Кузубова наталия Анатольевна патофизиологические механизмы формирования хронической обструктивной болезни легких
|
|
Скачать 0.62 Mb.
|
|
Результаты исследования клеточно-молекулярных факторов у больных ХОБЛ. У больных ХОБЛ определялись нормальные значения сывороточных иммуноглобулинов IgA, IgG, IgM, увеличение числа ЦИК. Повышение ЦИК могло быть связано как с наличием хронического воспалительного, так и аутоиммунного процессов. Повышенный уровень IgE отмечался у больных ХОБЛ преимущественно с тяжелым течением заболевания, однако это повышение не сопровождалось эозинофилией, что согласуется с данными литературы [de Jong J.W., 1997]. Отмечено незначительное снижение соотношения CD4+/CD8+, числа циркулирующих натуральных киллеров (CD16+ клеток). У 73-76 % пациентов 1 и 2 групп и 83 % больных 3 группы установлено повышение фагоцитарного числа/индекса моноцитов и/или нейтрофилов, что могло быть обусловлено увеличением поступления в кровяное русло Т-лимфоцитов, подвергнувшихся апоптозу [Comnair S. et al., 2002]. Кроме того, в большинстве случаев эволюция ХОБЛ сопровождается бактериальной и вирусной инфекцией [Шмелев Е.И. и др., 2003], что также способствует увеличению фагоцитарной активности моноцитов и нейтрофилов. Результаты исследования молекулярных факторов в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (ЖБАЛ) и в сыворотке крови до начала терапии представлены в таблице 3. Таблица 3. Уровни про- и противовоспалительных цитокинов, активности эластазы в ЖБАЛ и в сыворотке крови пациентов ХОБЛ 1, 2 и 3 групп в исходном состоянии.
Таблица 3 (продолжение).
* - р<0,05 - различия достоверны по сравнению с показателями 1 и 2 групп. Установлено, что для больных ХОБЛ характерно значительное увеличение уровня IL-8 как в ЖБАЛ, так и в сыворотке крови, прогрессирующее по мере нарастания тяжести заболевания. Отмечалось повышение содержания провоспалительного цитокина IL-1β в очаге воспаления у больных средней степени тяжести заболевания, которое не изменялось по мере прогрессирования патологического процесса. Наличие обратной корреляции между содержанием IL-1 в ЖБАЛ и значением ОФВ1 (r=-0,53) подтверждает роль этого медиатора в патогенезе заболевания. В сыворотке крови у больных 3 ст. ХОБЛ уровень IL-1β был выше (р<0,05), чем у пациентов с 2 ст. заболевания (рис. 1), однако корреляционной зависимости между содержанием IL-1β и показателем ОФВ1 не было установлено (r=-0,24). При этом не нарастало соотношение IL-1ra/IL-1β, которое характеризует ПВ эффект, замедляя формирование патологических процессов при ХОБЛ. Отсутствовало увеличение уровня ПВ цитокина IL-10 как в ЖБАЛ, так и в периферической крови при разной степени тяжести заболевания, что подтверждает гипотезу о том, что низкий уровень IL-10 может быть одним из патогенетических факторов прогрессирования хронического воспаления при ХОБЛ (рис. 1) [Takanashi S., Hasegawa Y., 1999].
Рис. 1. Уровень IL-1β (А) и IL-10 (Б) в ЖБАЛ и в сыворотке больных ХОБЛ ( p<0,05 - различия достоверны по сравнению с 2 ст. ХОБЛ). У больных определялся высокий уровень TGFβ в ЖБАЛ, увеличивающийся по мере нарастания тяжести течения ХОБЛ (табл. 3); при этом содержание TGFβ коррелировало с числом макрофагов в ЖБАЛ (рис. 2), что подтверждает гипотезу о влиянии TGFβ на хемотаксис макрофагов [Boer W. et al., 1998]. Значительное увеличение уровня TGFβ в сыворотке крови и отсутствие различий между содержанием TGFβ при разной степени тяжести свидетельствует о формировании системных изменений у больных средней степени тяжести заболевания и может, в частности, являться одной из причин формирования ЛГ [Voelkin N., Tuder R., 1995]. Т.о., у больных ХОБЛ был выявлен дисбаланс про- и противовоспалительных цитокинов, обусловленный увеличением содержания провоспалительных цитокинов и отсутствием компенсаторного нарастания ПВ цитокинов, необходимого для сдерживания прогрессирования хронического воспалительного процесса. Эти нарушения не ограничивались только очагом воспаления, а проявлялись и на системном уровне.  Рис. 2. Уровень TGF (А) и корреляционная зависимость содержания макрофагов и TGF (Б) в ЖБАЛ больных ХОБЛ. Параллелизм в динамике изменений исследуемых клеточно-молекулярных факторов в очаге воспаления и на системном уровне не был отмечен. Установлена корреляционная зависимость между уровнями про- и противовоспалительных цитокинов (IL-8, IL-1, IL-1ra), активностью эластазы в ЖБАЛ и показателями функции внешнего дыхания (ФВД) (ОФВ1 и/или ЖЕЛ). Аналогичные взаимосвязи в сыворотке крови не наблюдались, что подтверждает гипотезу о независимом формировании местного и системного воспаления у больных ХОБЛ. Сравнение действия фенспирида и БДП выявило отсутствие их влияния на уровни про- и противовоспалительных цитокинов, TGFβ, активность эластазы как в очаге воспаления, так и в периферической крови даже у больных с положительной клинической динамикой, что подтверждает представления об отсутствии влияния КС на уровень синтеза этих медиаторов у больных ХОБЛ и согласуется с данными литературы [Belvisi M., 2004]. Таким образом, одним из основных патофизиологических механизмов формирования ХОБЛ является развитие иммунного воспаления, проявляющегося нарушением равновесия в соотношении про-/противовоспалительных цитокинов, что обусловлено, прежде всего, относительной недостаточностью ПВ цитокинов. Это нарушение происходит как в очаге воспаления, так и в периферической крови. Увеличение активности протеаз, в том числе эластазы, а также фактора роста TGFβ у больных ХОБЛ свидетельствует об активации процессов протеолиза и фиброзирования, а следовательно, ремоделирования легочной ткани, нарастающего с увеличением степени тяжести заболевания. Отсутствие параллелизма в динамике выявленных изменений в очаге воспаления и на системном уровне свидетельствует об их независимом течении. ПВ терапия фенспиридом и БДП не оказывала влияния на показатели иммунного воспаления. Состояние легочно-сердечной гемодинамики у больных ХОБЛ. Установлено, что уже на 2 ст. ХОБЛ существенно изменялись показатели легочно-сердечной гемодинамики, хотя в литературе имеются лишь единичные указания, согласующиеся с полученными результатами [Кароли, 2007]. К ведущим нарушениям гемодинамики МКК у больных ХОБЛ можно отнести повышение легочного сосудистого сопротивления и умеренный рост давления в ЛА, что впоследствии приводит к структурным изменениям и недостаточности правых отделов сердца. У больных ХОБЛ выявлено повреждение сосудистого звена уже на 2 ст. заболевания, о чем свидетельствуют значительные расстройства легочной МЦ и нарушения легочно-сердечной гемодинамики, существенно не прогрессирующие при нарастании патологического процесса. Так, у пациентов с ХОБЛ 2 ст. до лечения отмечено умеренное расширение и гипертрофия ПЖ, ЛГ 1 степени, диастолическая дисфункция ПЖ, что дало основание для постановки диагноза «легочное сердце» у 80 % обследованных пациентов со среднетяжелым течением ХОБЛ. В группе больных ХОБЛ 3 ст. признаки «легочного сердца» были выявлены у 100 % обследованных. У этих пациентов наблюдалась тенденция к дальнейшему прогрессированию ЛГ и гипертрофии миокарда ПЖ. Таким образом, результаты исследования соответствуют мнению о том, что персистенция хронического воспалительного процесса у больных ХОБЛ обусловливает возникновение и прогрессирование нарушений гемодинамики в МКК, приводит к развитию ЛГ и легочного сердца [Чучалин А.Г., 2008]. В отличие от больных со среднетяжелым течением ХОБЛ у пациентов с 3 ст. заболевания были зарегистрированы признаки диастолической дисфункции обоих желудочков. Кроме того, у всех обследованных больных ХОБЛ независимо от степени тяжести регистрировались более низкие средние значения ФВ ЛЖ относительно контрольной группы, что свидетельствует о снижении функциональной активности миокарда не только правого, но и левого желудочков вследствие изменения межжелудочковых взаимодействий и кардиального проявления системного воспаления (рис. 3).
После 6-месячного курса ПВ терапии БДП у больных 2 группы произошли позитивные изменения со стороны легочно-сердечной гемодинамики (табл. 4). У пациентов, имеющих положительную клиническую динамику на фоне лечения БДП, было отмечено достоверное снижение уровня СДЛА и улучшение диастолической функции ПЖ (рис. 4 и 5). Этим изменениям способствовала оптимизация легочной МЦ, проявившаяся улучшением диффузного капиллярного кровотока. У пациентов с тяжелым течением ХОБЛ (независимо от клинических результатов) после 6-месячного курса лечения БДП не выявлено достоверных изменений показателей легочно-сердечной гемодинамики, что опосредовано менее выраженной динамикой легочной перфузии по данным сцинтиграфии легких. Таким образом, уменьшение выраженности диффузных расстройств кровотока в легких на фоне терапии БДП у больных ХОБЛ способствовало улучшению диффузионной способности легких, положительным изменениям гемодинамики МКК и сопровождалось оптимизацией клинического течения заболевания. Вероятно, что одним из механизмов, лежащих в основе положительного клинического эффекта при использовании препаратов с ПВ активностью у больных ХОБЛ, является их позитивное влияние на нарушения легочной МЦ, что, в свою очередь, подчеркивает значение сосудистых процессов в патогенезе этого заболевания. После 6-месячного курса лечения фенспиридом у больных 1 группы также была выявлена тенденция к позитивным изменениям легочно-сердечной гемодинамики (табл. 4). У пациентов с положительным клиническим результатом произошло достоверное снижение уровня СДЛА (рис. 4). Снижение СДЛА при лечении фенспиридом реализовывалось, вероятно, за счет уменьшения легочного сосудистого сопротивления и улучшения перфузии в легочных капиллярах. Показано также, что применяемый препарат влиял на контрактильную активность миокарда ЛЖ (рис. 5), так как у всех больных, лечившихся фенспиридом, отмечено увеличение фракции выброса (ФВ) ЛЖ. Таблица 4. Показатели легочно-сердечной гемодинамики у пациентов с ХОБЛ до и после лечения (M±m).
* - р<0,05, различия достоверны внутри группы до и после лечения Это может быть обусловлено нормализацией межжелудочковых взаимодействий после снижения нагрузки на ПЖ, системным ПВ воздействием фенспирида, снижением общего периферического сопротивления вследствие умеренного спазмолитического эффекта препарата, а также блокадой нейрогенных вазоактивных механизмов воспаления [Melloni B., 2002].
Т.о., изменения легочно-сердечной гемодинамики и ремоделирование правых камер сердца выявляются у большинства больных ХОБЛ уже на 2 ст. и прогрессируют по мере увеличения степени тяжести заболевания. БДП по сравнению с фенспиридом обладает более выраженным положительным воздействием на легочное сосудистое русло. Положительный эффект БДП в более полном объеме проявляется на 2 ст. ХОБЛ. Функциональное состояние эндотелия у больных ХОБЛ. Немаловажное значение в патогенезе ХОБЛ и, в первую очередь, в развитии патологических изменений в легочной циркуляции имеет функциональное состояние эндотелия, которое характеризуется супрессией процессов вазодилатации и экспрессией вазоконстрикции. Уже на 2 ст. ХОБЛ в плазме больных установлено повышение концентрации ЕТ-1, которое достоверно не прогрессировало при нарастании степени тяжести заболевания. Увеличение уровня ЕТ-1 в плазме на ранних этапах ХОБЛ может рассматриваться как признак возникновения ДЭ, которая опосредует один из механизмов раннего вовлечения васкулярных процессов в патогенез ХЛС и способствует развитию МЦ расстройств у пациентов уже со 2 ст. заболевания. УЗ диагностика вазоактивной функции эндотелия является высокочувствительным способом оценки и отражает совокупное влияние не только ЕТ-1, но и ряда других вазорегулирующих факторов. По данным пробы УЗ метода ДЭ выявлена у 53 % больных ХОБЛ на 2 ст. заболевания, что соответствует результатам единичных исследований [Кароли Н.А., 2004; Сироткин С.А, 2007]. Выявление ДЭ при тяжелом течении составило 73 % (рис. 6). Концентрация ЕТ-1 у больных со среднетяжелым и тяжелым течением заболевания была выше нормальных значений и достоверно не различалась, однако отличие этих групп по изменению прироста диаметра плечевой артерии в ответ на пробу с реактивной гиперемией было достоверным. Очевидно, что выявление ДЭ с помощью метода УЗ диагностики позволяет оценить результат взаимодействия комплекса сложных механизмов эндотелий-зависимой регуляции сосудистого тонуса. После 6-месячного курса ПВ лечения БДП отмечено значительное снижение уровня циркулирующего ЕТ-1 в группе больных 2 ст. ХОБЛ, однако у пациентов с тяжелым течением заболевания концентрация циркулирующего в плазме ЕТ-1 после лечения осталась практически неизменной (рис. 7). Полученные результаты свидетельствуют о возможности КС редуцировать на ранних стадиях ХОБЛ синтез эндотелина клетками эндотелия, обладающими рецепторами к этим препаратам [Цой А.Н., 2009]. Это является одним из позитивных эффектов действия ИГКС препаратов при этом заболевании. Аналогичные результаты получены и при оценке функции эндотелия после лечения БДП методом УЗ диагностики. При этом у больных ХОБЛ 2 ст. с положительной клинической динамикой на фоне лечения БДП было выявлено не только улучшение функции эндотелия, но и ее нормализация. Терапия фенспиридом достоверно не изменила выраженность ДЭ.
Т.о., БДП по сравнению с фенспиридом оказывал более выраженное положительное влияние на функциональное состояние эндотелия у пациентов со среднетяжелым течением ХОБЛ, а прогрессирование заболевания резко снижало эффект действия ИГКС. Улучшение функционального состояния эндотелия в определенной степени способствовало оптимизации легочной МЦ, что в свою очередь приводило к позитивным изменениям гемодинамики МКК. Выявленные в ходе корреляционного анализа закономерности указывают на наличие взаимосвязи показателей, характеризующих эндотелиальную функцию, с показателями легочно-сердечного кровообращения, что подтверждает мнение о роли ДЭ в развитии и прогрессировании ХЛС при ХОБЛ. Так, выявлено наличие умеренной обратной зависимости между степенью поток-зависимой вазодилатации и СДЛА (r=-0,47, p<0,05), что свидетельствует о возможности оценки функции эндотелия сосудов МКК по легкодоступному для диагностики сосуду большого круга кровообращения (БКК). Статистически достоверной была и обратная зависимость между степенью поток-зависимой вазодилатации и размером ПЖ в диастолу (r=-0,62, p<0,05), а также прямая связь (r=0,32, p<0,05) между уровнем циркулирующего ЕТ-1 и СДЛА, что подтверждает роль васкулярных нарушений в прогрессировании ПЖ недостаточности и формировании ХЛС. Кроме того, при оценке взаимосвязи изученных методов диагностики функциональной активности эндотелия − интегрального, учитывающего сложные и разнонаправленные биохимические процессы (степень эндотелий-зависимой вазодилатации), и одного из маркеров эндотелиальной активации − концентрации циркулирующего мощного вазоконстриктора ЕТ-1 выявлена умеренная отрицательная зависимость (r=-0,37, p<0,05), констатирующая не только взаимосвязь этих показателей между собой, но и с функциональной активностью эндотелия. С целью выявления факторов, определяющих терапевтический эффект ИГКС, была построена прогностическая модель. Наиболее информативными оказались три показателя: уровень Hb, размер ПЖд и величина СДЛА. Таким образом, достижение клинического результата при назначении ИГКС определяется возможностью влияния на сосудистые изменения при ХОБЛ. Кроме того, чем тяжелее течение ХОБЛ, тем менее вероятно рассчитывать на положительный клинический эффект при лечении ИГКС. Точность прогнозирования составила 77 % в целом по группе и 88 % для положительного клинического эффекта. Исследование функциональных генных полиморфизмов у больных ХОБЛ. Для исследования были выбраны гены с высокой частотой альтернативных функциональных полиморфизмов. Установлено, что частота распределения промоторных аллелей этих генов близка к «менделевской» (1:2:1) (табл. 5). В группе больных ХОБЛ и в группе сравнения распределение аллелей исследуемых генов ММР-1 (1G/2G), ММР-3 (5A/6A), 5-НТТ (S/L) и АСЕ (I/D) соответствовало аналогичным данным по генеральной выборке популяции Санкт-Петербурга и Северной Европы, что свидетельствует об отсутствии существенного влияния исследуемых функциональных вариантов генов на встречаемость ХОБЛ в популяции (табл. 5). Таблица 5. Распределение изученных генных вариантов у больных ХОБЛ (n=72).
Было изучено влияние указанных функциональных полиморфизмов на фенотипические проявления данного заболевания. Выявлена достоверная связь между носительством гиперактивного аллеля 2G гена ММР-1 и ЛГ у больных ХОБЛ (рис. 8). Среди больных с уровнем ЛГ>40 мм рт. ст. частота этого гиперактивного аллеля была ниже, чем в остальной группе (85 % или 8/15 против 53 % или 28/33, р=0,02). Это происходит вследствие замедления деградации коллагена и прогрессирования фиброза, затрагивающего сосудистую сеть легких, что способствует увеличению давления в МКК и развитию ЛГ. В свою очередь, альтернативный аллель гена ММР-1 1G/1G, отличающийся меньшей транскрипционной активностью, выявлялся с частотой 47 % (17/15) при выраженной ЛГ (выше 40 мм рт. ст.) по сравнению с остальной группой больных (частота 15 % или 5/33, р=0,03). Выявлена существенная взаимосвязь между выраженностью ТБД, косвенно отражающей нарушения механических свойств бронхиальной стенки, и частотой генотипа 2G/2G гена ММР-1 (r=0,301; р=0,025) (рис. 9). Частота генотипа 2G/2G гена ММР-1 составила 0 % в группе больных с отсутствием ТБД; 12,5 % при 1-й степени (1/8); 15,8 % при 2-й степени (3/19) и 40 % (2/5) при 3-й степени ТБД. Таким образом, полученные результаты подтверждают связь между гиперактивной промоторной формой гена ММР-1 и клиническими признаками дефицита фиброзной ткани, приводящего к нарушениям механических свойств бронхиальной стенки. Ген другого фермента коллагенолиза MMP-3 также имеет 2 частых промоторных варианта (5А и 6А) в позиции -600, из которых аллель 5А более активно влияет на синтез мРНК. В проведенном исследовании показана взаимосвязь между гиперактивным аллелем ММР-3 (генотип 5А/5А) и ТБД (n=43; р=0,04). Т.к. гены ММР-1 и ММР-3 находятся в соседних сегментах хромосомы 11, и аллели 1G MMP-1 и 5А гена ММР-3 сцеплены между собой достаточно сильно (r=0,3-0,4; р<0, 001), проведена оценка взаимосвязи между частотой встречаемости этого гаплотипа и нарушениями механических свойств бронхов.
Отмечено, что сочетание генотипов ММР1/1G–ММР3/5А наиболее часто встречалось у больных без признаков ТБД и уменьшалось по мере прогрессирования степени выраженности патологического процесса, т.е. этот гаплотип обладает протективным эффектом в отношении развития ТБД у больных ХОБЛ (рис. 10). Таким образом, гиперактивные промоторные аллели генов коллагеназ (ММР1-1G и ММР-3 5A) оказывают однонаправленный эффект изменения механической функции бронхов, обусловленный усилением ремоделирования коллагеновых структур легких при ХОБЛ. Частота генотипа I/I гена АСЕ оказалась связанной с фактором наследственной предрасположенности к ХОБЛ. В группе больных с наличием симптомов ХОБЛ у одного из родителей по сравнению с остальными больными частота генотипа АСЕ I/I была существенно выше: соответственно 39 % (14/36) по сравнению с 11 % (4/36) (р=0,006) (рис. 11).
Анализ возрастной динамики показал, что частота генотипа D/D достоверно снижалась с возрастом больных, достигая минимальных значений к возрасту 70-80 лет (рис. 12). В связи с выявлением корреляции между возрастом больных, стадией заболевания и генотипом АСЕ D/D логично предположить наличие взаимосвязи между генотипом АСЕ D/D и клинической стадией заболевания, т.к. оба этих показателя зависят от возраста пациентов. На рис. 13 отражена зависимость стадии заболевания от варианта генотипа АСЕ-1: более активный (высокопродуцирующий) генотип D/D встречается у больных 1-2 ст. ХОБЛ чаще (45 % или 9/20), чем у пациентов с более тяжелым течением заболевания (19 % или 10/52, р=0,03).
Снижение частоты встречаемости генотипа АСЕ D/D на более поздних стадиях заболевания связано с возрастной динамикой этого генотипа, представленной выше. Этот генотип высокого кардиоваскулярного риска в исследуемой мужской популяции привел к снижению выживаемости по мере старения организма. В свою очередь у больных, проживших до 70-80 лет, имелась более тяжелая стадия ХОБЛ, однако возможность дожить до этого возраста в некоторой степени определяло отсутствие у них генотипа D/D гена АСЕ-1. Полученные нами данные согласуются с ранее опубликованными результатами [Arias-Vasquez et al., 2005], где сообщалось о пониженной выживаемости курящих людей в возрасте моложе 65 лет с генотипом АСЕ D/D. Таким образом, этот генотип является фактором естественного отбора в среднем и старшем возрастах. Кроме того, выявлена тенденция к нарастанию частоты обострений заболевания у больных, носителей высокопродуцирующего аллеля D гена АСЕ-1 (рис. 14).
Исследования в выборке больных в Санкт-Петербурге не подтвердили взаимосвязь «гиперактивного» генотипа L/L гена 5-ННТ с ЛГ у больных ХОБЛ.
В то же время была выявлена взаимосвязь между генотипом 5-НТТ и степенью ДН. Установлено, что более активный аллель L гена 5-НТТ встречался значительно чаще у больных с более выраженной степенью ДН: при ДН 2 – в 88,5 % случаев (46/52), при ДН 0-1 – в 69 %случаев (9/20) (р=0,05) (рис. 16). Это указывает на роль генетических факторов, регулирующих транспорт и захват серотонина, в развитии ДН при ХОБЛ, что может быть обусловлено усилением дисфункции гладкомышечных структур сосудов и бронхов. Показана также связь между носительством аллеля S гена НТТ и повышенной частотой развития ТБД (частота дискинезии – 84 % при наличии генотипа НТТ-S и 56 % при отсутствии этого аллеля; р=0,04, n=43). Т.о., в патогенезе ХОБЛ наряду с прочими механизмами определенную роль играют изменения, происходящие на васкулярном уровне, что подтверждается следующими фактами: 1. У больных ХОБЛ уже на 2 ст. существенно изменяются показатели, характеризующие васкулярные процессы: функциональное состояние эндотелия, легочная МЦ, уровень СДЛА. При нарастании степени тяжести заболевания и прогрессировании вентиляционных расстройств достоверная динамика этих показателей отсутствует, что указывает на раннее включение в патогенез ХОБЛ сосудистого звена. 2. Гены, участвующие в основных патофизиологических процессах при ХОБЛ (ММР-1; ММР-3; 5-НТТ; АСЕ-1), оказывают активное влияние и на регуляцию васкулярных изменений при этой патологии, ассоциируясь с развитием ряда особенностей течения заболевания, что указывает на взаимообусловленное развитие происходящих изменений. 3. Клинический эффект при лечении ПВ препаратами может быть опосредован влиянием на различные уровни сосудистого звена: улучшаются функциональное состояние эндотелия и легочная МЦ, что приводит к положительными изменениям легочно-сердечной гемодинамики и замедлению формирования одного из основных осложнений ХОБЛ – легочного сердца. 4. При построении математической модели клинической эффективности ИГКС в качестве прогнозирующих факторов выявлены показатели, характеризующие состояние васкулярных процессов: уровень Нb, размер ПЖд и СДЛА. Однако не выявлены механизмы, лежащие в основе произошедших сосудистых изменений на фоне терапии ПВ препаратами, отсутствовала динамика клеточно-молекулярных факторов, определяющих формирование и персистенцию иммунного воспаления при ХОБЛ. С целью поиска других механизмов, регулирующих развитие и прогрессирование патологического процесса при ХОБЛ, и оценки влияния на них проводимой ПВ терапии было проведено экспериментальное исследование. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям