Протоколы лабораторной диагностики инфекции вызванной chlamydia trachomatis, (урогенитальной хламидийной инфекции) в российской федерации
|
|
Скачать 0.65 Mb.
|
|
3.3.3. МолекулярнО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ методы диагностики урогенитальной хламидийной инфекции Общие положения. Развитие молекулярной биологии – открытие генетического кода, изучение структуры и роли нуклеиновых кислот ДНК и РНК, как хранилища генетической информации живой материи, - открыло новые возможности в изучении и диагностике микроорганизмов. Накапливаемые данные об организации геномов бактерий и вирусов, изучение генетического полиморфизма, идентификация уникальных и специфических для разных видов микроорганизмов участков генома послужили реализации идеи использования генетического материала в качестве мишени для диагностики возбудителей инфекций. В настоящее время в Российской Федерации для выявления нуклеиновых кислот хламидий в образцах биологического материала предлагается значительное количество тест-систем, основанных на различных молекулярно-биологических подходах. В этой связи выбор тест-систем для использования в конкретной лаборатории представляет собой достаточно трудную задачу. При этом решающими должны быть не такие очевидные параметры, как стоимость и удобство в повседневной работе, а чувствительность и специфичность. К сожалению, исследования, посвященные сравнительной оценке тест-систем отечественного производства немногочисленны (Шалепо; Шипицина). В сложившейся ситуации резко возрастают требования к внутрилабораторной валидации тест-систем. Методы выявления нуклеиновых кислот можно разделить на две группы: связанные и не связанные с амплификацией нуклеиновых кислот. ^ К основным методам, не связанным с амплификацией нуклеиновых кислот, относятся различные варианты методов, основанных на гибридизации нуклеиновых кислот-мишеней и комплементарных зондов, содержащих радиоактивные или другие метки. Лучшим примером такого метода является тест PACE® 2 CT (Gen-Probe, Inc. San Diego, CA), одобренный FDA 1988 году. Тест основан на гибридизации ДНК-зонда со специфическим участком 16S рибосомальной РНК C. trachomatis. В связи с относительно низкой чувствительностью указанный метод постепенно вытесняется амплификационными методами. Чувствительность и специфичность: чувствительность – 70-85%, специфичность приближается к 100%. Форма заключения:
^ Разработка метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) явилась поворотным моментом в развитии молекулярной диагностики. Хотя этот метод амплификации нуклеиновых кислот и остается наиболее распространенным, в настоящее время предложены и другие способы амплификации. Все амплификационные методы можно разделить на три группы: основанные на амплификации сигнала, мишени и зонда. ^ . При использовании методов амплификации сигнала, в ходе реакции увеличения концентрации мишени или зонда не происходит. Значительное повышение аналитической чувствительности метода достигается за счет связывания с мишенью множества меченых молекул. Один из вариантов этого подхода (hybrid capture assay – метод захвата гибридных молекул) используется в коммерческих тест-системах для выявления C. trachomatis – HC2® CT ID (Qiagen Germantown, MD). Метод основан на гибридизации в растворе ДНК-мишени и РНК-зонда. Образовавшиеся гибридные молекулы захватываются иммобилизованными антигибридными антителами. Затем к иммобилизованным гибридным молекулам присоединяются антигибридные антитела, меченные щелочной фосфатазой. Реакция оценивается по интенсивности люминесценции, ее высокая чувствительность определяется тем, что к одной гибридной молекуле (ДНК+РНК) присоединяется множество молекул меченых антител. ^ . При использовании этих методов продукт амплификации представлен только нуклеотидными последовательностями, входящими в состав зонда. Наиболее известным вариантом этого метода является лигазная цепная реакция, реализованная в коммерческом продукте LCx Probe System (Abbot), однако в 2003 г производитель отозвал тест-систему с рынка. ^ . Все методы, относящиеся к этой группе, основаны на проведении энзиматических реакций, в процессе которых один или несколько ферментов синтезируют множественные копии нуклеиновой кислоты – мишени. ^ Принцип метода: Амплификация ДНК-мишени осуществляется в ходе повторяющихся циклов, каждый из которых включает:
По окончании цикла происходит удвоение фрагментов ДНК-мишени. При проведении n циклов количество фрагментов ДНК-мишени будет составлять 2n. На практике для получения продуктов амплификации (ампликонов) в количестве, достаточном для их детекции обычными аналитическими методами, проводят приблизительно 30 циклов амплификации. Первоначально в ходе ПЦР после каждого отжига праймеров в реакционную смесь приходилось добавлять новую порцию ДНК-полимеразы, так как ранее внесенный фермент инактивировался при высокой температуре на этапе денатурации. Высокую скорость реакции амплификации удалось получить при использовании термостабильной ДНК-полимеразы и благодаря созданию программируемых термоциклеров, обеспечивающих быстрое и точное изменение температуры реакционной смеси. Для детекции продуктов амплификации применяют несколько методов. Наиболее распространенным методом детекции является горизонтальный электрофорез образца реакционной смеси, полученного после окончания амплификации, в агарозном геле. Результат ПЦР считается положительным при выявлении фрагмента ДНК, по своей молекулярной массе соответствующего молекулярной массе ампликона контрольного образца. Для этого при проведении электрофореза необходимо использовать маркеры (фрагменты ДНК известной молекулярной массы), положительный и отрицательный контроли. Существенными недостатками метода являются: субъективность оценки результатов электрофореза оператором, низкая производительность, невозможность автоматизации процесса, трудность количественной оценки продуктов ПЦР в каждом конкретном образце. Наибольшую опасность составляет возможность наработки в ходе ПЦР неспецифического продукта, сходного по размерам с детектируемым продуктом. При существующей системе детекции возможна выдача оператором ложноположительного результата. Альтернативой электрофоретическим методам детекции ПЦР-амплифицированной ДНК являются методы гибридизационно-флуоресцентной детекции. В ходе такого способа детекции амплифицированная ДНК гибридизуется и с праймерами, и с мечеными флуоресцентным красителем олигонуклеотидными зондами, специфичными к внутренней последовательности анализируемого фрагмента. Образовавшийся гибрид автоматически регистрируется флуоресцентным или фотометрическим ридером. Таким образом, при гибридизационном способе детекции ДНК специфичность реакции амплификации обеспечивается, во-первых, за счет гибридизации с праймерами, во-вторых, за счет гибридизации со специфическими зондами. Метод ПЦР в его классическом варианте первоначально использовался для детекции ДНК C. trachomatis с помощью тест-систем, сконструированных в каждой лаборатории самостоятельно (домашнее изготовление). К настоящему времени такие тест-системы вытесняются коммерческими тест-системами. В большинстве тест-систем мишенью является криптическая плазмида или 23S рРНК C. trachomatis. ПЦР в классическом варианте используется в коммерческих тест-системах производства Roche Molecular Diagnostics Pleasanton, CA (AMPLICOR® CT/NG Test for Chlamydia trachomatis и COBAS AMPLICOR® CT/NG Test for Chlamydia trachomatis). Мишенью в указанных тест-системах является криптическая плазмида. Существует целый ряд отечественных (Российская Федерация) ПЦР – тест-систем для детекции Chlamydia trachomatis, разрешенных к медицинскому применению. Тест-системы, основанные на принципе классической ПЦР, являются наименее удобными в повседневной работе (особенно при ручном исполнении), но отличаются относительно низкой стоимостью. Для повышения чувствительности и специфичности классической ПЦР был разработан ее вариант получивший название гнездной ПЦР. При этом используют две пары праймеров. После проведения амплификации с использованием первой пары праймеров полученные ампликоны используют во втором раунде ПЦР со второй парой праймеров. Вторая пара праймеров отжигается на внутренних участках ампликонов, таким образом, продукт второго раунда амплификации оказывается короче, чем продукт первого раунда. Повышение чувствительности и специфичности гнездной ПЦР достигается за счет увеличения общего количества циклов амплификации (по 15 – 30 в каждом раунде) и отжига второй пары праймеров только на фрагментах, полученных в первом раунде. Метод гнездной ПЦР используется в основном в исследовательских целях и не нашел широкого применения в коммерческих тест-системах. С практической точки зрения, весьма перспективной является мультиплексная ПЦР. При этом варианте в одной и той же пробирке находятся несколько пар праймеров, специфичных для различных мишеней, что позволяет проводить детекцию нескольких мишеней одновременно. Конструирование праймеров и оптимизация условий для мультиплексной ПЦР несколько сложнее, чем решение этих задач для классической ПЦР, так как необходимо исключить возможную комплементарность между различными праймерами и обеспечить для них одинаковую температуру отжига. Мультиплексная ПЦР по чувствительности несколько уступает обычной реакции. ^ Один из принципиальных недостатков, затрудняющих использование классической ПЦР в рутинной диагностике, связан с крайне высокой чувствительностью этого метода, что повышает вероятность ложноположительных результатов из-за перекрестной контаминации исследуемых образцов. Вероятность перекрестной контаминации удается предотвратить при использовании метода ПЦР в реальном времени, благодаря тому, что процессы амплификации и детекции продуктов амплификации происходят одновременно в одной и той же пробирке. Для детекции продуктов амплификации разработаны достаточно сложные технологии, основанные на комплексе ферментативных реакций, в результате которых в реакционной смеси возникает флюоресцентный сигнал, по интенсивности пропорциональный количеству образовавшегося продукта амплификации. Специфичность флюоресцентного сигнала удается получить при использовании ДНК-зондов, комплементарных внутренним участкам фрагмента ДНК, ограниченного праймерами. Наибольшее распространение получили TaqMan зонды и «молекулярные маяки». Детальное описание конструкции зондов и химических реакций, приводящих к появлению флюоресценции, при накоплении в реакционной смеси продуктов амплификации выходит за рамки настоящего протокола. ПЦР в реальном времени может быть использована для определения количественного содержания ДНК-мишени в биологическом образце. Целесообразность количественной детекции C. trachomatis при урогенитальной хламидийной инфекции в настоящее время не определена, что, однако, не исключает такой возможности в будущем. Для проведения ПЦР в реальном времени необходимы специальные термоциклеры с прецизионной оптикой, позволяющие мониторировать интенсивность флюоресценции в реакционной смеси. Современные термоциклеры для ПЦР в реальном времени оснащены каналами для детекции флюоресценции в нескольких диапазонах длин волн (до 5 – 6), что позволяет разрабатывать мультиплексные форматы реакции. Тест-системы для детекции C. trachomatis методом ПЦР в реальном времени, а также мультиплексные тест-системы для детекции возбудителей ИППП (включая C. trachomatis) разработаны и выпускаются некоторыми российскими производителями. Методы амплификации, основанные на транскрипции. Методы амплификации, основанные на транскрипции, относятся к изотермическим (амплификация мишени происходит при постоянной температуре), мишенью является РНК возбудителя. Прототипом указанных методов являются процессы, происходящие при репликации ретровирусов. На начальных этапах реакции при участии обратной транскриптазы на матрице РНК – мишени происходит синтез комплементарной ДНК, а затем с помощью РНК полимеразы синтезируются множественные копии РНК. В настоящее время распространены два варианта рассматриваемого метода амплификации, защищенных патентами компаний - производителей:
Различия между приведенными вариантами связаны с различным происхождением используемых в реакциях ферментов и различными методами детекции продуктов амплификации. В тест-системах TMA (производства Gen-Probe) используются обратная транскриптаза с эндогенной РН-азной активностью и РНК полимераза бактериофага Т7. Для детекции продукта амплификации - одноцепочечной РНК используется гибридизация. Тест-системы выпускаются для детекции C. trachomatis^ Assay) и для одновременной детекции C. trachomatis и N. gonorrhoeae (APTIMA Combo 2 Assay). В последней тест-системе применяется также предварительное обогащение РНК – мишени на магнитных частицах, что позволяет в значительной степени преодолеть проблему наличия ингибиторов амплификации в клиническом образце. В тест-системах NASBA (производства bioMerieux) используют обратную транскриптазу вируса миелобластоза птиц, РН-азу Н и РНК полимеразу бактериофага Т7. Для детекции продуктов амплификации также используют гибридизацию, однако в несколько другом формате, чем в тест-системах ТМА. Основным недостатком тест-систем, основанных на транскрипции, является высокая стоимость и необходимость использования строго определенного оборудования. ^ . Метод амплификации со смещением цепочки относится к изотермическим, концептуально он весьма сложный, но в техническом исполнении весьма прост (29). Метод является интеллектуальной собственностью Becton Dickinson, тест-системы выпускаются под названием «BD ProbeTec™ ET C. trachomatis and N. gonorrhoeae amplified DNA Assay» для одновременной детекции C. trachomatis и N. gonorrhoeae. Детальное описание реакций, на которых основан метод, выходит за рамки данного Протокола. ^
Преимущества и недостатки метода. Преимуществом метода является его высокая чувствительность и специфичность, возможность диагностировать одновременно две инфекции (гонорею и урогенитальную хламидийную инфекцию), возможность использовать для тестирования цервикальные образцы, взятые для цитологического скрининга, а также пробы, полученные неинвазивным способом (моча, эякулят, вагинальное отделяемое); наличие внутреннего контроля амплификации. Метод имеет два основных недостатка:
Использование МАНК для скрининга населения на наличие урогенитальной хламидийной инфекции В ряде исследований показана высокая экономическая эффективность программ скрининга на наличие урогенитальной хламидийной инфекции с использованием МАНК в популяциях с высоким риском возникновения урогенитальной хламидийной инфекции за счет предотвращения развития осложнений заболевания. К сожалению, в Восточной Европе проведено незначительное количество таких исследований. Уменьшение стоимости скрининговых программ может быть достигнуто путем пулирования клинических образцов, полученных от пациентов (13, 22, 23). При этом только в случае выявления в пуле положительного образца каждый образец из этого пула должен быть исследован отдельно. Уровень экономии средств при этом будет зависеть от распространенности инфекции. Первой коммерческой тест-системой, использующей принцип амплификации нуклеиновых кислот, представленной на рынке для диагностики урогенитальной хламидийной инфекции, была тест-система Roche Amplicor® CT PCR для выявления C. trachomatis. Позже были разработаны мультиплексные тесты, позволяющие проводить одновременную ПЦР с ампилификацией ДНК-мишени C. trachomatis и N. gonorrhoeae, а также ДНК внутреннего контроля. Этот тест представлен в двух основных формах: Roche Amplicor CT/NG MWP (multi well plate) PCR и полностью автоматизированный Roche COBAS® Amplicor PCR. Исследования по установлению взаимосвязи между распространенностью урогенитальной хламидийной инфекции и основными характеристиками тест-системы (чувствительность, специфичность, предсказательная ценность положительных и отрицательных результатов) показали, что чувствительность и специфичность тест-системы при выявлении C. trachomatis практически не зависели от превалентности инфекции в популяции, в то время как с увеличением показателя распространенности инфекции существенно возрастала прогностическая значимость положительных результатов (таблица 6). Таблица 6. Чувствительность, специфичность и прогностическая значимость результатов качественной ПЦР (Roche Amplicor) для цервикальных образцов в популяциях с разным уровнем распространенности инфекции (данные из инструкции производителя).
|
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям