Весь курс предусматривает 36 занятий, из них 23 занятия помещены в первой части пособия и 13 во второй. Теоретическая часть включает перечень учебных вопросов, рассматриваемых по данной теме, которые должен знать студент
|
|
Скачать 1.29 Mb.
|
|
Предисловие Данное пособие состоит из двух частей, соответствует программе по биохимии для студентов высших медицинских учебных заведений, утвержденной Минздравом Республики Беларусь, и предназначено для студентов 2-го курса, изучающих биохимию. Весь курс предусматривает 36 занятий, из них 23 занятия помещены в первой части пособия и 13 – во второй. Теоретическая часть включает перечень учебных вопросов, рассматриваемых по данной теме, которые должен знать студент. В практической части приведены ситуационные задачи и лабораторные работы. Подробное описание лабораторных работ включает такие важные для понимания и усвоения методов биохимических исследований элементы, как принцип метода, ход работы, в ряде случаев меры предосторожности, необходимые для выполнения работы, клинико-диагностическое значение данной работы, которое завершается выводами, основанными на полученных результатах. В первой части пособия описаны темы практических занятий, касающихся общих вопросов биохимии, в частности, таких разделов, как введение в биохимию, современные методы биохимических исследований, строение и функции белков, энзимология, биоэнергетика, биохимия углеводов, липидов, белков и нуклеиновых кислот. Во второй части рассматриваются темы, непосредственно касающиеся проблем клинической биохимии: биохимия гормонов и витаминов, а также отдельных органов, тканей и систем организма, биохимия крови, почек, печени, нервной, мышечной системы, миокарда и соединительной ткани. В конце каждого раздела имеется перечень вопросов для контроля и самоконтроля, что поможет студенту в закреплении знаний по конкретной изучаемой теме и подготовке к сдаче контрольных занятий и экзаменов. Раздел "Биохимия липидов" написан совместно с доцентом кафедры биохимии ГГМИ, канд. биол. наук В. Т. Свергун Автор выражает признательность аспиранту кафедры биохимии А. Н.Ковалю, а также всем, кто помогал в подготовке рукописи к изданию.
Занятие 1 Введение в биохимию. Современные методы исследования. Строение и функции белков Цель занятия: сформировать представление о биохимии как фундаментальной медико-биологической науке. Изучить структуру и физико-химические свойства белков. Научиться определять содержание общего белка в плазме крови биуретовым методом. Исходный уровень знаний и навыков Студент должен знать:
Студент должен уметь:
Структура занятия
а) на уровне целого организма:
- при удалении органа; - изменении диеты (голодание или усиленное питание); - приеме лекарств; - введении специфических ядов и токсинов;
б) перфузия изолированного органа; в) использование тканевых срезов; г) использование целых клеток; д) использование гомогенатов; е) выделение изолированных клеточных органелл; ж) метод субфракционирования клеточных органелл; з) выделение метаболитов и ферментов; и) клонирование генов, кодирующих ферменты и другие белки.
Задачи
Асп-Асн-Глн-Сер-Глу-Вал-Тир-Лиз-Гис-Гли-Ала а б в г д е ж з и к л выберите и напишите формулы тех из них, которые: а) могут образовывать водородные связи; б) могут участвовать в гидрофобных взаимодействиях; в) остальные. ^ Лабораторные работы 1 и 2 выполняются по соответствующим инструкциям. Лаборатоpная работа № 3. Количественное определение общего белка в сыворотке крови биуретовым методом (УИРС) ВНИМАНИЕ! Соблюдать меры безопасности при работе с гидроксидом натрия. ^ В щелочной среде пептидные связи белка образуют с ионами двухвалентной меди комплекс фиолетового цвета. Интенсивность окраски раствора прямо пропорциональна концентрации белка, определяемой фотометрически. ^ . В пробирку наливают 0,05 мл сыворотки крови, затем добавляют 2,5 мл биуретового реактива. Содержимое пробирки осторожно перемешивают, избегая пенообразования, и через 30 мин фотометрируют в кюветах 5 мм при 540 нм (зеленый светофильтр) против контрольного раствора (дистиллированная вода). Измерив экстинкцию исследуемого раствора, по калибровочной кривой определяют концентрацию белка. ^ Нормальное содержание белка в сыворотке крови у взрослых людей – 65–85 г/л, у детей – 58–85 г/л. Повышенное содержание белка в сыворотке крови (гиперпротеинемия) встречается редко. Это наблюдается при ревматизме, миеломной болезни. Кратковременная относительная гиперпротеинемия отмечается при сгущении крови из-за значительных потерь жидкости, например, при усиленном потоотделении, неукротимой рвоте, профузных поносах, несахарном диабете, холере, тяжелых ожогах. Снижение уровня белка в крови (гипопротеинемия) наблюдается при нефритах, злокачественных опухолях, длительном голодании и др. Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагностическую оценку. Рекомендуемая литература Основная
Дополнительная
Занятие 2 Строение и функции белков. Строение и свойства ферментов Цель занятия: закрепить знания по структуре белков, сформировать представления о строении и свойствах ферментов. Научиться выполнять качественные реакции на активность некоторых гидролитических ферментов. ^ Студент должен знать:
Студент должен уметь:
Структура занятия
Задачи
а) о наличии белка в биологической жидкости; б) о первичной структуре белка; в) о конформации белка; г) о наличии некоторых аминокислот в структуре белка; д) о функции белка; е) о наличии числа уровней структурной организации?
а) количество кислорода, переносимое этими гемопротеидами; б) заметные различия структур; в) конформационные переходы субъединиц; г) различиями pH окружающей среды; д) различное значение pCO2 крови и ткани?
а) содержит каталитические и вспомогательные аминокислоты; б) создает благоприятное окружение для взаимодействия фермента и субстрата; в) является основным в формировании свойств третичной структуры фермента; г) может содержать дополнительные сайты небелкового строения, необходимые для каталитического действия; д) обязательно содержит SH-группы? ^ Лабораторная работа № 1. Цветные реакции на белки и аминокислоты Биуретовая реакция. Принцип метода. В щелочной среде пептидные связи белка образуют с ионами двухвалентной меди комплекс фиолетового цвета (см. уравнение).  ^ Ход работы. В три пробирки наливают по 5 капель растворов: в 1-ю – яичного белка, во 2-ю – желатина, в 3-ю – миозина. В каждую пробирку добавляют по 5 капель 10 %-го раствора гидроксида натрия и по 1 капле 1 %-го раствора медного купороса. Во всех пробирках наблюдают устойчивое сине-фиолетовое окрашивание. ^ Нингидриновая реакция. Принцип метода. Основан на образовании димера нингидрина и азота аминогруппы сине-фиолетового цвета (комплекс Руэмана см. уравнение). ^ К 5 каплям раствора белка прибавить 5 капель раствора нингидрина и прокипятить 1–2 мин. Появляется сине-фиолетовое окрашивание.  ^ Ксантопротеиновая реакция (Мульдера). Принцип метода. Основан на образовании нитросоединений ароматических и гетероциклических аминокислот, окрашенных в ярко-желтый цвет (см. уравнение). ^  ^ В три пробирки наливают по 5 капель растворов: в 1-ю – яичного белка, во 2-ю – желатина, в 3-ю – миозина. В каждую пробирку добавляют по 3 капли концентрированной азотной кислоты и осторожно кипятят. В первой пробирке образуется осадок желтого цвета, а во второй – слабое окрашивание, т. к. желатин не содержит циклических аминокислот. В 3 й пробирке образуется осадок белого цвета, переходящий в желтый цвет. Пробирки охлаждают и добавляют в каждую по 10–15 капель 20 %-го едкого натра до изменения окраски растворов вследствие образования натриевой соли динитротирозина. ^ Реакция на тирозин (Миллона). Принцип метода. Основан на образовании осадка ртутной соли динитротирозина кроваво-красного цвета (см. уравнение).  ^ Ход работы. В три пробирки наливают по 5 капель растворов: в 1-ю – яичного белка, во 2-ю – желатина, в 3-ю – миозина. В каждую пробирку добавляют по 3 капли реактива Миллона (раствор ртути в азотной кислоте) и осторожно нагревают. Отмечают изменение цвета в пробирках, характеризующее наличие в указанных белках тирозина. ^ Реакция Фоля (на аминокислоты, содержащие слабосвязанную серу). Принцип метода. Основан на щелочном гидролизе сульфгидрильных групп SH белка с последующим отщеплении серы в виде сульфида свинца (PbS) черно-бурого цвета (см. уравнение). ^  ^ В три пробирки наливают по 5 капель растворов: в 1-ю – яичного белка, во 2-ю – желатина, в 3-ю – миозина. В каждую пробирку добавляют по 5 капель реактива Фоля. Затем интенсивно кипятят и дают постоять 1–2 мин. При этом в 1-й и в 3-й пробирках образуется черный или бурый осадок сульфида свинца. Желатин осадка не образует, т. к. в нем нет серосодержащих аминокислот. ^ Лабораторная работа № 2. Реакции осаждения белков Принцип метода. Основан на денатурации и осаждении белков различными факторами. Осаждение белков при кипячении. ^ Ход работы. В 5 пробирок наливают по 5 капель раствора белка. Первую пробирку нагреть до кипения. Жидкость мутнеет, т. к. разрушаются водные оболочки вокруг молекулы белка, и происходит укрупнение его частиц. Мицеллы белка несут заряд и удерживаются во взвешенном состоянии. Во 2-й пробирке нагреть раствор до кипения и добавить 2 капли 1 %-го раствора уксусной кислоты до слабого подкисления. При отстаивании выпадает осадок белка. Частицы белка теряют заряд и приближаются к изоэлектрическому состоянию. В 3-ю пробирку добавить 5 капель уксусной кислоты для сильнокислой реакции среды. При кипячении жидкости осадка не образуется, поскольку белковые мицеллы перезаряжаются и несут положительный заряд, что повышает их устойчивость. В 4-ю пробирку налить 5 капель раствора уксусной кислоты, 2 капли насыщенного раствора хлористого натрия и нагреть. Выпадает белый хлопьевидный осадок, т. е. частицы белка теряют заряд. В 5-ю пробирку добавить 2 капли раствора гидроксида натрия. При кипячении осадок не образуется, т. к. в щелочной среде отрицательный заряд на частицах белка увеличивается. ^ Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами. ВНИМАНИЕ! Соблюдать меры безопасности при работе с концентрированными азотной и серной кислотами. Ход работы. В 2 пробирки наливают по 10 капель концентрированных кислот: азотной и серной. Наклонив пробирки под углом 45 градусов, осторожно по стенке пробирки приливают равный объем раствора белка так, чтобы обе жидкости не смешивались. На границе двух жидкостей образуется осадок в виде небольшого белого кольца. При добавлении избытка азотной кислоты осадок не исчезает, а при добавлении серной кислоты осадок растворяется. ^ Осаждение белков органическими растворителями. Ход работы. В 2 пробирки вносят по 5 капель раствора белка и прибавляют по 15–20 капель этилового спирта и ацетона. ^ Осаждение белков органическими кислотами. ВНИМАНИЕ! Соблюдать меры безопасности при работе с трихлоруксусной кислотой. Ход работы. В две пробирки наливают по 5 капель раствора белка и добавляют по 2 капли раствора ТХУ (трихлоруксусной кислоты) в одну и 2 капли сульфосалициловой – в другую. Следят за изменением растворов. ^ Лабораторная работа № 3. Разделение альбуминов и глобулинов методом высаливания (УИРС) Принцип метода. Основан на обратимой реакции осаждения белков из растворов с помощью высоких концентраций нейтральных солей (NaCl, NH4Cl, MgSO4 и др.). ^ К 1 мл неразведенного яичного белка добавляют 1 мл насыщенного раствора сульфата аммония и перемешивают. Получается полунасыщенный раствор сульфата аммония, в котором выпадает осадок яичного глобулина. Через 5 мин осадок отфильтровывают, в фильтрате остается яичный альбумин. Для высаливания альбуминов к фильтрату добавляют порошок сульфата аммония до полного насыщения, т. е. пока новая порция порошка остается нерастворенной. Выпавший осадок альбумина отфильтровывают. С фильтратом проделывают биуретовую реакцию. Отрицательная реакция указывает на отсутствие белка. Выводы по результатам работы. Рекомендуемая литература Основная
Дополнительная
Занятие 3 Механизм действия ферментов Цель занятия: закрепить знания по структуре ферментов, сформировать представления о механизме действия ферментов. Исходный уровень знаний и навыков Студент должен знать:
Студент должен уметь:
Структура занятия
Задачи 1 Аскорбиновая кислота необходима для синтеза и функционирования коллагена и потребляется в реакциях, катализируемых: а) лизил-гидроксилазой; б) лизил-оксидазой; в) пролил-гидроксилазой; г) АСТ? 2 Каталитическое действие ферментов связано: а) с увеличением энергии активации; б) уменьшением энергии активации; в) увеличением свободной энергии реакции; г) уменьшением свободной энергии реакции? 3 Какие ферменты активируются из зимогенов: а) карбоксипептидаза; б) химотрипсин; в) пепсин; г) трипсин; д) ЛДГ; е) АСТ? 4 В катализируемой реакции фермент: а) увеличивает скорость реакции в обоих направлениях; б) смещает равновесие по направлению к продукту реакции; в) снижает энергию активации; г) уменьшает значение свободной энергии; д) изменяет константу Михаэлиса? ^ Лаборатоpная работа № 1. Изучение действия ферментов Действие липазы. Липаза входит в состав сока поджелудочной железы. В желудочном соке она содержится в небольшом количестве и действует только на предварительно эмульгированные жиры. В кишечнике желчные кислоты и белки способствуют эмульгированию липидов. Действие липазы можно обнаружить, добавив ее раствор к молоку, предварительно слабо подщелоченному раствором карбоната натрия в присутствии фенолфталеина, дающего бледно-розовую окраску. ^ П  ринцип метода. Липаза ускоряет гидролиз нейтрального жира на глицерин и жирные кислоты (см. уравнение), что приводит к снижению pH и исчезновению розовой окраски индикатора – фенолфталеина. ^ В две пробирки наливают по 10 капель молока. В 1-ю пробирку добавляют 5 капель панкреатина, содержащего липазу, во 2-ю – 5 капель воды. В обе пробирки наливают по 1 капле 0,5 %-го раствора фенолфталеина и по каплям 1 %-го раствора карбоната натрия до появления бледно-розовой окраски при pH 8,0 (нельзя приливать избыток раствора карбоната натрия). Пробирки помещают в термостат при температуре 38 °С на 30 мин. Наблюдают обесцвечивание раствора в пробирке, содержащей липазу. ^ Действие уреазы. Принцип метода. Уреаза катализирует гидролиз мочевины на двуокись углерода и аммиак (см. уравнение), что приводит к увеличению pH, которое регистрируется индикатором – фенолфталеином.  ^ Берут две пробирки. В 1-ю отмеривают 1мл 1 %-го раствора мочевины, а во 2-ю 1мл 1 %-го раствора тиомочевины. В каждую пробирку добавляют по 2 капли фенолфталеина и по 1 мл раствора уреазы. Содержимое обеих пробирок встряхивают, оставляют на несколько минут при комнатной температуре и наблюдают за появлением розовой окраски в пробирке с мочевиной и отсутствием окраски в пробирке с тиомочевиной. Содержимое 1-й пробирки приобретает розовую окраску вследствие смещения pH раствора в щелочную сторону за счет образования аммиака. ^ Лаборатоpная работа № 2. Изучение влияния различных факторов на скорость ферментативных реакций (УИРС). Скорость ферментативных реакций зависит от многих факторов: концентрации субстрата и фермента, pH среды, наличия активаторов и ингибиторов, коферментов и концентрации ионов в реакционной среде. Фермент -амилаза содержится в слюне и катализирует гидролиз (1-4) гликозидной связи крахмала и гликогена до дисахарида мальтозы. Кроме того, в слюне имеется фермент мальтаза, расщепляющий мальтозу до глюкозы. Гидролиз крахмала под действием -амилазы происходит до стадии образования декстринов. Нерасщепленный крахмал с йодом дает синее окрашивание. Декстрины в зависимости от размера дают с йодом синее окрашивание, амилодекстрины – фиолетовое, эритродекстрины – красно-бурое, ахродекстрины и мальтоза – желтое. Конечные продукты гидролиза крахмала – мальтоза и глюкоза имеют свободные альдегидные группы и могут быть обнаружены реакцией Троммера, в основе которой лежит окислительно-восстановительная реакция. При этом альдегидная группа окисляется до глюконовой кислоты, а медь – в гидрат окиси меди желтого цвета. При дальнейшем нагревании гидрат закиси меди переходит в красную закись меди. Одним из характерных свойств ферментов является термолабильность, т. е. чувствительность фермента к температуре, при которой протекает ферментативная реакция. Для многих ферментов температурный оптимум составляет 38–40 °С. При нагревании выше 70 °C вследствие тепловой денатурации белковой молекулы ферменты утрачивают свои свойства. Степень инактивации зависит от длительности теплового воздействия. При низких температурах ферменты хорошо сохраняются, но скорость ферментативного процесса резко снижается. В термолабильности ферментов можно легко убедиться на примере действия амилазы слюны. О действии фермента судят по исчезновению субстрата или появлению продуктов реакции. Реакция Троммера. ^ Ход работы. К 5 каплям неразведенной слюны прибавляют 3 капли крахмала, 5 капель 10 %-го раствора едкого натра и 3 капли 1 %-го раствора сульфата меди. Дают постоять при комнатной температуре 15 мин. Затем осторожно нагревают до закипания. Появление красного окрашивания указывает на положительную реакцию Троммера. ^ Влияние температуры на активность амилазы. Расщепление крахмала амилазой можно наблюдать, используя реакцию с йодом. ^ Ход работы. 1 Наливают в 4 пробирки по 0,5 мл раствора крахмала. Еще в 4 пробирки наливают по 0,5 мл разбавленной (1 : 10) слюны. 2 Берут первую пару пробирок (одна – с ферментом, другая – с крахмалом) и помещают на баню со льдом. Вторую пару оставляют при комнатной температуре. Третью пару помещают в термостат (40 °C), а четвертую – в кипящую водяную баню. 3 Через 10 мин содержимое каждой пары пробирок сливают вместе, тщательно перемешивают и оставляют стоять еще 10 мин в тех же условиях. 4 Из 3-й пробирки отбирают 3 капли жидкости и проделывают реакцию с каплей йода на стекле. Если появляется синее окрашивание, растворы оставляют стоять еще 10 мин, и после этого повторяют реакцию с йодом на стекле. Затем добавляют 2 капли раствора йода во все пробирки и наблюдают за появлением окрашивания. ^ Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы. Ход работы. 1 В одну пробирку вносят 10 капель дистиллированной воды, а во 2-ю – 8 капель воды и 2 капли 1 %-го раствора хлорида натрия, в 3-ю – 8 капель воды и 2 капли раствора сульфата меди. 2 В каждую пробирку добавляют по 20 капель разведенной слюны (1 : 10), пробирки перемешивают, добавляют по 5 капель раствора крахмала и оставляют стоять при комнатной температуре 5 мин. 3 Тем временем готовят 3 пробирки с водой (по 1 мл), подкрашенной каплей раствора йода, и добавляют в них по 3 капли содержимого опытных проб. Наблюдают окрашивание в зависимости от степени расщепления крахмала амилазой. В 1-й пробирке появляется фиолетовая или красно-бурая окраска, во 2-й пробирке, где ионы хлора играют роль активатора, появляется желтая окраска, а в 3-й, где ионы меди тормозят действие амилазы, – окраска остается синей. Если описанная картина не наблюдается, то опыт повторяют через 10–15 мин. ^ Влияние pH на активность амилазы слюны. Оптимум pH для действия амилазы слюны можно определить при взаимодействии ее с крахмалом при различных значениях pH среды. О степени расщепления крахмала можно судить по реакции крахмала с йодом в течение времени. При оптимальном значении pH расщепление крахмала произойдет полностью (окраска с йодом отсутствует). По мере удаления от точки pH в кислую или щелочную сторону произойдет лишь частичное расщепление крахмала до стадии декстринов (красно-бурая или фиолетовая окраска) или крахмал вообще расщепляться не будет (синяя окраска). ^ 1 В 4 пронумерованные пробирки отмеривают отдельными пипетками по 2 мл фосфатного буфера с различным значением pH (6,0; 6;4, 6,8; 7,4). 2 В каждую пробирку добавляют по 1 мл раствора крахмала и по 0,5 мл разбавленной (1 : 10) слюны, которые помещают в термостат на 10 мин при 38 °С. 3 Из каждой пробирки каплю жидкости смешивают с каплей раствора йода на предметном стекле и сравнивают окрашивание в каждой пробирке. Повторяют эту пробу через 1-2 мин до тех пор, пока проба из 5-й пробирки даст с йодом на стекле красно-бурое окрашивание. Через 1-2 мин после этого во все пробирки добавляют по 2-3 капли раствора йода (начинать с 1-й пробирки). Содержимое пробирок хорошо взбалтывают. Сравнивают между собой окрашивание во всех пробирках и делают вывод о степени расщепления крахмала, а следовательно, об активности фермента при этом значении pH среды. ^ |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям