Протоколы лабораторной диагностики инфекции вызванной chlamydia trachomatis, (урогенитальной хламидийной инфекции) в российской федерации
|
|
Скачать 0.65 Mb.
|
|
^
Результаты постановки тестов, их чувствительность и специфичность, напрямую зависят от качества получения материала. Самый хороший тест может дать неудовлетворительные результаты при низком качестве образца клинического материала. Поэтому врач, осуществляющий взятие материала у лиц с подозрением на наличие урогенитальной хламидийной инфекции, должен гарантировать:
Внимание! Лаборатория должна участвовать в вопросах выбора области получения образца, выборе инструментов для взятия и условий транспортировки. Инструменты для взятия материала
Тампоны для взятия материала могут содержать остатки волокон, стержня и клея, которые могут быть токсичными для культуры клеток и подавлять рост C. trachomatis. Пластмассовые или металлические стержни лучше, чем деревянные. Дакрон, искусственный шелк и волокна полиэтилентерефталата предпочтительнее альгината кальция. Цитощетки на проволочном или пластмассовом стержне являются превосходным инструментом для получения материала из цервикального канала. Внимание! Использование щеток во время беременности противопоказано. Качество результата лабораторного исследования во многом зависит от физиологического состояния пациента на момент взятия клинического материала. Наиболее информативным может быть материал, если он получен при следующих условиях:
Если нет возможности придерживаться упомянутых условий, то следует помнить, что это может повлиять на качество исследования и исказить интерпретацию результатов. Важно помнить, что: Для диагностики молекулярно-биологическими методами, основанными на амплификации нуклеиновых кислот (МАНК): тампон помещается в транспортную среду, предоставленную производителем. Если производитель не предоставил транспортной среды, может быть использована среда 2SP с добавлением антибиотиков, таких как ванкомицин, гентамицин или амфотерицин В. Исследования показали, что при транспортировке тампона в лабораторию в сухом виде результаты диагностических тестов аналогичны результатам, полученным при транспортировке материала в транспортной среде (9, 10). Для исследования методом прямой иммунофлюоресценции: тампон прокатывается по поверхности предметного стекла. Предпочтительнее использовать предметные стекла с лунками посередине. На стекле должен быть тонкий слой клинического материала. Для культурального исследования: материал собирается в специальные пробирки с транспортной средой (например, 2SP с добавлением антибиотиков, таких как ванкомицин, гентамицин или амфотерицин В). Тампон помещается в пробирку, обламывается о край пробирки и оставляется внутри. Если тампон сделан из нетоксичных материалов или не содержит веществ-ингибиторов, то такой тампон можно также оставлять в пробирке для последующего анализа МАНК (если он запланирован). Способы взятия образцов клинического материала в зависимости от анатомической области или вида материала приведены в таблице 4. Таблица 4. ^
Хламидии являются микроорганизмами, очень требовательными к соблюдению надлежащих условий их транспортировки (состав транспортной среды, температура, при которой осуществляется доставка и хранение материала, длительность транспортировки и хранения), поэтому условия транспортировки должны соблюдаться очень точно. В случае несоблюдения правил взятия и условий доставки биологического материала (разбитые, не промаркированные, склеенные друг с другом стекла, отсутствие материала на стекле) образцы не подлежат исследованию; об этом сообщается врачу, направившему биологический материал на исследование; разбитые стекла подлежат уничтожению. При взятии и транспортировке материала для проведения молекулярно-биологических и иммунологических методов исследования на C. trachomatis и использовании рекомендуемой для этого транспортной среды необходимо четко соблюдать инструкцию производителя используемой тест-системы. Рекомендации по транспортировке и хранению образцов, используемых для проведения разных диагностических методов для выявления C. trachomatis приведены в таблице 5. Таблица 5. ^ урогенитальной хламидийной инфекции
3.3. Методы лабораторной диагностики урогенитальной хламидийной инфекции ^ Принцип культурального метода основан на выделении C. trachomatis из биологического материала больных урогенитальной хламидийной инфекцией после заражения этим материалом чувствительных живых клеток тканевых культур (клеток линий L-929, McCoy, Hela и др.). До начала 1980-х годов культуральный метод был основным методом, диагноза хламидийной инфекции (15). Считалось, что этот метод имеет 100% специфичность, так как результат был очевидным при выявлении в клетках характерных для C. trachomatis включений. Таким образом, изначально это был «золотой стандарт», с которым сравнивали новые методы диагностики хламидийной инфекции, не связанные с выявлением жизнеспособного микроорганизма. Выделение хламидий методом культуры клеток сейчас редко используется для диагностики в Северной Америке и Западной Европе, и не рекомендовано для рутинной диагностики в странах Восточной Европы, за исключением случаев судебно-медицинской экспертизы, случаев сексуального насилия над детьми, или когда культура живых хламидий необходима для исследовательских целей, например для определения антибиотикорезистентности хламидий in vitro. Однако сохранение опыта работы с культуральным методом чрезвычайно важно. С использованием этого метода было обнаружено появление так называемого «шведского» мутантного типа C. trachomatis, который не удавалось обнаружить при помощи МАНК, основанных на определении плазмиды хламидий (Рипа, 2007; Унемо, 2007). Метод рекомендован для работы в референс- лабораториях. Достоинства и недостатки метода. Преимущества метода диагностического выделения хламидий в культуре клеток заключаются в том, что данный метод обеспечивает выделение живого возбудителя, что является достоверным подтверждением диагноза. Проблема культуральной диагностики урогенитальной хламидийной инфекции состоит в том, что для ее осуществления необходима быстрая транспортировка клинического материала на холоде (6+2°С), чтобы сохранить жизнеспособность даже небольшого количества хламидий, которое находится в клиническом материале. Более того, это сложная и требующая времени процедура, для которой нет ни строго стандартизированных методов, ни питательных сред. Кроме того, при выполнении культурального исследования персоналу приходится постоянно работать с высококонцентрированным инфекционным материалом, получаемым в процессе культивирования C. trachomatis, что предъявляет высокие требования к биологической безопасности лабораторий. Трудность культуральной диагностики урогенитальной хламидийной инфекции обусловлена также многообразными факторами, которые могут оказывать негативное влияние на культивирование хламидий. Например, применение гинекологических любрикантов, спринцеваний, спермицидов, оказывающих бактериостатическое и бактерицидное действие, может отрицательно влиять на выделение хламидий. Вата, альгинат кальция, дакрон, входящие в состав тампонов для получения клинического материала, могут быть токсичными для культуры клеток и хламидий. Это происходит из-за того, что ненасыщенные жирные кислоты, находящиеся в ватных волокнах, хлорсодержащие отбеливатели, смола, входящая в состав деревянных палочек, клей, используемый для соединения тампонов со стержнями, также могут быть токсичными для клеточных культур. Чувствительность культурального метода диагностики, по данным разных авторов, колеблется в пределах 40 – 70%. При этом специфичность метода остается 100%. Источники ошибок при выявлении хламидий культуральным методом:
Оценка результатов. Результаты культурального исследования должны быть получены через 2-3 дня (48 – 72 часа). Результат считается положительным, если обнаруживается хотя бы одно хламидийное внутрицитоплазматическое включение и нет причин подозревать контаминацию другим положительным образцом. Если такое подозрение есть, исследование необходимо повторить, используя оставшийся клинический материал, кроме того, в этом случае желательно еще использовать другой альтернативный диагностический метод. Форма заключения лабораторного исследования на основании результатов культурального метода выделения хламидий: Chlamydia trachomatis выделены. Chlamydia trachomatis не выделены. ^ 3.3.2.1. Методы выявления антигенов C. trachomatis Общие положения. Антиген C. trachomatis в клиническом материале определяется либо прямой микроскопией с использованием метода прямой иммунофлюоресценции (ПИФ), либо опосредовано, методом иммуноферментного анализа (ИФА). Специфичность этих методов значительно возросла с появлением высокоспецифичных моноклональных антител. Вместе с тем, чувствительность этих методов значительно ниже по сравнению с методами, основанными на амплификации нуклеиновых кислот (16). ^ Принцип метода заключается в выявлении антигенов хламидий в соскобных препаратах урогенитального тракта больных урогенитальной хламидийной инфекциией путем обработки препаратов меченными флюоресцеином моноклональными антителами к родоспецифическим и видоспецифическим антигенам хламидий. Исследование препаратов осуществляют с использованием люминесцентного микроскопа. Коммерческие препараты моноклональных антител обычно содержат синьку Эванса или родамин, которые элиминируют неспецифическое свечение и окрашивают цитоплазму клеток в красный или оранжевый цвет. При просмотре препаратов антигены хламидий выявляются на красном или оранжевом фоне цитоплазмы эпителиальных клеток в виде округлых яблочно-зеленых элементарных телец. Чувствительность и специфичность. Чувствительность метода составляет 55-76%, специфичность - около 98%. Достоинства и недостатки метода Метод ПИФ отличается быстротой и прост в исполнении, но все же недостаточно чувствителен. К положительным качествам метода люминесцирующих антител относится высокая специфичность. К числу недостатков метода относятся: субъективизм оценки, необходимость присутствия квалифицированного исследователя, осуществляющего исследование препаратов, невозможность автоматизации процесса. Возможны значительные расхождения в выполнении процедуры фиксации препаратов, учета количества элементарных телец, необходимых для положительного заключения о наличии инфекции, используемых в работе антител. Главный недостаток метода – его низкая чувствительность при малых количествах элементарных телец в исследуемом материале. В этих случаях при использовании ПИФ возрастает количество ложноотрицательных результатов. Этот метод разработан исключительно для исследования клинических материалов, полученных из уретры или цервикального канала. Он не пригоден для исследования материалов, полученных неинвазивным способом (моча, эякулят, отделяемое влагалища). Источники ошибок:
Оценка результатов качества взятия клинического материала и результатов при постановке метода ПИФ Для оценки качества взятия материала просматривают не менее 10 полей зрения, используя увеличение люминесцентного микроскопа ×400. В одном поле зрения микроскопа должно быть более 5 клеток цилиндрического эпителия. Критерии, используемые для оценки, включают размер элементарных телец – 200-300 нм, их яблочно-зеленый цвет и правильную округлую форму. Если в препарате содержится достаточное количество эпителиальных клеток и видны специфические флюоресцирующие элементарные тельца (более 5 элементарных телец в препарате), результат считается положительным. Препарат не должен оцениваться если:
Форма заключения лабораторного исследования на основании результатов метода ПИФ Антиген, специфичный для Chlamydia trachomatis, выявлен. Антиген, специфичный для Chlamydia trachomatis, не выявлен Иммуноферментный анализ для определения антигена хламидий (ИФА-АГ) Принцип метода. Метод основан на выявлении в клиническом материале антигенов хламидий путем проведения ИФА с использованием моноклональных антихламидийных антител установленной специфичности. Существует ряд доступных коммерческих тест-систем для ИФА. Методы тестирования варьируют от прямого обнаружения антигена до захвата антигена с использованием или без использования ферментной амплификации с целью увеличения чувствительности метода. Чувствительность и специфичность метода колеблется от 20 до 85% и зависит от вида тест-системы. В современных коммерческих тест-системах чувствительность ИФА сравнима или немного выше, чем у культурального метода, а специфичность адекватна для использования метода в популяции со средней и высокой распространенностью инфекции, например, ≥5% (17). Чувствительность ИФА близка методу ПИФ, однако ниже, чем у методов, основанных на амплификации нуклеиновых кислот возбудителя (18). Достоинства и недостатки метода Иммуноферментный анализ может быть автоматизирован, что позволяет обрабатывать большое количество образцов, отличается относительно невысокой стоимостью. Недостатки: ИФА основан на определении липополисахарида (ЛПС) хламидий, который, как известно, перекрестно реагирует с ЛПС других микроорганизмов, что может приводить к ложноположительным результатам; метод может применяться только для материала, полученного инвазивным способом (соскоб цервикального канала шейки матки, уретры). Источники ошибок:
Оценка результатов. Визуально положительные пробы приобретают цветное окрашивание; интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству антигена хламидий. Результат исследования определяют с помощью специальных ридеров, позволяющих определять оптическую плотность образца при определенной длине волны (обычно – при 492 нм). Образцы, дающие значения оптической плотности выше или равные значениям отсекающего поглощения (cut-off), считаются положительными. Форма заключения лабораторного исследования на основании результатов метода ИФА:
3.3.2.2. Методы выявления антител к C. trachomatis Методы серологической диагностики хламидиоза, направленные на выявление антител к хламидиям, основаны на определении специфических антител в сыворотке крови, а также в других биологических жидкостях и секретах больных урогенитальной хламидийной инфекцией или имеющих хламидиоз в анамнезе. Для серодиагностики в настоящее время наиболее часто используют иммуноферментный анализ (ИФА на наличие антител). Общий принцип: антиген фиксируется на твердой поверхности, обрабатывается испытуемой сывороткой, а затем антивидовым иммуноглобулином, связанным с ферментом, визуализирующимся после добавления субстрата. Многочисленные исследования показали связь между хламидийной инфекцией, например, воспалительными заболеваниями органов малого таза/трубным бесплодием и присутствием высоких титров антител к хламидиям. Это привело к предположению, что обнаружение и количественный анализ антител к хламидиям полезны для диагностики хламидийной инфекции, даже с учетом того, что у здоровых людей также может наблюдаться присутствие высоких уровней антител. Однако выявление антител к хламидиям связано с рядом проблем. Воспроизводимость методов, таких как микроиммунофлюоресцентный тест, низка и нет никаких согласованных стандартов. У некоторых людей иммунный ответ на урогенитальную хламидийную инфекцию может быть отсрочен или даже отсутствовать после перенесенной хламидийной инфекции. В случаях, где ответ есть, антитела часто сохраняются в течение длительного времени после выздоровления. По этим причинам, несмотря на ряд очевидных достоинств иммунологических методов для выявления антител к возбудителю урогенитального хламидиоза (относительная дешевизна и простота постановки, возможность автоматизации), серологическое исследование для диагностики отдельных случаев урогенитальной хламидийной инфекции не рекомендуется. Диагноз должен быть основан на прямом выявлении этиологического агента. Определение антител к хламидиям может быть использовано в эпидемиологических исследованиях как совокупный показатель контакта исследуемой популяции с возбудителем. ^
Форма заключения результатов быстрых тестов у постели больного
|
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям