Пособие может быть полезно для студентов технологических специальностей вузов пищевой промышленности. Удк 577. 1(076. 5)
|
|
Скачать 1.27 Mb.
|
^
^ Из органических кислот в качестве осадителей белков широко применяют трихлоруксусную кислоту (ТХУ) и сульфосалициловую кислоту. Механизм осаждения белков этими кислотами объясняют денатурацией и дегидратацией молекулы белка. ТХУ осаждает только белки и не осаждает продукты их гидролиза. Это имеет важное значение для определения белкового и небелкового азота. Сульфосалициловая кислота осаждает белки и высокомолекулярные пептиды. ХОД РАБОТЫ. В две пробирки наливают по 1 мл раствора белка яиц и добавляют равный объем в первую – раствора с массовой долей ТХУ 10 %, в другую – раствора с массовой долей сульфосалициловой кислоты 10 %. Выдерживают 5 мин и результат опыта вносят в табл. 6. При осаждении белков конечная концентрация органических кислот в растворе должна быть не менее 2,5-5 %. При осаждении белков молока она должна составлять 12 %. ^Соли тяжелых металлов (ртути, серебра, свинца, меди и др.) вызывают необратимое осаждение белков, образуя с ними соединения, растворимые в избытке этих солей (за исключением нитрата серебра и дихлорида ртути), но нерастворимые в воде. Растворение осадка в избытке раствора соли происходит вследствие возникновения одноименного положительного заряда на частицах белка. Способность молекул белка прочно связывать ионы тяжелых металлов с образованием нерастворимых в воде осадков используется как противоядие при отравлении солями ртути, меди, свинца и другими металлами. ХОД РАБОТЫ. В три пробирки наливают по 1 мл раствора белка яиц и медленно, по каплям при встряхивании прибавляют до появления осадка: в первую – раствор с массовой долей сульфата меди 6 %, во вторую – раствор с массовой долей ацетата свинца 5 %, в третью – раствор с массовой долей нитрата серебра 3 %. Затем содержимое первой и третьей пробирок делят пополам. Одну половину содержимого разбавляют 2-3 мл воды, другую – 2-3 мл соответствующего осадителя и оставляют на 10 мин. Результаты опыта вносят в табл. 6. ^ Механизм действия спирта и других органических растворителей (ацетона, хлороформа) объясняют дегидратацией молекул белка, что ведет к понижению устойчивости их в растворе. Если к раствору белка предварительно добавить хлорид натрия, осадок образуется быстрее вследствие снятия заряда с коллоидной частицы. Если осаждение проводить на холоде (от 4 до 0 °С) и осадок быстро отделить от спирта, то белок может раствориться в воде, т.е. денатурация не успевает произойти, и осаждение обратимо. При длительном стоянии со спиртом белок денатурирует необратимо и становится нерастворимым в первоначальном растворителе. ХОД РАБОТЫ. В пробирку наливают 1мл раствора яичного белка, добавляют на кончике ножа (0,2 г) хлорида натрия и энергично встряхивают. Затем постепенно (каплями) приливают 2 мл этанола. Энергично встряхивают и оставляют в штативе. Через 4-6 мин появляется мелкий осадок белка. Результаты записать в табл. 6. РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная; раствор белка (белок одного куриного яйца отделяют от желтка, разбавляют водой до 250 мл, тщательно перемешивают и фильтруют через двойной слой марли); растворы с массовыми долями: уксусной кислоты 1% и 10 %, гидроксида натрия 10 %, сульфосалициловой кислоты 10 %, трихлоруксусной кислоты (ТХУ) 10 %, сульфата меди 6 %, ацетата свинца 5 %, нитрата серебра 3 %, насыщенный раствор хлорида натрия; концентрированные кислоты: азотная, серная, соляная; этанол 96 %. ^ 1.Назовите основные факторы, обуславливающие стабильность молекул белка в растворе. 2. Причины осаждения белков нагреванием при рН около 7,0? 3. Характеристика обратимых и необратимых реакций осаждения белков. 4. Почему в растворе при рН<7,0 белки при нагревании не выпадают в осадок? 5. Почему в растворе при рН>7,0 белки при нагревании не выпадают в осадок? 6. Почему в растворе при рН<7,0 с добавлением хлорида натрия белки при нагревании выпадают в осадок? 7. Механизм действия минеральных кислот на молекулы белков в растворе. 8. Механизм осаждения белков органическими кислотами. 9. Механизм осаждения белков солями тяжелых металлов. 10. Механизм осаждения белков органическими растворителями. 2.5. Разделение смеси аминокислот методом хроматографии на бумаге Хроматография является эффективным методом для решения одной из важнейших задач биохимии – разделения и идентификации химических соединений (белков, аминокислот, жирных кислот, моно- и дисахаридов и др.). Метод предложен в 1903 г. профессором Воронежского университета М.С. Цветом для разделения растительных пигментов. В настоящее время известно большое число различных видов хроматографии (распределительная, адсорбционная, ионообменная, на молекулярных ситах) и различных приемов их применения (на бумаге, колоночная, тонкослойная, газовая). Современные разновидности хроматографии, различающиеся по технике выполнения позволяют быстро разделить отдельные компоненты из небольшого количества сложной смеси. Принцип распределительной хроматографии состоит в том, что вещества помещают в систему, которая содержит два физически различных компонента- подвижную и неподвижную фазы. Неподвижную (стационарную) фазу называют сорбентом. Если сорбентом служит жидкость, удерживаемая каким-либо твердым телом, то это тело называют носителем или матрицей. Подвижную фазу называют растворителем или проявителем; компоненты разделяемой смеси – растворенными веществами. В варианте распределительной хроматографии на бумаге носителем служит целлюлоза в виде листов хроматографической бумаги. Неподвижной фазой служат пары воды, насыщающие лист этой бумаги при данных условиях. В качестве подвижной фазы применяют насыщенный водой органический растворитель, который, двигаясь по бумаге, растворяет и увлекает за собой нанесенный образец. Распределительная хроматография основана на том, что растворенное вещество распределяется между подвижной и неподвижной фазами. Этот процесс называется распределением и количественно описывается коэффициентом распределения, представляющим собой отношение концентраций растворенного вещества в каждой из двух фаз. Рассчитывают этот коэффициент по следующей формуле:  ,где, mп – масса подвижной фазы; mн – масса неподвижной фазы; Rf – коэффициент подвижности (скорости перемещения зоны компонента). По мере движения растворителя происходит множество микроскопических актов распределения каждого из исследуемых компонентов между подвижной и неподвижной фазами, в результате чего вещества с разными коэффициентами распределения оказываются на различном расстоянии от старта. Коэффициентом Rf (подвижности) называют отношение расстояния от места нанесения исследуемого вещества до середины пятна (а) к расстоянию, от места нанесения вещества до фронта растворителя (в): Rf = а/в. Каждое из разделяемых веществ имеет свой Rf. Этот коэффициент может быть использован для идентификации (определения) компонентов исследуемой смеси, но воспроизводимость его зависит от условий опыта (температура, сорт бумаги, чистота растворителя, однотипность процедур и др.). Существуют различные виды хроматографии на бумаге: нисходящая (растворитель движется по бумаге сверху вниз), восходящая (растворитель движется по бумаге снизу верх), круговая (движение растворителя происходит от центра круга к периферии) и др. В учебных целях наиболее удобна круговая (радиальная) хроматография. Все операции с хроматографической бумагой проделывают тщательно вымытыми перед работой руками или в чистых резиновых перчатках. Надписи на бумаге делают простым карандашом.  ХОД РАБОТЫ. Работа состоит из нескольких этапов, которые выполняются в определенной последовательности:1.Разметка и маркировка хроматографической бумаги. Из хроматографической бумаги вырезают квадрат со стороной на 0,5 см больше диаметра используемой для работы чашки Петри (рис.3). Рис. 3.Хроматография аминокислот: I) общий вид радиальной хроматограммы; II) схема хроматографической камеры Двумя перпендикулярными линиями, проведенными карандашом через центр, квадрат делят на четыре сектора. По краю каждого сектора делают простым карандашом надпись о наносимом веществе. На взаимно перпендикулярных прямых, отступив от центра 1,5 см к краю каждой стороны квадрата, сделать карандашом метки (1). Это будет место для нанесения пробы (стартовая линия). 2. Нанесение растворов. В отмеченные точки микропипеткой наносят растворы аминокислот (в соответствии с надписью) или смесь в объеме 0,002-0,01 мл. Нанесение осуществляют прикосновением острого конца заполненной микропипетки к бумаге в отмеченную точку и быстром ее поднятии. При этом на бумаге должно оставаться пятно диаметром не более 3-4 мм. После полного подсыхания пятна операцию повторяют. Так поступают до тех пор, пока весь раствор из микропипетки не будет перенесен на отмеченную точку (стартовую линию). В центре хроматограммы просверливают отверстие (2) и в него вставляют фитилек (трубочку, скрученную из хроматографической бумаги). Фитилек (3) должен плотно прилегать к краям отверстия, высота его должна быть несколько меньше, чем внутренняя высота камеры. 3. Приготовление растворителя. В колбу объемом 100 мл приливают бутанол, уксусную кислоту и воду в соотношении 12:3:5 и тщательно перемешивают. Полученный раствор наливают в одну из половин чашки Петри по 15-20 мл, приготовленного для разделения смеси аминокислот. 4. Разгонка аминокислот. Хроматограмму укладывают на половинку чашки так, чтобы фитилек располагался в центре и касался ее дна. Для уменьшения испарения растворителя хроматограмму накрывают второй половиной чашки, добиваясь совмещения краев чашек. Насыщенный неподвижной фазой растворитель по фитильку непрерывно поступает к центру хроматограммы и, двигаясь к краям, растворяет нанесенные аминокислоты и увлекает их за собой. При этом каждая из аминокислот движется по слою бумаги с определенной скоростью, что обусловлено коэффициентом распределения. Скорость аминокислот неодинакова, так как зависит от степени их растворения в неподвижной и подвижной фазе растворителя. Аминокислоты с полярными незаряженными, отрицательно и положительно заряженными (гидрофильными) радикалами движутся медленно, вместе с водой, некоторые чуть впереди воды. Аминокислоты с неполярными, гидрофобными радикалами перемещаются быстрее, так как вода, продвигаясь по бумаге, выталкивает их, а бутилово-уксусная фракция – увлекает за собой. Скорость перемещения аминокислот одновременно зависит от величины и объема радикала. После того как растворитель дойдет почти до краев чашки, хроматограмму снимают, удаляют фитилек, простым карандашом проводят линию между сухой и мокрыми зонами бумаги (отмечают границу фронта растворителя) и высушивают в вытяжном шкафу. 5. Проявление. Хроматограмму смачивают в налитом в ванночку растворе с массовой концентрацией нингидрина в ацетоне 1 %, вновь высушивают в вытяжном шкафу и помещают для развития окраски пятен аминокислот на 1,5-2 мин в сушильный шкаф при температуре 100 С или прогревают над плиткой до полного развития окраски комплексов аминокислот с нингидрином. 6. Определение коэффициента подвижности аминокислот. Описывают кратко принцип метода бумажной хроматографии, определяют Rf аминокислот-метчиков и аминокислот смеси, идентифицируют аминокислоты смеси, хроматограмму зарисовывают. Замеряют расстояние, пройденное каждой аминокислотой от точки старта до середины пятна (а), и расстояние пройденное растворителем в данном секторе (в). По формуле рассчитывают коэффициент подвижности: Rf = а/в. 7. Идентификация аминокислот, содержащихся в смеси, осуществляется по совпадению их позиций с позицией аминокислот-метчиков на хроматограмме, по совпадению коэффициентов подвижности и по однородности окраски пятен. Rf для аминокислот при разделении на бумаге растворителем, состоящим из бутанола, уксусной кислоты и воды в соотношении 12:3:5 приведены в табл.7. Таблица 7. Коэффициенты подвижности аминокислот (Rf)
Хроматографический метод позволяет произвести и количественное определение аминокислот в смеси. Для этого пятна аминокислот смеси и аминокислот-метчиков обводят карандашом, нумеруют, вырезают, делают в них надрезы и помещают в пробирки с соответствующим пятну номером. Затем в пробирки наливают по 3 мл насыщенного сульфатом меди раствора с объемной концентрацией этанола 80 %, содержимое в пробирках перемешивают и ставят в темное место на 30 мин (каждые 10 мин содержимое пробирок перемешивают). Окраска с бумаги переходит в раствор этанола с образованием медных производных сине-фиолетового Руэмана, окрашенных в красный цвет. Оптическую плотность окрашенных растворов аминокислот-метчиков и аминокислот смеси измеряют при 540 нм (зеленный светофильтр) на ФЭКе против насыщенного сульфатом меди раствора с объемной концентрацией этанола 80 %. Массовую концентрацию каждой аминокислоты в смеси рассчитывают по формуле:  ,где, ^ – массовая концентрация аминокислоты-метчика (свидетеля), мг/мл; - объем нанесенного на хроматограмму раствора аминокислоты-метчика, мл; ^ пр – оптическая плотность раствора с пятна аминокислоты смеси; Dсв – оптическая плотность раствора с пятна аминокислоты метчика. Результаты расчетов по количественному составу аминокислот смеси записывают и делают окончательный вывод по всей работе. РЕАКТИВЫ. Хроматографическая бумага; вода дистиллированная; органический растворитель (бутанол, ледяная уксусная кислота, вода в соотношении по объему 12:3:5); этанол; раствор с массовой концентрацией нингидрина в ацетоне 1 %; смесь аминокислот (взвешивают по 10 мг лизина, аланина и лейцина, смешивают вместе и растворяют в 10 мл раствора с объемной концентрацией этанола 80 %, при отсутствии какой-либо из аминокислот для приготовления смеси можно взять другие аминокислоты с существенно отличающимися величинами Rf); растворы аминокислот-метчиков, или «свидетелей» (10 мг каждой из аминокислот, взятых для приготовления смеси, растворяют в отдельных флаконах в 10 мл раствора с объемной концентрацией этанола 80 %); раствор с объемной концентрацией этанола 80 % насыщенный сульфатом меди. ^ 1. Общая характеристика метода хроматографии и ее роль в биохимии. 2. Назовите основные виды хроматографии. 3. Общая характеристика принципа хроматографии. 4. Назовите разновидности метода хроматографии на бумаге и чем они отличаются. 5. Назовите основные этапы радиальной хроматографии на бумаге. 6. Техника разметки и маркировки хроматографической бумаги. 7.Техника нанесения растворов в точки старта. 8. Состав и техника приготовления растворителя для «разгонки» аминокислот на бумаге. 9. От чего зависит скорость движения аминокислот в процессе хроматографии. Проявление аминокислот. 10. Как рассчитывается коэффициент подвижности (Rf) и что он характеризует? 11. Что такое «идентификация аминокислот» и как её проводят. 12. Назовите основные этапы количественного определения аминокислот методом хроматографии на бумаге. 13. Техника экстрагирования окрашенных пятен. 14. Как определяется содержание аминокислот в 1 мл смеси. Глава 3. Ферменты Ферментами (энзимами) называют специфические белки, обладающие каталитическим действием. Они входят в состав всех клеток и тканей живых организмов и способны катализировать реакции, как внутри организма, так и при оптимальных условиях вне его (например, свертывание молока пепсином, сычужным ферментом, гидролиз сахарозы и т.п.). Ферменты синтезируются в клетках живых организмов постоянно. Подобно неорганическим катализаторам ферменты повышают скорость химических реакций за счет понижения энергии активации. Однако делают они это с более высокой эффективностью ( в 105-1012 раз) при температуре 36-50 ºС и рН близких к 7,0. ^ Источником для получения ферментов служат различные биологические объекты: свежие и свежезамороженные животные и растительные ткани, семена растений, биологические жидкости, микроорганизмы. Извлекают ферменты из этих объектов посредством экстрагирования водой, водными растворами глицерина, нейтральных солей, буферными растворами при одновременном механическом разрушении клеточных структур. Выделяют ферменты при температуре близкой к нулю. Хранят растворы ферментов только в холодильнике, причем и в этих условиях они быстро теряют активность. В связи с тем, что процедура выделения индивидуальных ферментов чрезвычайно сложна, работу часто проводят с так называемыми ферментными препаратами, представляющими собой частично очищенные ферменты или вытяжки из биологических объектов. Вещество, превращение которого вызывает фермент, называют субстратом; выдерживание субстрата с ферментом – инкубацией. О присутствии фермента в биологическом объекте или вытяжке из него судят по превращению соответсвующего субстрата. ^ Амилазы – ферменты, ускоряющие реакцию гидролиза крахмала. Они содержатся в тканях животных и растений, микроорганизмах, слюне, молоке, крови и др. жидкостях организма. Высокой амилазной активностью обладают слюна и солод. Слюна и другие пищеварительные соки животных и человека, являются концентрированными растворами ферментов. В слюне содержится α-амилаза – фермент гидролизующий крахмал. ХОД РАБОТЫ. Хорошо прополаскать ротовую полость, вымыть пробирку проточной водой, набрать в рот 2-3 мл раствора с массовой долей хлорида натрия 1 % и держать 4-5 мин. Полученный таким образом раствор слюны собирают в пробирку и используют как раствор α-амилазы . Для обнаружения амилазы в слюне и определения её активности, из полученного раствора отливают около 1 мл во вторую чистую пробирку и приливают двойной объем 1 % раствора крахмала и содержимое перемешивают путем плавного одноразового переворачивания пробирки, закрыв её пальцем. Смесь фермента с субстратом инкубируют в термостате при температуре 37-38 ˚С в течении 10 мин. По истечении указанного времени наличие фермента и его активность определяют пробой с йодом: в пробирку вносят 1-2 капли раствора Люголя (по 1 капли на 1 мл содержимого) и встряхивают. По окраске появившейся в пробирке можно сделать вывод о продуктах реакции и активности фермента. В табл. 8 приведены продукты гидролиза крахмала, их названия и окраски с йодом. Таблица 8 Продукты гидролиза крахмала
По результатам реакции сделать вывод о глубине гидролиза и активности ферментов. ^ Пророщенные зерна ячменя пшеницы и других злаковых растений обладают высокой амилазной активностью. Амилазы (3.3.1.-) – ферменты, катализирующие гидролиз крахмала и родственных полисахаридов, относятся к классу гидролаз (3), подклассу гликозидаз (3.2.), подподклассу D-гликозидаз (3.2.1.). Амилазы гидролизуют как, неизмененные крахмальные зерна, так и оклейстеризованный крахмал. Причем, действие амилаз на оклейстеризованный крахмал значительно эффективнее, чем на неизмененные зерна, поэтому в спиртовой промышленности, перед осахариванием крахмала солодом производят заваривание муки или картофеля. По свойствам, распространению в природе и способу действия на крахмал различают: α-амилазу, β-амилазу, глюкоамилазу и амилопектин-1,6-глюканогидролазу. α-Амилаза (К.Ф. 3.2.1.1.) – систематическое название 1,4-α-D-глюкан-глюканогидролаза, старые названия – диастаза, птиалин, гликогеназа, декстриногенамилаза. Этот фермент содержится в слюне, соке поджелудочной железы, плесневых грибах, проросшем зерне пшеницы, ржи, ячменя. Обнаружена активность α-амилазы в непроросших семенах ржи и сорго. α-Амилаза катализирует без определенного порядка гидролиз внутренних 1,4-α-гликозидных связей в полисахаридах, содержащих три и более остатков α-D-глюкозы. При действии α-амилазы на крахмал образуются главным образом декстрины небольшой молекулярной массы и незначительное количество мальтозы. α-Амилаза чувствительна к подкислению (оптимум рН 5,6-6,3), но термостабильна (температурный оптимум 65 ºС). При высокой α-амилазной активности пшеничной муки (обычно полученной из проросшего зерна пшеницы и ржи в тесте происходит накопление декстринов, (декстрины не сбраживаются дрожжами), что приводит к ухудшению качества хлеба – его пористости, физических свойств мякиша, вкуса. β-Амилаза (КФ 3.2.1.2.), систематическое название 1,4- α-D-глюкан-мальтогидролаза, старые названия – диастаза, сахарогенамилаза, гликогеназа. Этот фермент содержится в непроросшем зерне пшеницы, ржи, ячменя, соевых бобах. Он катализирует гидролиз 1,4-α-гликозидных связей в полисахаридах, последовательно отщепляя остатки мальтозы от нередуцирующих концов цепей. β-Амилаза расщепляет амилозу полностью до мальтозы. Амилопектин она гидролизует с образованием мальтозы и декстринов, дающих коричнево-красное окрашивание с йодом (декстрины более высокой молекулярной массы по сравнению с декстринами, образующимися при действии α-амилазы). Действие β-амилазы прекращается в точках ветвления молекулы амилопектина. β-Амилаза более активна в кислой среде (оптимум рН 4,8), но термолабильна (температурный оптимум 51˚С). Этот фермент способствует накоплению мальтозы в тесте, что приводит к более интенсивному брожению. Глюкоамилаза (КФ 3.2.1.3.) или экзо-1,4-α-D-глюкозидаза имеет систематическое название 1,4-α-D-глюкан-глюкогидролаза. Она гидролизует крахмал с образованием преимущественно глюкозы и небольшого количества декстринов. Препараты глюкоамилазы получают из плесеневых грибов. С помощью этого фермента получают из крахмала глюкозную патоку и кристаллическую глюкозу. Амилопектин-1,6-глюканогидролаза (КФ 3.2.1.41) подвергает гидролизу 1,6-α-гликозидные связи в амилопектине, гликогене. ХОД РАБОТЫ. 20 г измельченного солода растирают в ступке с небольшим количеством воды до однородной массы и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл объем доводят водой до метки, содержимое перемешивают и оставляют на льду на 2 часа (можно поставить в холодильник на ночь). По истечении времени экстрагирования содержимое перемешивают и центрифугируют в течении 10 мин со скоростью 3000 об/мин. Центрифугат используют в качестве источника амилазы. ^Сахараза из дрожжей имеет более правильное рабочее название β-фруктофуранозидаза (КФ 3.2.1.26), катализирует гидролиз β-гликозидных связей в молекулах как сахарозы, так и раффинозы. При этом сахароза расщепляется на глюкозу и фруктозу, а раффиноза – на фруктозу и мелибиозу. ХОД РАБОТЫ. В фарфоровую ступку вносят 1 г прессованных пекарских дрожжей и тщательно растирают в 3 мл воды в течение 5 мин . Затем добавляют 17 мл воды, перемешивают и ставят ступку в термостат при 37 ˚С на 20 мин. Через каждые 5 мин содержимое перемешивают. По истечении указанного времени смесь переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 10 мин со скоростью 3,5 тыс об/мин. Надосадочную жидкость сливают в пробирку и используют как водный экстракт сахаразы. РЕАКТИВЫ. Растворы с массовыми долями: 1% хлорида натрия и крахмала; размолотый солод; раствор Люголя (0,3 г кристаллического йода и 3 г йодида калия растворяют в 5 мл воды и после полного растворения йода объем доводят до 100 мл водой). ^ 1. Химическая природа ферментов, их строение и структура. 2. Функция ферментов. 3. Сырье и источники для получения ферментов. 4. Источники и техника получения амилаз. 5. Биологическое сырье и техника выделения β-фруктофуранозидазы. 6. Основные этапы и условия выделения ферментов из биологического материала. 7. Характеристика чистого фермента и ферментного препарата. 8. Что такое субстрат, фермент, инкубация?
^ Специфичность действия ферментов – это способность катализировать одну или несколько близких реакций, преобразовывать одно вещество или один вид связей. Специфичность ферментов бывает нескольких видов: абсолютная, относительная (групповая), стереохимическая. Ферменты отличаются от катализаторов небиологической природы высокой специфичностью, что обусловлено индивидуальными особенностями строения активных центров различных ферментов. Пространственная структура активного центра предопределяет не только комплементарность субстрату, но и природу последующих превращений субстрата в фермент- субстратном комплексе, приводящих к образованию соответствующего продукта. Будучи высокоспецифичной, ферментативная реакция протекает в 105-1012 раз быстрее, чем самопроизвольная (спонтанная) реакция. ^ Для изучения специфичности этих ферментов используем амилазу слюны и сахаразу хлебопекарных дрожжей. Амилаза слюны (3.2.1.1) по механизму действия является -амилазой. Катализирует гидролиз -1,4-гликозидных связей в молекуле крахмала (и гликогена) без определенного порядка. Процесс гидролиза происходит как бы ступенчато и может быть выражен в виде схемы: Крахмал Амилодекстрины Эритродекстрины Ахродекстрины Мальтодекстрины Мальтоза. Глубину гидролиза крахмала можно контролировать по цветной реакции с раствором йода (см. табл. 8). Сахараза из дрожжей имеет более правильное рабочее название -фруктофуранозидаза (3.2.1.26). Катализирует гидролиз -гликозидных связей в молекулах как сахарозы, так и раффинозы, при этом сахароза расщепляется на глюкозу и фруктозу, которые обнаруживаются реакцией Троммера. ХОД РАБОТЫ. Берут 6 пробирок и пробы для опыта готовят в соответствии с табл. 9. Таблица 9 Схема изучения специфичности действия ферментов
Содержимое перемешивают и пробирки помещают в термостат при 37-38 С на 20 мин. После инкубации с пробирками № 1, 2 и 3 , где в качестве субстрата был крахмал, проводят пробу с йодом, с другими (№ 4, 5, 6), где в качестве субстрата была сахароза проделывают реакцию Троммера. ^ . К содержимому пробирок добавляют 2 мл раствора с массовой долей гидроксида натрия 10 %, при встряхивании по каплям раствор с массовой долей сульфата меди 5 % до появления неисчезающей мути гидроксида меди (II). Содержимое пробирок нагревают на водяной бане до изменения цвета. Появление желтого окрашивания, переходящего в красное, указывает на наличие восстанавливающих сахаров (глюкозы и фруктозы), которые в щелочной среде восстанавливают гидроксид меди (ІІ) в оксид меди (І), сами при этом окисляются до альдоновых кислот. Результаты опыта вносят в табл. 9 и делают вывод о специфичности амилазы слюны и сахаразы из дрожжей. РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная; растворы с массовыми долями: крахмала 1 %, соляной (или серной) кислоты 10 %, сахарозы 1 %, гидроксида натрия 10 %, сульфата меди 5 %; водный раствор йода; слюна разбавленная 1:3; сахараза. ^
^ Ферменты отличаются от неорганических катализаторов исключительно высокой каталитической активностью в условиях нормальной температуры, рН и давления. ХОД РАБОТЫ. В пять пробирок наливают по 3 мл раствора с массовой долей крахмала 1 %. В первую и пятую добавляют по 1 мл воды, во вторую – 1 мл вытяжки из солода, в третью и четвертую – по 1 мл раствора с массовой долей серной или соляной кислоты 10 %. Содержимое перемешивают встряхиванием и первые три пробирки ставят в термостат при 37-38 С, а четвертую и пятую – в кипящую водяную баню. Через 20 мин пробирки из термостата и водяной бани убирают, горячие охлаждают до комнатной температуры и в каждую добавляют по 3 капли водного раствора йода. Расщепление крахмала шло в тех пробирках, где содержимое окрашено в желтые, красные и фиолетовые тона. Записывают окраску содержимого каждой пробирки и на основании полученных результатов делают вывод о том, какие из исследованных веществ являются катализаторами и при какой температуре происходит их каталитическое действие. Результаты оформить в виде табл. 10. Таблица 10 Сравнение действия неорганических катализаторов и ферментов
РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная; растворы с массовыми долями: крахмала 1 %, соляной (или серной) кислоты 10 %; водный раствор йода; вытяжка из солода. ^ 1. В каких пробирках отмечен гидролиз крахмала и какова его глубина? 2. Назовите катализаторы, которые осуществили гидролиз крахмала в данном опыте. 3. Назовите наиболее эффективный катализатор и объясните его преимущества. 4. Как влияла температура на активность небиологического катализатора и почему? ^ Белковая природа обеспечивает ферментам характерные для белков строение и свойства и, прежде всего, лабильность, т.е. способность изменять активность в зависимости от различных факторов (температуры, рН, концентрации фермента и концентрации субстрата, активаторов и ингибиторов и т.п.). Степень изменения активности от различных факторов можно определить по скорости ферментативной реакции. Мерой скорости ферментативной реакции служит количество субстрата, подвергшегося превращению в единицу времени, или количество образовавшегося продукта. При изучении влияния какого-либо фактора на скорость ферментативной реакции все прочие факторы должны оставаться неизменными и по возможности иметь оптимальные значения. ^ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ (на активность ферментов) Скорость ферментативной реакции зависит от температуры. Оптимальным считается то значение ее, при котором реакция протекает с максимальной скоростью. Для большинства ферментов, выделенных из организма теплокровных и многих микроорганизмов оптимальная температура составляет 37-40 С, для ферментов растительного происхождения – 40-50 ˚С. Повышение температуры сверх оптимальной приводит к уменьшению, а затем прекращению действия фермента, что связанно с денатурацией. При переходе от оптимальной к низким температурам скорость ферментативной реакции падает в 2-2,5 раза на каждые 10 ˚С, достигая минимальной величины при 0 С и приостанавливается при отрицательных её значениях (минус 18 ˚С). Причиной является снижение скорости движения молекул субстратов и ферментов, что замедляет образование фермент-субстратного комплекса и проведения реакции. При повышении температуры от отрицательных значений действие ферментов восстанавливается, скорость катализируемых реакций возрастает в 2-2,5 раза на каждые 10 ˚С, до оптимальной температуры. Принцип снижения активности ферментов при понижении температуры используется при консервировании сырья и готовой продукции низкими температурами. Инактивация ферментов высокой температурой необратима, используется в пищевой промышленности для консервирования многих продуктов растительного и животного происхождения. ХОД РАБОТЫ. В штативе располагают двумя рядами 8 пробирок (по 4 пробирки в ряду). Во все пробирки одного ряда наливают по 3 мл раствора крахмала; во все пробирки другого ряда по 0,5 мл вытяжки из солода. Первые пробирки из обоих рядов (одна с ферментом, другая с крахмалом) помещают в кипящую водяную баню, вторые – в термостат при 37-38 С, третьи – в лед или снег, четвертые оставляют при комнатной температуре. Через 10 мин содержимое каждой пары пробирок объединяют вместе (приливают крахмал к ферменту), перемешивают и пробирки с содержимым оставляют в тех же условиях. Этот момент считать началом опыта. Не теряя времени, берут 3 чистые пробирки, вносят в них по 0,5-1 мл воды и по 3 капли раствора йода. Эти пробирки нужны для наблюдения за ходом гидролиза крахмала амилазой по реакции с йодом. По истечении 2-5 мин инкубации из пробирки, стоящей при комнатной температуре, отбирают 0,2-0,3 мл инкубируемой смеси и вносят ее в одну из пробирок с раствором йода. Если появляется синее или фиолетовое окрашивание, то все пробирки оставляют в тех же условиях еще на 5 мин. После истечения этого времени реакцию с йодом повторяют. В случае появления красных тонов окраски содержимого пробирки, стоящей при комнатной температуре, инкубацию прекращают. Сразу же все пробирки собирают в штатив и в каждую добавляют по 1 мл раствора с массовой долей серной (или соляной) кислоты 10 % и по 3 капли раствора йода, содержимое перемешивают. Глубину гидролиза крахмала определяют по окраске с раствором йода, результат записывают в следующую таблицу. Таблица 11 Влияние температуры на активность ферментов
На основании полученных данных строят график зависимости скорости ферментативной реакции от температуры. При построении графика по оси ординат, начиная от нуля, обозначить цвета в следующей последовательности: синий, фиолетовый, красный (объединяя все его тона), оранжевый, желтый; по оси абсцисс – температуру, обозначив разрыв между 40 и 100 С. Записать принцип метода и сделать выводы. РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная; вытяжка из солода; раствор йода в йодиде калия; растворы с массовыми долями: крахмала 1 %, серной (или соляной) кислоты 10 %. ^ 1. Перечислите факторы среды, влияющие на активность ферментов (скорость ферментативной реакции). 2. Назовите оптимальные температуры для ферментов животного, растительного и микробного происхождения. 3. Как влияет снижение температуры, от оптимальной до 0˚С и ниже, на скорость ферментативной реакции. Чем можно объяснить влияние этого фактора? 4. Как влияет повышение температуры от минусовых значений до оптимальной, на скорость ферментативной реакции? 5. Как влияет повышение температуры от оптимальной до 70 ˚ С и выше, на активность фермента. Чем объясняется влияние этого фактора? 6. Какая температура, в исследовании, была оптимальной, и как Вы это установили? 7. При каких температурах в исследовании, амилаза «не работала». Как Вы это установили? Объясните влияние этих факторов? 8. Практическое использование знаний о влиянии температуры на активность ферментов. ВЛИЯНИЕ рН НА СКОРОСТЬ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ Ферменты при постоянной температуре работают наиболее эффективно в пределах рН (от 2 до 10) . Оптимальным считается то значение рН, при котором реакция протекает с максимальной скоростью. Отклонение в любую сторону от этого значения сопровождается снижением скорости ферментативной реакции. Это объясняется тем, что ферменты имеют большое число полярных, положительно и отрицательно заряженных групп, участвующих в поддержании нативной конформации, образовании фермент-субстратного комплекса и проведении реакции. Во многих случаях субстраты являются электролитами, и реакция осуществляется лишь с определенными (ионизированными или неионизированными) их формами, возникающими при оптимуме рН. Многие ферменты являются двухкомпонентными (сложными белками), небелковый компонент которых слабо связан с белком ионными, водородными связями в условиях оптимума рН. Сдвиги рН за пределы оптимума вызывают диссоциацию кофактора и разрушение структуры активного центра. Например, пероксидаза диссоциирует в кислой среде на два компонента, однако при рН 7,0 её структура и активность восстанавливаются. При очень низких и очень высоких значениях рН ферменты денатурируют. ВЛИЯНИЕ рН НА АКТИВНОСТЬ АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ ХОД РАБОТЫ. Перед началом работы определяют активность амилазы слюны. Для чего в пробирке смешивают 2 мл раствора с массовой долей крахмала 1 % и 0,5 мл разбавленной 1:9 и профильтрованной слюны. Смесь оставляют при комнатной температуре. Наблюдение за ходом гидролиза крахмала проводят по реакции с раствором йода. Для чего каждые 5 мин отбирают по 3-4 капли гидролизата и вносят его в пробирку с заранее налитыми туда 0,5 мл воды и 3 каплями раствора йода. При появлении красно-бурой или красной окраски наблюдение прекращают. Желательно, чтобы гидролиз крахмала до эритродекстринов (красные тона окраски) происходил приблизительно за 1015 мин. Если гидролиз идет быстрее, то слюну нужно разбавить еще в 2 раза и опыт повторить. Найденное разбавление слюны используют для работы. Нумеруют 5 пробирок и в каждую вносят по 4 мл буферного раствора с конкретным значением рН: 4,56; 5,72; 6,80; 7,96; 8,95 или близкими к каждому из этих значений. Пипетки после внесения каждого буферного раствора промывают. Во все пробирки добавляют по 2 мл раствора с массовой долей крахмала 1 % и по 0,5 мл разбавленной слюны. Содержимое перемешивают и пробирки оставляют при комнатной температуре. Наблюдение за ходом гидролиза крахмала ведут по реакции с раствором йода согласно методике, описанной на с. 42. Отбор проб производят из пробирки № 3 через каждые 5 мин. При появлении красного или желтого окрашивания содержимого сразу же во все пробирки вносят по 1 мл раствора с массовой долей соляной (или серной) кислоты 10 % и по 3 капли раствора йода. Содержимое перемешивают, результат вносят в табл. 12. Таблица 12 Влияние рН на активность амилазы слюны
__________ * При оформлении работы записать значения рН, указанные на флаконах. По результатам работы построить график зависимости активности амилазы слюны от рН и сделать вывод. Порядок построения графика описан в предыдущей работе. Записать принцип метода. ВЛИЯНИЕ рН НА АКТИВНОСТЬ АМИЛАЗЫ СОЛОДА. ХОД РАБОТЫ. Нумеруют 5 пробирок и в каждую вносят по 4 мл буферного раствора со следующими значениями рН: 2,87; 4,10; 5,33; 6,59; и 7,96 или близкими к каждому из этих значений. Пипетки после внесения каждого буферного раствора промывают. Во все пробирки добавляют по 2 мл раствора крахмала и по 0,5 мл вытяжки из солода. Содержимое перемешивают и в дальнейшем поступают точно так же, как описано на с. 42. Результат оформить в виде таблицы. Таблица 13 Влияние рН на активность амилазы солода
____________ * При оформлении работы записать значения рН, указанные на флаконах. Записать принцип метода, построить график глубины гидролиза крахмала амилазой солода в зависимости от рН. РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная; раствор йода в йодиде калия; вытяжка из солода; слюна разбавленная 1:9 (фильтрованная); растворы с массовыми долями: крахмала 1 %, серной (или соляной) кислоты 10 %; растворы для приготовления смесей с заданными значениями рН (раствор № 1 с рН 1,81: в колбе вместимостью 1 л растворяют 0,04 моль борной кислоты, 0,04 моль фосфорной кислоты, 0,04 моль уксусной кислоты; раствор № 2: представляет собой раствор с концентрацией гидроксида натрия 0,2 моль/л). Буферные растворы нужных значений рН готовят смешение раствора № 1 и раствора № 2 в соответствии с табл. 14. Таблица 14 Составление буферных растворов
После смешения фактическое значение рН определить на рН-метре, добавлением раствора № 1 или № 2 максимально приблизить к заданной величине и написать на флаконе. ^ 1. Как определить изменение активности амилазы под влиянием рН? 2. Характеристика оптимальных рН и её параметры для амилазы солода и слюны. 3. Каковы физико-химические основы влияния оптимальной рН на активность ферментов? 4. Каковы физико-химические основы влияния на активность ферментов сдвига рН от зоны оптимума в любую сторону? 5. Практическое применение знаний о влиянии рН на скорость ферментативных реакций и процессов. ^ В солоде (проросшем зерне пшеницы, ржи, ячменя) содержатся активные α- и β- амилазы. Они хорошо растворяются в воде, поэтому их можно получить в виде водной вытяжки. Выделение α- и β- амилазы из солодовой водной вытяжки основано на различной устойчивости этих ферментов к температуре и рН среды. При нагревании солодовой вытяжки до 70 ºС β-амилаза денатурирует, тогда как α-амилаза при этой температуре сохраняет нативную конформацию и активность. Оптимум действия β-амилазы проявляется при рН 4,8, однако α-амилаза при таких значениях рН теряет свою активность, а при понижении до рН 3,3 – денатурирует. ВЫДЕЛЕНИЕ α-АМИЛАЗЫ. В пробирку вносят 5 мл солодовой вытяжки, содержащей активные α- и β-амилазы, добавляют на кончике ножа порошок ацетата кальция и пробирку выдерживают в течении 15 мин. на водяной бане, нагретой до 68 ºС (в период нагревания температура воды не должна подниматься выше 70 ºС и опускаться ниже 66 ºС). Затем содержимое пробирки охлаждают холодной водой. При таком прогревании β-амилаза полностью инактивируется, а α-амилаза сохраняет свою активность. Полученный раствор используют для определения активности α-амилазы. ВЫДЕЛЕНИЕ β-АМИЛАЗЫ. В колбу вместимостью 50 мл вносят 5 мл солодовой вытяжки, содержащей активные α- и β-амилазы, добавляют 4 мл воды, 1 мл раствора с концентрацией соляной кислоты равной 0,1 моль/л (рН полученной смеси должен быть 3,3). Затем колбу с содержимым помещают на 15 мин на снег или лед (можно в морозильную камеру холодильника). В этих условиях α-амилаза полностью инактивируется, а β-амилаза сохраняет свою активность. По истечении 15 мин выдержки на холоде к содержимому колбы добавляют 2 мл раствора с концентрацией гидрофосфата натрия (Na2HPO4) 0,15 моль/л для того, чтобы рН довести до 6,0. Полученный раствор используют для определения активности β-амилазы. ^ (по массе гидролизованного крахмала) Действие амилаз на крахмал можно установить либо по убыли крахмала, либо по накоплению продуктов его распада – сахара. Метод определения активности амилаз по массе расщепленного крахмала получил название колориметрического. Принцип метода состоит в том, что активность амилаз рассчитывают по разности между массами взятого для опыта и оставшегося по окончании опыта нерасщепленным крахмала, определяемого фотометрическим анализом по цветной реакции с йодом. При проведении опыта продолжительность инкубации и объем раствора ферментного препарата устанавливают такими, чтобы в опытных пробирках (содержащих фермент) не произошел полный гидролиз крахмала. Данный метод позволяет установить специфичность и активность совместного действия амилаз на крахмал. α-Амилаза (КФ 3.2.1.1.) гидролизует в крахмале и родственных полисахаридах α-1,4-гликозидные связи без определенного порядка. В результате образуются декстрины и незначительное количество мальтозы. β-Амилаза (КФ 3.2.1.2.) гидролизует в крахмале и родственных полисахаридах α-1,4-гликозидные связи, последовательно отщепляя молекулы мальтозы с нередуцирующих концов цепочек. Наиболее эффективно гидролиз осуществляется под действием комплекса амилаз, содержащихся в вытяжке из солода. ХОД РАБОТЫ. Для проведения опыта берут 6 пробирок, одна из них контрольная. Пробирки заполняют в соответствии с табл. 15. Таблица 15 Определение активности амилаз солода
Содержимое в пробирках перемешивают и ставят в термостат при 37-38 ºС на 30 мин. Такая постановка опыта позволяет одновременно определить суммарную активность амилаз в солодовой вытяжке (α- и β-амилаз вместе), активность α-амилазы и активность β-амилазы. По окончании времени инкубации пробирки из термостата вынимают и в каждую немедленно добавляют по 2 мл раствора с концентрацией соляной кислоты 1моль/л и по 3 капли водного раствора йода; содержимое перемешать. Пробирки с содержимым, окрашенным в желтые тона, убирают. Пробирки с содержимым, окрашенным в синие, фиолетовые или красные тона оставляют для дальнейшей работы (если после добавления раствора йода все пробирки с одним и тем же ферментным препаратом будут окрашены в желтый цвет, то опыт следует повторить, взяв этот ферментный препарат в меньшем количестве). Берут мерные колбы вместимостью 50 мл, нумеруют их соответственно номерам, оставленных для дальнейшей работы пробирок. В каждую колбу вносят 30-40 мл воды, 0,5 мл раствора с концентрацией соляной кислоты 1моль/л, 10 капель водного раствора йода и 0,5 мл смеси из пробирки в соответствии с номером колбы. Непосредственно перед отбором смеси содержимое пробирки перемешивают. Содержимое колбы доводят до метки водой, перемешивают и колориметрируют на ФЭКе при красном светофильтре против воды. Активность амилаз выражают в мг расщепленного крахмала на 1г солода (или другого материала) за 1 мин. Расчет производят следующим образом:
Ек – Ео   m = • С,Ек где, m – масса расщепленного крахмала за время опыта, мг; Ек – оптическая плотность контрольного раствора; Ео – оптическая плотность опытного раствора; С – масса внесенного крахмала, мг (3 мл раствора с массовой долей крахмала 2 % содержат 60 мг крахмала); - полученный результат умножают на разбавление (см. табл. 15), т.е. приводят к 1 мл исходной ферментной вытяжки и затем делят на время инкубации (30 мин), что позволяет выразить активность амилазы в мг расщепленного крахмала 1 мл ферментной вытяжки за 1 мин. Зная методику приготовления вытяжки из биологического объекта, можно легко рассчитать активность амилазы в мг расщепленного крахмала на 1 г биологического материала за 1 мин по формуле: (Ек – Ео)• 60 •V  А = ,Ек• V1• m• 30 где, А – активность амилазы в мг расщепленного крахмала на 1г солода (или другого материала) за 1мин; Ек – оптическая плотность контрольного раствора; Ео – оптическая плотность опытного раствора; 60 – масса взятого для анализа крахмала, мг (в 3 мл 2 % раствора содержится 60 мг крахмала); V – общий объем солодовой вытяжки, полученной из солода (100 мл); V1 – объем ферментного препарата, взятого для инкубирования, мл; 30 – время инкубации, мин; m – масса солода, взятого для приготовления солодовой вытяжки. При расчете активности β-амилазы в числитель необходимо ввести число 2,4, которое учитывает все разведения солодовой вытяжки, сделанные при выделении β-амилазы. Результаты исследований записывают и делают выводы об активности амилаз солода. РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная; вытяжка из солода (приготовление см. с. 38); ацетатный буфер pH 5,5 (к 57,4 мл раствора с концентрацией уксусной кислоты 1 моль/л добавляют 50 мл раствора с концентрацией гидроксида натрия 1 моль/л и общий объем доводят водой до 500 мл); раствор с массовой долей крахмала 2 % (суспензируют 2 г растворимого крахмала в 20мл холодной воды, затем при помешивании добавляют 80 мл кипящей воды и кипятят 1 мин, после охлаждения объем доводят водой до 100 мл и содержимое перемешивают); раствор с концентрацией соляной кислоты 1 моль/л; раствор с массовой долей йода 0,3 % в растворе с массовой долей йодида калия 3 % (0,3 г йода кристаллического и 3 г йодида калия смешивают с 3-5 мл воды и после растворения йода объем доводят водой до 100 мл). ^ 1. Общая характеристика солода. 2. Какие ферменты содержатся в солоде и как их можно выделить? 3. Техника выделения α-амилазы. На чем она основана? 4. Метод выделения β-амилазы, на чем он основан? 5. Специфичность действия и активность α-амилазы. 6. Специфичность действия и активность β-амилазы. 7. Принцип колориметрического метода определения активности амилаз? Что положено в основу? 8. Расчет активности и характеристика полученных результатов. ^ Метод основан на нахождении максимального разведения жидкости, содержащей амилазу (вытяжка из солода, слюна, молоко, сыворотка крови и др.), при котором в стандартных условиях происходит полное расщепление определенного количества крахмала. ХОД РАБОТЫ. В штатив устанавливают и нумеруют 7 пробирок и в каждую вносят по 1 мл воды. Затем в первую пробирку добавляют 1 мл вытяжки из солода, тщательно перемешивают и 1 мл смеси из пробирки 1 переносят в пробирку 2. Содержимое тщательно перемешивают и 1 мл смеси из пробирки 2 переносят в пробирку 3 и т.д. Из последней пробирки 1 мл смеси после перемешивания выливают. Таким образом, получается ряд разведений, в котором содержание солодовой вытяжки в каждой следующей пробирке в 2 раза меньше, чем в предыдущей. После этого в каждую пробирку вносят по 2 мл раствора с массовой долей крахмала 1 % и содержимое перемешивают встряхиванием. Все пробирки помещают в термостат при 37-38 С на 30 мин. По окончании инкубации в каждую пробирку добавляют по 1 мл раствора с массовой долей серной кислоты 10 % (для остановки реакции) и по 3 капли водного раствора йода. Результат опыта вносят в табл. 16, обозначая окраску первыми буквами образовавшегося цвета раствора. Таблица 16 Окраска проб с йодом после инкубации
Отмечают, в каких пробирках произошел полный гидролиз крахмала (желтое окрашивание с йодом) и по последней из них рассчитывают активность амилазы (амилазное число). Допустим, полный гидролиз взятого для опыта крахмала произошел в 1, 2, 3 и 4 пробирках, следовательно, активность амилазы нужно считать по пробирке 4, в которой доля солодовой вытяжки составляет 1/16 мл. Пересчитав объем расщепленного крахмала на 1 мл солодовой вытяжки, получим число 32. Это означает, что 1 мл неразбавленной солодовой вытяжки в таких же условиях может расщепить 32 мл раствора с массовой долей крахмала 1 %, т.е. амилазное число составляет 32. При определении амилазной активности молока кратность разведения уменьшают в 8-10 раз, время инкубации увеличивают до 60 мин, для исследования применяют раствор с массовой долей крахмала 0,1 %. РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная; водная вытяжка из солода; растворы с массовыми долями: крахмала 1 % (суспендируют 1 г растворимого крахмала в 10 мл холодной воды, затем при помешивании добавляют 90 мл кипящей воды и кипятят 1 мин, охлаждают, доливают водой до 100 мл и перемешивают), серной кислоты 10 % (60,6 мл концентрированной серной кислоты влить в 0,5 л воды и разбавить в мерной колбе до 1 л) или соляной кислоты 10 % (236 мл концентрированной соляной кислоты влить в 0,5 л воды и разбавить в мерной колбе до 1 л); водный раствор йода. ^ 1. Принцип метода определения активности амилазы по Вольгемуту? 2. Техника получения разведений раствора амилаз. 3. Как определить максимальное разбавление амилазы, осуществившей полный гидролиз крахмала? 4. Расчет активности амилазы по Вольгемуту. ^ Активность ферментов, помимо температуры и рН, в значительной степени зависит от наличия и концентрации в реакционной среде некоторых ионов и соединений. Одни из них усиливают активность ферментов – активаторы, другие действуют угнетающе – ингибиторы. Одни из регуляторов – активаторы, присоединяясь к молекуле неактивного или малоактивного фермента, увеличивают активность до максимальной. Эту функцию часто выполняют ионы металлов: калия, кальция, магния, цинка, меди, железа, марганца, кобальта и анион хлора. Ряд протеиназ (катепсины, папаин), аргиназа активируются молекулами цистеина, восстановленного глютатиона, имеющих свободную НS-группу. Нарастание активности ферментов под действием металлов объясняется тем, что в одних случаях ионы металлов выполняют роль кофакторов, в других – облегчают образование фермент-субстратного комплекса, в третьих – способствуют присоединению кофермента к апоферменту, в четвертых обеспечивают стабилизацию третичной и четвертичной структуры фермента. Вещества, вызывающие частичное или полное торможение ферментных реакций, называют ингибиторами. К таким веществам относятся соли и ионы тяжелых металлов, дубильные вещества и др. Ключевые (регуляторные) ферменты имеют аллостеричский центр для присоединения активаторов и ингибиторов, которые, присоединившись, вызывают обратимое изменение в структуре активного центра. Аллостерические ферменты выполняют важную роль в регуляции процессов метаболизма. Установлено, роль активаторов чаще всего в этом случае выполняют молекулы собственного субстрата, когда их концентрация в среде достигает определенного уровня, а также АМФ и некоторые гормоны. В ряду ингибиторов для этих ферментов обнаружены неорганические соли, некоторые гормоны, конечный или промежуточный продукт многостадийного процесса распада или синтеза часто служит аллостерическим ингибитором одной из первых реакций (так называемое ингибирование по типу обратной связи). ХОД РАБОТЫ. В качестве источника фермента используют для работы вытяжку из солода. В штативе располагают тремя рядами 18 пробирок (6 пробирок в каждом ряду). Пробирки каждого ряда нумеруют и во все вносят по 1 мл воды. Затем в первую пробирку каждого ряда добавляют по 1 мл вытяжки из солода, содержимое хорошо перемешивают. Далее производят разбавление фермента так же, как в работе 3.6. После разбавления во все пробирки первого ряда наливают по 1 мл воды (контрольный ряд), в пробирки второго ряда – по 1 мл раствора с массовой долей хлорида натрия 1 % и в пробирки 3-го ряда – по 1 мл раствора с массовой долей сульфата меди 1 %. Затем во все пробирки приливают по 1 мл раствора с массовой долей крахмала 1 % в следующем порядке: сначала в первые пробирки всех рядов, после этого во вторые пробирки всех рядов и т.д. Содержимое перемешивают встряхиванием и штатив с пробирками ставят в термостат при 37-38С на 30 мин. По окончании инкубации в пробирки каждого ряда добавляют по 1 мл раствора с массовой долей серной (или соляной) кислоты 10 % и по 3 капли раствора йода в том же порядке, в каком приливался раствор крахмала. Содержимое перемешивают и отмечают в каждом ряду номер пробирки, в которой реакция на крахмал отрицательная (желтое окрашивание). Результаты опыта заносят в таблицу, обозначив желтые тона буквой «Ж», красные (красно-коричневые) – «К», фиолетовые – «Ф» и синие –«С». Таблица 17 Окраска проб с йодом после инкубации
Определяют активатор и ингибитор. Разделив степень разведения контрольной пробы (первый ряд), в которой реакция с йодом отрицательная, на степень разведения проб, давших отрицательную реакцию с исследуемыми веществами, находят во сколько раз активатор или ингибитор стимулирует или тормозит действие амилазы. При высокой активности амилазы солода число пробирок в опыте увеличивают до 7-8. РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная; вытяжка из солода; растворы с массовыми долями: крахмала 1 %; хлорида натрия 1 %; сульфата меди 1 %; серной (или соляной) кислоты 10 %; раствор йода в йодиде калия. ^ 1. Общая характеристика регуляторов ферментов. 2. Характеристика строения и действия активаторов. 3. Химическая природа и механизм действия ингибиторов. 4. Характеристика аллостерических (ключевых) ферментов и их роли в регуляции процессов метаболизма. 5. Схема опыта «Действие некоторых ионов на активность амилаз солода». 6. Каким методом, в этом опыте, определяли активность амилаз солода? 7. Какие соединения в опыте были активаторами и ингибиторами. Объясните механизм их действия. ^ Оксидоредуктазы – класс ферментов катализирующих окислительно-восстановительные реакции. Окисление мономеров, образующихся в процессе катаболизма полимеров, представляет собой сложный многоступенчатый процесс. Окисление веществ в клетках протекает, в основном, путем отщепления водорода (дегидрированием) или отщеплением электронов или путем присоединения кислорода к молекуле окисляемого соединения. Акцепторами водорода у дегидрогеназ является НАД+, НАДФ, ФАД и ФМН, у некоторых флавиновых – кислород (их называют оксидазами), у гемсодержащих (пероксидаз и каталазы) – Н2О2 (пероксид водорода). Акцепторами и переносчиками электронов являются цитохромы, содержащие гем (гемопротеины). Каталаза (КФ 1.11.1.6) относится к гемопротеинам, катализирует процесс разрушения ядовитого для клеток пероксида водорода на воду и кислород: 2 H2O2 = 2 H2O + O2. Для живой клетки пероксид водорода является сильным ядом, поэтому все ферменты образующие и обезвреживающие Н2О2 находятся в пероксисомах – органеллах покрытых мембраной. Главными потребителями Н2О2 являются пероксидазы (КФ 1.11.1.7.), которые окисляют фенолы, амины, некоторые гетероциклические соединения и др. субстраты дегидрированием, переносят снятые с субстратов [2Н] на Н2О2, восстанавливая его до 2 Н2О. Молекулы пероксида водорода, невостребованные пероксидазами, обезвреживаются каталазой. Метод определения активности каталазы основан на определении количества пероксида водорода, расщепленного в процессе инкубации с ферментом. Количество H2O2 в реакционной смеси определяют титрованием в кислой среде раствором с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л: 5 H2O2 + 2KMnO4 + 3H2SO4 = 2MnSO4 + K2SO4 + 5O2 +8H2O На основании приведенного уравнения реакции можно рассчитать, что 1 мл раствора с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л соответствует 1,7 мг (50 мкмоль) пероксида водорода. ХОД РАБОТЫ. 2-3 г сырого картофеля (или другого свежего растительного материала) тщательно растирают в ступке с кварцевым песком или стеклом. Для уменьшения кислой реакции добавляют на кончике скальпеля CaCO3 до прекращения выделения пузырьков СО2. В процессе растирания в ступку добавляют небольшими порциями 40-50 мл воды. Растертую массу количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят водой до метки и перемешивают. Смесь оставляют стоять 10-15 мин и после перемешивания фильтруют. Берут две конические колбочки вместимостью 150-200 мл и вносят в них по 20 мл полученного фильтрата. Содержимое одной колбы кипятят в течение 1 мин и охлаждают до комнатной температуры (контроль). Другая колба опытная содержит активный фермент. К содержимому опытной и контрольной колб приливают по 20 мл воды и по 3 мл раствора с массовой долей H2O2 1 %. Содержимое тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. По окончании инкубации в обе колбы добавляют по 5 мл раствора с массовой долей серной кислоты 10 %, перемешивают и избыток H2O2 в каждой колбе оттитровывают раствором с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л до образования розового окрашивания, не исчезающего в течение 1 мин. Активность каталазы выражают в мкмоль пероксида водорода, расщепившегося под действием фермента в расчете на 1 г исследуемого материала (или на 1 мг вытяжки из него) за 1 мин. Вычисление ведут по формуле:  ,где ^ – разность между объемами раствора с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л, пошедшего на титрование контрольной (а) и опытной (b) проб, мл; Т – титр примененного для титрования раствора перманганата калия; 50 – коэффициент пересчета на мкмоль H2O2; 100 – общий объем приготовленного экстракта; m – масса взятого для анализа материала, г; 20 – объем фильтрата, взятого для анализа, мл; 30 – время инкубации, мин. Принцип определения, порядок анализа и результат анализа записывают. Активность каталазы можно определить и по объему кислорода, выделившегося после прибавления к исследуемому объекту H2O2. Этот принцип используют для определения активности каталазы в молоке, выражаемую каталазным числом, представляющим собой объем кислорода (мл) выделившийся за 2 часа при 25 С из добавленных к 15 мл молока 5 мг раствора с массовой долей H2O2 1 %. Молоко, полученное от здоровых животных, выделяет 0,7-2,5 мл кислорода, т.е. каталазное число натурального молока составляет не более 2,5. Молоко, полученное от больных животных (мастит и др.), и молозиво имеют повышенные каталазные числа, достигающие до 15. РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная; кальций углекислый (порошок); раствор с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л; растворы с массовыми долями: пероксида водорода 1 % (10 мл раствора с массовой долей H2O2 30 % разбавить водой до 300 мл), серной кислоты 10 %. ^ 1. Основные пути окисления субстратов в клетке. 2. Характеристика строения и действия НАД+- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ. 3. Характеристика строения и действия ФАД-зависимых дегидрогеназ. 4. Какие ферменты называют оксидазами? Их кофакторы. 5. Характеристика строения и действия пероксидаз и каталаз. 6. Характеристика строения и действия цитохромов. 7. Химизм, образование и пути обезвреживания пероксида водорода в клетках. 8. Метод определения активности каталазы. Глава 4. Углеводы и их обмен Углеводы – основной источник энергии для процессов жизнедеятельности человека, животных, растений и многих микроорганизмов. Кроме этого, метаболиты (промежуточные продукты обмена) углеводов служат материалом для синтеза многочисленных мономеров, а из мономеров – полимеров и других соединений. В продуктах питания человека, в кормах животных углеводы представлены полисахаридами – крахмалом, гликогеном, клетчаткой, пектиновыми веществами и др., а также олиго- и моносахаридами: сахарозой, мальтозой, лактозой, глюкозой, фруктозой и др. У растущих и развивающихся растений синтезируется резервный крахмал, который служит субстратом дыхания и источником метаболитов. В период созревания крахмал откладывается в плодах, клубнях, луковицах, семенах, зернах и служит запасным энергетическим материалом зародыша и источником многочисленных метаболитов. Использование (мобилизация) полисахаридов начинается с их гидролиза амилазами или расщепления путем фосфоролиза ферментом фосфорилазой. ^ Податливость субстрата к действию фермента получила название атакуемости. Атакуемость крахмала амилазами зависит от степени повреждения структуры крахмального зерна. Неповрежденные или механически поврежденные крахмальные зерна довольно устойчивы к действию амилазы, оклейстеренный крахмал (вареный) расщепляется амилазами с большей скоростью. Резервный крахмал семян, зерен злаковых и клубней гидролизуется только после набухания (обводнения). ХОД РАБОТЫ. Берут две пробирки. В одну вносят 5 мл раствора оклейстеренного крахмала, в другую – 5 мл раствора сырого крахмала (содержимое флакона перед отбором пробы тщательно перемешивают). В каждую пробирку добавляют по 1 мл разбавленной (1:1) слюны или вытяжки солода. Содержимое перемешивают, и пробирки ставят в термостат на 20 мин при 37-38 С. По окончании инкубации в пробирки добавляют по 3 капли раствора йода, содержимое хорошо перемешивают и по результатам опыта делают вывод. РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная; раствор йода в йодиде калия; растворы с массовыми долями: оклейстеренного крахмала 2 %; сырого крахмала 2 %; слюна разбавленная 1:1; вытяжка из солода. ^ 1. Назовите углеводы продуктов питания. 2. Роль углеводов для организма. 3. Углеводы растений, их роль. 4. Пути мобилизации полисахаридов в организме животных, растений и микроорганизмов. 5. Роль крахмала в зернах злаковых и развивающихся растениях. 6. Какие ферменты осуществляют мобилизацию крахмала и гликогена? 7. Действие амилаз на сырой и вареный крахмал. 8. Какой крахмал гидролизуется легче и почему? 8. Методы контроля (определения) активности амилаз. 9. Результаты определения скорости гидролиза сырого и вареного крахмала амилазами солода. ^ Основным источником энергии для клеток животных, растений и многих бактерий, является окисление глюкозы, протекающее в две стадии: анаэробную и аэробную. Анаэробная стадия окисления глюкозы в клетках человека и животных получила название гликолиз. Гликолиз является первым, а в анаэробных условиях основным процессом катаболизма глюкозы, освобождающаяся при этом энергия аккумулируется в молекулах АТФ. Гликолиз протекает в цитоплазме, состоит из 10 реакций и условно делится на три фазы. Первая – активирование глюкозы (пусковая реакция) и подготовка к расщеплению на две фосфотриозы; расщепление фруктозо-1,6-дифосфата и изомеризация дигидроксиацетонфосфата в глицеральдегид-3-фосфат.   |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям