цитологическим контролем: при необходимости выскабливание цервикального канала. При наличии визуальных изменений и подозрительных кольпоскопических данных- проведение биопсии. 5. Выраженная степень дисплазии, при полном отсутствии визуально определяемых изменений на шейке матки – показана кольпоскопия с целью выбора участка для биопсии и выскабливания цервикального канала. Если не определяется патологический субстрат, то допустима тактика динамических наблюдений с повторным осмотром через каждые 2-3 месяца и обязательным взятием соскоба с шейки матки для цитологического исследования. При наличии каких либо изменений на шейке матки, тактика врача должна быть такой же, как и при предположительном цитологическом диагнозе о раке, т.е. обязательное проведение биопсии с изучением серийно-ступенчатых срезов. Такая тактика объясняется тем, что при тяжелой степени дисплазии гистологическое исследование в 15-25% наблюдений устанавливает рак in situ и даже иногда инвазивную микрокарциному. 6. Цитологическое заключение «резко выраженная дисплазия эпителия 3-4» вне зависимости от результатов гинекологического осмотра требует проведения кольпоскопии, прицельной биопсии или конизации и обязательным выскабливанием цервикального канала. При отрицательных гистологических данных такие женщины должны быть под наблюдением. Осмотр с цитологическим контролем проводится не менее 1 раза в полгода. 7. Цитологическое заключение «дисплазия эпителия 4» может служить морфологическим подтверждением рака при характерной клинической картине. При сомнительном клиническом диагнозе необходима биопсия с гистологическим исследованием. Уверенное цитологическое заключение о раке не может быть отвергнуто клиницистом без гистологического исследования, даже если клинические и кольпоскопические данные не соответствуют картине рака. В связи с получением знаний о роли вируса папилломы человека в генезе рака шейки матки и с целью повышения эффективности цервикального скрининга для интерпретации цервикальных мазков в большинстве стран мира внедрена Терминологическая система Бетесда (ТБС), наиболее соответствующая биологии цервикального канцерогенеза и рекомендованная Всемирной организацией здравоохранения. ^
^
Основываясь на опыте различных стран при организации скрининга рака шейки матки, предлагаются следующие рекомендации для проведения профилактических программ в России:
^ Метод полимеразной цепной реакции Метод полимеразной цепной реакции относится к методам молекулярной биологии и является прямым методом диагностики инфекций. С помощью данного метода исследования можно определить в исследуемой пробе участок генетического материала (ДНК или РНК) любого организма, в том числе и возбудителей инфекционных заболеваний. Наличие генетического материала (ДНК и РНК) является основополагающим принципом организации живого. Молекула ДНК и РНК любого организма состоит из 4-х типов азотистых оснований (нуклеотидов) аденина, гуанина, цитозина и тимидина/урацила, которые формируются в двухцепочечную полинуклеотидную цепь по принципу комплементарности. Именно в последовательности нуклеотидов зашифрована наследственная природа всех живых существ. У каждого организма своя уникальная последовательность ДНК или РНК, поэтому метод ПЦР обладает 100% специфичностью, так как выявляет последовательность нуклеиновых кислот, принадлежащих лишь определенному микроорганизму. Метод ПЦР был предложен в 1985 г. сотрудником фирмы "Cetus"(Сан-Дигео, США) Kary Mullis. За эту работу в 1993г. ему была присуждена Нобелевская премия по химии. Суть метода ПЦР заключалась в многократном копировании (амплификации) в пробирке определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом последующем цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты вновь и вновь копируются ферментом ДНК-полимеразой. Благодаря этому происходит многократное увеличение количества специфических фрагментов ДНК, что значительно упрощает дальнейший анализ. В течение нескольких часов с помощью ПЦР из одного фрагмента молекулы ДНК можно получить более 50 млрд. идентичных молекул. Таким образом, можно изучить генетический материал, присутствующий в крошечных количествах в исследуемой пробе. Метод ПЦР является высокоспецифичным (100%) и обладает чувствительностью (94-100%), в идеале позволяя выявлять в исследуемой пробе даже единственную молекулу ДНК бактерии или вируса среди миллионов других молекул. Чувствительность ПЦР анализа на сегодняшний день составляет 10-1000 клеток в пробе, тогда как чувствительность иммунологических и микроскопических тестов 10000-1000000 клеток в пробе. В России ПЦР- анализ включен в номенклатуру клинико-лабораторных исследований согласно приказу МЗ РФ №64 от 21.02.2000г. ПЦР- анализ состоит из 3 этапов: 1-Выделение нуклеиновых кислот из пробы пациента. 2-Амплификация (увеличение числа копий) специфических фрагментов ДНК. 3-Детекция (регистрация) продуктов реакции амплификации. Детекция может производиться методом горизонтального электрофореза в агарозном геле (в основе метода- разделение молекул ДНК по молекулярному весу) или методом флуоресцентной детекции –FLASH (Fluorescent Amplification-based Specific Hybridization), когда на специальном приборе (флуоресцентном детекторе) регистрируется свечение, испускаемое флуоресцентным зондом, присоединенным к специфической последовательности ДНК. В этом варианте регистрации результатов анализа, не требуется открывание пробирки, что позволяет избежать проблемы контаминации (загрязнения образцов). Достоинством ПЦР является возможность определения широкого спектра возбудителей в одном клиническом образце. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, скрыто существующих форм микроорганизмов, возбудителей с высокой антигенной изменчивостью (анаэробов, микроаэрофилов, внутриклеточных паразитов и вирусов), с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях. "Классическая" ПЦР предполагает анализ результатов по окончании процесса амплификации (по конечной точке). В этом случае речь идет о качественной модификации ПЦР- анализа, то есть результат может оцениваться как положительный или отрицательный. Создание новых технологий, таких как флуоресцентная детекция - FLASH (специфическая гибридизация в процессе амплификации с ДНК-зондами, меченными флюорофорами), а также приборов, позволяющих измерять кинетику накопления флюоресценции в процессе проведения полимеразной цепной реакции - "Real-time"-машин, позволило перейти на новый уровень - количественную модификацию анализа - ПЦР «в реальном времени». Результат реакции при этом виде исследования показывает количество копий ДНК или РНК в исследуемой пробе. При количественном анализе проб пациентов проведение реакции сопровождается постановкой калибровочных образцов, в которых заведомо известно количество копий специфической ДНК или РНК. Сравнение кинетики накопления продуктов амплификации в пробах пациентов и калибровочных образцах позволяет оценить концентрацию ДНК или РНК. Преимуществами ПЦР в реальном времени являются: - Высокая чувствительность, специфичность и универсальность, - Гарантированное отсутствие контаминации (загрязнения образцов), так как регистрация результата анализа осуществляется непосредственно через стенку реакционной пробирки, - Возможность одновременного определения нескольких возбудителей в одной пробирке, - Упрощение технологического процесса и сокращение времени анализа, - Автоматизация и стандартизация регистрации результатов. «Качественную» ПЦР можно использовать в следующих случаях: 1.Для диагностики инфекционных заболеваний, вызванных безусловными патогенами, 2.В качестве скрининга инфекционных агентов перед проведением количественной ПЦР. «Количественную» ПЦР в отношении выявления ДНК или РНК возбудителей инфекционных заболеваний целесообразно использовать при оценке тех инфекционных агентов, количественное содержание которых в анализируемом образце имеет клиническую значимость, так как для разработки адекватных методов терапии необходимо иметь достоверную информацию о качественном и количественном составе микроорганизмов (патогенных, условно-патогенных, облигатных) вовлеченных в патологический процесс. Биопробой для исследования методом ПЦР является любой клинический материал от пациента, в котором может содержаться возбудитель инфекции, для диагностики ИППП исследуются пробы соскобов из цервикального канала, влагалища, уретры, секрет предстательной железы, эякулят, моча. Выбор клинического материала для исследования должен определяться локализацией возбудителя. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
отлично
4
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям