Пособие для врачей Иркутск, 2011 удк
|
|
Скачать 498.11 Kb.
|
|
ГОУ ДПО «Иркутский государственный институт усовершенствования врачей Министерства здравоохранения и социального развития» ГУЗ Иркутский областной клинический консультативно-диагностический центр Р.Г.Скворцова, Т.И. Трубникова Современные методы электрофореза белков в клинической лабораторной диагностике Пособие для врачей Иркутск, 2011 УДК ББК Утверждено Методическим советом ИГИУВа Р е ц е н з е н т ы: доктор медицинских наук, профессор, зав. кафедрой биохимии ГОУ ВПО ИГМУ Л.С.Колесниченко
УДК ББК ©Скворцова Р.Г. ,ТрубниковаТ.И. 2011 © ГОУ ДПО ИГИУВ, 2011 © ГУЗ ИОККДЦ, 2011 ОглавлениеОглавление 3 ^ ВВЕДЕНИЕ 4 Капиллярный электрофорез 13 Эффективность и разрешение метода 13 Референсные значения 17 Разнообразие электрофоретических фракций белков 18 Принцип метода иммунофиксации 21 Диапазон диагностической ценности капиллярного электрофореза 25 ^ Моноклональная гаммапатия 32 Множественная миелома 36 Нормальные значения белка в моче 41 Причины появления белка в моче: 41 Моноклональные антитела, как маркеры 41 ПРИЛОЖЕНИЕ 45 Вопросы для самоконтроля: 64 Литература 64 ^
ВВЕДЕНИЕОсновным видом анализов в клинико-диагностических лабораториях (КДЛ), является исследование белков. Белки состоят из аминокислот и являются важной составной частью всех клеток и тканей. В организме человека насчитывают более150 видов белков с различными функциями. На рисунке 1 представлен только спектр типов белков крови, но и он уже дает представление о грандиозности числа исследований, если их проводить без достаточно обоснованного профилирования.  Рис. 1. Белки плазмы крови Современные методы анализа белков сыворотки крови своевременно выявляют патологические состояния почек, мочевыводящих путей, нарушения обмена веществ, патологии печени и поджелудочной железы, онкологических заболевания и пр. Белки плазмы крови определяют в целях: - Диагностики; - Мониторинга лечения; - Прогноза заболевания. Для клиницистов важно четко ориентироваться в особенностях количественной оценки белков с использованием различных методов исследования. Это, в первую очередь, связано с тем, что наряду с возможностью с высокой специфичностью и чувствительностью, определять индивидуальные белки, имеются и скрининговые методы, применение которых зачастую бывает для клиницистов более ценным на этапе постановки диагноза. За последнее десятилетие в развитии методов анализа белков в сыворотке крови и моче произошли кардинальные изменения, которые существенно повысили скорость и чувствительность традиционных анализов, в основном, за счет их автоматизации. Существенно повысилась скорость и чувствительность традиционных анализов, в основном, за счет их автоматизации, а так же появились разработки, в основе которых лежат новые биомаркеры огромного спектра патологий. Одним из достаточно информативных лабораторных тестов, используемых в настоящее время, является электрофорез белков биологических жидкостей (сыворотка крови, моча, спинномозговая жидкость и др.), который позволяет получить значительную диагностическую информацию. На рисунке 2 представлен электрофоретический профиль белков сыворотки крови. Исследование белкового и липопротеинового спектров сыворотки крови и мочи особенно значимо для диагностики патологических состояний, сопровождающихся нарушениями обмена белков и дислипопротеидемиями. При многих заболеваниях в сыворотке крови изменяется соотношение отдельных белков (диспротеинемия), хотя общее содержание белка может оставаться нормальным. В настоящее время известно более 150 индивидуальных сывороточных белков. Значительную часть из них можно количественно определить современными иммуноферментными, иммунохемилюминесцентными и иммунотурбидиметрическими методами. Но при всей информативности и доказательности таких анализов, для определения большого числа белков потребуется много времени и реактивов. Вместе с тем типовые сдвиги белкового состава сыворотки крови можно определить гораздо более доступным электрофоретическим методом, который к тому же позволяет «одним взглядом» оценить общую картину белкового спектра и получить значимую диагностическую информацию. Существует множество разновидностей и модификаций данного метода, которые используются (или использовались в определённые периоды развития биохимии) в различных областях:
Для идентификации, качественного и количественного анализа иммуноглобулинов, как правило, используют четыре лабораторных метода: электрофорез белков сыворотки (ЭБС, SPE), количественное определение с помощью иммунодиффузии и нефелометрии, иммуноэлектрофорез (ИЭФ, EEP) и иммунофиксацию (ИФ, IFE), электрофорез с иммунофиксацией (JFE). В идеале для демонстрации аномальной концентрации или состава иммуноглобулинов используют SPE.  Рис.2 Электрофоретическая подвижность белков, как диагностический маркер Принцип электрофоретического разделения молекул состоит в их движении с различной скоростью в постоянном электрическом поле. Наиболее часто в клинической практике используется электрофорез на поддерживающих средах-носителях – хроматографической бумаге, ацетатцеллюлозных мембранах, различных гелях, а также на комбинированных средах. Электрофорез на бумаге до недавнего времени широко применялся во многих лабораториях, однако он имеет много недостатков. Основной из них состоит в том, что результаты фракционирования белков этим методом могут быть получены лишь на 2-3 день исследования. Электрофорез в агарозном, крахмальном и особенно в полиакриламидном геле, дает существенно лучшие результаты, позволяя идентифицировать большее количество белковых фракций сыворотки (до 30). Но и этому методу присущи недостатки – сложность приготовления геля или дороговизна готовых гелевых пластин. Разработано большое количество модификаций электрофореза белков в полиакриламидном геле для решения разных задач. Наиболее распространён электрофорез белков в полиакриламидом геле, в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли. В разделяющем геле белки мигрируют в зависимости от длины полипептидной цепи, то есть обратно пропорционально молекулярной массе. Использование мембран из ацетата целлюлозы позволило достигнуть компромисса и использовать их главные особенности - однородность материала, очень малую емкость слоя, требующую микроколичеств пробы (0,4–2,0 мкл), быстроту разделения и окраски белков (20-80 мин), легкость отмывания фона, а также относительно низкую стоимость пленок и их доступность. В целом применение ацетатцеллюлозных мембран позволило повысить четкость фракционирования и значительно сократить время, требуемое для разделения, окраски и анализа образца. На рисунке 3 представлены для сравнения гелевые технологии электрофореза на приборе PARAGON-APPRAISE (BECKMAN –COULTER) на ацетатцеллюлозных мембранах и визуальный анализ на полиакриламидном геле. Принцип работы прибора основан на движении белковых молекул в электрическом поле.  Рис.3. Сравнение автоматизированного и ручного методов электрофореза белков Знак и величина электрического заряда молекул белков сыворотки крови, а следовательно, направление и скорость их движения при электрофоретическом разделении, зависят от значения рН и ионной силы среды. Кроме того, скорость движения белковых молекул определяется их молекулярной массой, ионным окружением (составом и концентрацией буфера), приложенным напряжением и другими факторами. В связи с этим для получения сопоставимых данных электрофорез должен осуществляться при строго определенных значениях указанных параметров. В буферном растворе с рН=8,6 или 8,9 и ионной силой 0,08–0,15 моль/л, все белки сыворотки крови приобретают отрицательный заряд и движутся от катода к аноду, причем дальше всего уходят альбумины, имеющие меньшую молекулярную массу, затем располагаются a1-, a2-, b- и g-глобулины. Иногда каждая из этих основных фракций может разделиться на несколько подфракций. Следует указать, что результаты электрофореза на твердых носителях сильно зависят от подготовки пробы и мастерства лабораторного персонала. Сыворотку крови для исследования лучше брать свежей, хранившейся не более нескольких часов. В пробе не должно быть следов гемолиза, в противном случае свободный гемоглобин и его комплекс с гаптоглобином могут образовать дополнительные полосы в области a2- и b-глобулинов. В присутствии ионов кальция и под влиянием некоторых лекарственных веществ возможно расслоение b-фракции на две подфракции, что объясняется нарушением подвижности С3-компонента комплемента. Наконец, в целом качество «картинки» зависит от навыков нанесения пробы (это тоже определенное искусство, формирующееся практикой) и используемых инструментов-аппликаторов. Для электрофореза белков используются различные аппараты, как ручные, так и полуавтоматические. Современные комплексы оснащены микропроцессорными блоками питания и управляются компьютером; в большинстве систем на последней стадии исследования окрашенных мембран или гелевых пластинок (определения относительного количества белков в каждой фракции) используется электронный цветной сканер или миниатюрная фотокамера, что существенно повышает точность и воспроизводимость результатов. Программное обеспечение дает возможность усредненного расчета оптической плотности отдельных фракций путем автоматического определения границ «дорожек» и многократного сканирования каждой из них в нескольких «разрезах», что позволяет исключить ошибки из-за локальных микродефектов и неровного положения носителя, а также до определенной степени нивелировать искривление дорожки и влияние окрашенного фона при неполной отмывке. На экран дисплея и на принтер выводится график-денситограмма с рассчитанным содержанием отдельных белковых фракций. При необходимости маркеры границ фракций на графике можно скорректировать, при этом будет произведен автоматический пересчет их показателей. В компьютере, как правило, создается архив электрофореграмм; их можно в любое время извлечь и просмотреть. При интерпретации результатов клиницисты не должны придавать диагностическое значение, например, снижению содержания альбумина у пациента на 2-3% от справочных данных. Само понятие нормы в лабораторной практике весьма условно; нормальные значения параметров зависят от местных факторов и должны формироваться в первую очередь «на местной базе», т.е. в конкретной лаборатории при обследовании здорового контингента. Вместе с тем для общего контроля качества разделения белков выпускаются специальные контрольные сыворотки, которые желательно иметь в каждой лаборатории, работающей этим методом. Система клинического электрофореза PARAGON и микропроцессорный денситометр APPRAISE — простая и экономичная система, обеспечивающая великолепное качество разделения, высокую чувствительность и прекрасную воспроизводимость, благодаря чему PARAGON-APPRAISE считается эталоном среди аналогичного оборудования, однако у этого метода есть масса недостатков, которые полностью устраняются при использовании ниже описанного метода. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям