Методические указания к лабораторным работам и контрольные вопросы и задачи для студентов II курса агротехнического факультета специальности «Зоотехния» Петрозаводск
|
|
Скачать 1.05 Mb.
|
|
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования ПЕТРОЗАВОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, ФИЗИЧЕСКАЯ И КОЛЛОИДНАЯ ХИМИЯ Методические указания к лабораторным работам и контрольные вопросы и задачи для студентов II курса агротехнического факультета специальности «Зоотехния» Петрозаводск Издательство ПетрГУ 2007 Рассмотрены и утверждены к печати на заседании редакционной комиссии по отрасли науки и техники «биология» 11 сентября 2007 г. Печатаются по решению редакционно-издательского совета Петрозаводского государственного университета Составители ^ , канд. биол. наук; В. П. Андреев, доктор хим. наук; Я. П. Нижник, канд. хим. наук ПРЕДИСЛОВИЕ Настоящие методические указания содержат лабораторные работы по биологической, физической и коллоидной химии, выполняемые студентами II курса агротехнического факультета специальности «Зоотехния» в процессе изучения предмета. На лабораторных занятиях студенты овладевают методами экспериментальных исследований, закрепляют теоретические знания, анализируют полученные на практических занятиях результаты. В каждой лабораторной работе излагаются цель и задачи, поставленные перед студентом, принцип используемого метода, ход работы, предлагается проанализировать результаты проведенных исследований и сделать выводы. Представленные в конце каждого раздела вопросы и задачи способствуют лучшему усвоению теоретического материала при самоподготовке. ^ РАЗДЕЛ 1. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В БИОХИМИИ РАБОТА 1. КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ОКРАШЕННЫХ ВЕЩЕСТВ В РАСТВОРАХ. ПРИНЦИП И ТЕХНИКА КОЛОРИМЕТ-РИРОВАНИЯ. УСТРОЙСТВО И ПРАВИЛА РАБОТЫ НА КФК-2 ^ ознакомиться с одним из наиболее распространенных в биохимии методов количественного определения веществ в исследуемом растворе. Задачи:
Фотометрия — метод количественного анализа, основанный на определении концентрации вещества по спектру поглощения, испускания или флуоресценции. В зависимости от характера возникающих изменений выделяется несколько видов фотометрии (колориметрия, нефелометрия, турбидиметрия, флуориметрия, рефрактометрия, поляриметрия и др.). Фотометрические методы анализа характеризуются высокой чувствительностью, достигающей 10-4-10-6 % определяемого элемента в твердых образцах и 10-5-10-7 % – в водных растворах. Колориметрический метод получил самое широкое распространение среди биохимических методов количественного определения веществ в биологических объектах. ^ В основе этого метода лежит закон Бугера- Ламберта Бера, согласно которому существует прямо пропорцио-нальная зависимость между концентрацией вещества в окрашенном растворе и степенью поглощения света данным раствором. Интенсивность поглощения света зависит не только от количества и природы растворенного вещества, но и от толщины слоя раствора, длины волны падающего света, температуры раствора. D = cl, где D оптическая плотность; коэффициент экстинкции (л/моль·см); с молярная концентрация (моль/л); l- толщина слоя раствора (см). Степень поглощения света окрашенным раствором выражается оптической плотностью (экстинкцией), под которой понимают логарифм отношения интенсивности света, падающего на раствор, к интенсивности света, прошедшего через раствор [D = lg(I0/I)]. Величина оптической плотности обозначается буквой Е или D. Чем больше оптическая плотность, тем меньше света пропускает раствор. Для определения оптической плотности или светопропускания используют фотоэлектроколориметры. ^ Колориметр фотоэлектрический концентрационный (КФК-2) предназначен для количественного определения веществ в окрашенных растворах по их оптической плотности или коэффициенту светопропускания в диапазоне волн 315-980 нм. КФК-2 состоит из оптического блока (передняя часть прибора), где находятся осветитель, светофильтр, оптика, кюветное отделение, фотометрическое устройство и регистрирующий прибор, и блока питания (задняя часть), где расположен стабилизатор напряжения с выпрямителем и силовой трансформатор. Источником света в колориметре служит галогенная лампа. Приемниками излучения являются фотоэлемент Ф-26 для работы в диапазоне волн 315-540 нм и фотодиод ФД-24К для работы в специальном диапазоне 590-980 нм. Световой поток лампы с помощью специальных устройств конденсируется, усиливается и проходит через светофильтр, кювету с исследуемым раствором и падает на приемник излучения. При этом световое излучение преобразуется в электрические сигналы, которые подаются на измерительный прибор. Показания микроамперметра пропорциональны световому потоку, проходящему через исследуемый раствор. ^ При проведении фотоэлектроколориметрии следует учитывать, что в данном методе используется монохроматический свет, причем различных длин волн. Для преобразования полихроматического света в монохроматический используются светофильтры. В КФК-2 имеется набор из 11 светофильтров. Использование конкретного светофильтра позволяет пропускать через раствор лучи определенной длины, поглощение которых наиболее характерно для исследуемого вещества. Обычно эффективная длина волны и цвет светофильтра указаны в применяемом методе. Если же такой ссылки нет, то выбрать нужный светофильтр можно с помощью таблицы. Таблица
Примечание. Выбор светофильтра по данной таблице приблизителен, так как некоторые растворы одинакового цвета могут избирательно поглощать лучи с различной длиной волны. Поэтому при подборе светофильтра желательно знать спектр поглощения исследуемого вещества, причем выбор его осуществляют таким образом, чтобы он пропускал лучи с длиной волны, максимально поглощаемой исследуемым раствором. Таким образом, при выборе светофильтра оптимальной длиной волны окажется та, при прохождении которой через исследуемый раствор оптическая плотность будет максимальной. ^ Известно, что чем толще слой жидкости, через который проходит луч света, тем больше будет поглощение светового пучка и тем выше показание оптической плотности исследуемого раствора. К колориметру прилагается набор кювет, отличающихся расстоянием между рабочими гранями, через которые проходит световой поток. Это расстояние (в мм) указано на одной из рабочих граней. На боковой стенке кюветы имеется метка, до которой необходимо наливать жидкость. При работе с летучими растворами кюветы закрывают специальными крышками. К каждому прибору прилагается набор кювет с толщиной слоя исследуемого раствора от 1 до 50 мм. Подбор кювет осуществляется таким образом, чтобы оптическая плотность исследуемого раствора не была ниже величины 0,15 и выше 0,7. Именно в этих пределах наиболее точно выполняется закон Бугера - Ламберта Бера. Следовательно, при интенсивной окраске раствора необходимо взять кюветы с меньшим расстоянием между рабочими гранями, а при слабой окраске – с большим расстоянием. ^  1 рукоятка установки светофильтра (около рукоятки маркировка по длине волны); 2 – ручка перемещения кювет в кюветном отделении; 3 – ручка включения чувствительности фотоприемников (обозначена цифрами 1, 2 и 3 черного цвета при работе в диапазоне волн от 315 до 540 нм и красного цвета - в диапазоне от 590 до 980 нм); 4 – микроамперметр (имеет две шкалы: по верхней измеряют коэффициент светопропускания, а по нижней – оптическую плотность раствора); 5 – ручка «грубой» настройки микроамперметра; 6 – установка «точной» настройки микроамперметра; 7 – крышка кюветного отделения. 5. Правила работы на КФК-2 I. Подготовка прибора к работе
^
Примечание. Если не удается вывести стрелку микроамперметра на 0, то необходимо повысить чувствительность фотоэлемента. Для этого необходимо: а) микроамперметр выключить (рукоятки 5 и 6 до отказа влево); б) рукоятку переключения чувствительности фотоэлемента (3) поставить на цифру 2 соответствующего цвета; в) вывести стрелку микроамперметра на 0 по нижней шкале (то есть повторить действия, указанные в пункте 4). Если и в этом случае стрелка микроамперметра не выводится на 0, необходимо еще раз повысить чувствительность фотоэлемента, повторяя все действия, перечисленные в пунктах «а», «б» и «в», но установив рукоятку 3 на цифру 3 соответствующего цвета. 5. Заменить в световом потоке кювету с контролем на кювету с исследуемым раствором (опытом), поворачивая рукоятку 2 до отказа вправо.
III. Завершение работы на приборе
Примечание. При работе на КФК-2 необходимо соблюдать следующие правила:
^ по оптической плотности Определение концентрации вещества в окрашенном растворе по оптической плотности можно осуществить двумя способами – путем сравнения с оптической плотностью стандартного раствора (такой способ используется, например, в ортотолуидиновом методе определения глюкозы в крови) или, более точно, в результате построения калибровочной кривой. В этом случае готовят ряд растворов определяемого вещества с известными концентрациями (стандартные растворы), проделывают с ними необходимые химические реакции и измеряют на ФЭКе их оптическую плотность. Полученные результаты отражают графически, откладывая по оси абсцисс концентрацию вещества, а по оси ординат – соответствующую ей оптическую плотность. Определив оптическую плотность исследуемого раствора, находят по калибровочной кривой содержание в нем вещества. ^
Выводы: РАЗДЕЛ 2. состав^ 2. 1. АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА БЕЛКОВ Анализ аминокислотного состава белков можно осуществлять несколькими способами. Присутствие тех или иных аминокислот может быть выявлено с помощью цветных реакций на белок, а также в результате кислотного его гидролиза и последующего разделения полученной смеси аминокислот методом хроматографии. ^ Цель работы: ознакомиться с основными наиболее распространенными цветными реакциями на белки и доказать, что с их помощью можно выявить сходство и различия в аминокислотном составе исследуемых белков (яичный альбумин и желатин). Задачи:
Цветные реакции на белки являются качественными реакциями, обусловленными наличием специфических групп. Некоторые из таких реакций широко используются в биохимической практике для изучения структуры и аминокислотного состава белков, их количественного определения. ^ пептидных связей в белках) Принцип метода. Белки (пептиды) в щелочном растворе в присутствии солей меди (II) образуют комплексные ее соединения, окрашенные в сине-фиолетовый или красно-фиолетовый цвет. Для пептидной (амидной) группы характерна лактам-лактимная таутомерия:  В щелочной среде преобладающая лактимная (енольная) форма полипептида взаимодействует с гидроксидом меди(II) с образованием стабильного окрашенного комплекса:  ^ К 1 мл 1%-го раствора белка (желатина, яичного белка или сывороточного альбумина) добавляют 1 мл 10%-го раствора щелочи (NaOH или KOH) и 1 каплю 1%-го раствора сульфата меди. Появляется сине-фиолетовое или красно-фиолетовое окрашивание. ^ находящуюся в -положении) Принцип метода. Белки, полипептиды и свободные -амино-кислоты при нагревании реагируют с нингидрином с образованием продукта конденсации, окрашенного в фиолетовый цвет:  ^ К 1 мл 1%-го раствора белка прибавляют 0,5 мл 0,5%-го раствора нингидрина и нагревают до кипения. Появляется фиолетово-синее окрашивание. Проделывают эту реакцию с раствором аминокислоты, взяв вместо раствора белка 1%-й раствор глицина. Сравнить полученные результаты и сделать вывод. ^ Принцип метода. Белки, содержащие аргинин, в присутствии щелочи дают красное окрашивание с гипобромитом и -нафтолом. Гуанидиновая группа аргинина окисляется гипобромитом, и окисленный аргинин при взаимодействии с -нафтолом образует продукт конденсации красного цвета:  ^ К 0,5 мл 1%-го раствора белка (яичного белка, желатина) добавляют 0,5 мл 10%-го раствора щелочи, 3 капли 0,1%-го спиртового раствора -нафтола и после перемешивания – 2-3 капли 2%-го раствора гипобромита натрия (NaBrO). Появляется красное окрашивание. 4. Реакция Фоля (на цистеин и цистин) ^ При кипячении белка со щелочью от цистеина (цистина) легко отщепляется сера в виде сероводорода, который в щелочной среде образует сульфид натрия:  Для выявления сульфида натрия используют ацетат свинца, который при взаимодействии с избытком гидроксида натрия превращается в тетрагидроксоплюмбат: Pb(CH3COO)2 + 4NaOH Na2[Pb(OH)4]+ 2CH3COONa В результате взаимодействий ионов серы и свинца образуется сульфид свинца черного или бурого цвета: Na2S + Na2[Pb(OH)4] PbS + 4NaOH ^ К 1 мл 1%-го раствора яичного белка или кусочку шерстяной нити добавляют 1 мл 30%-й щелочи и 3-4 капли 5%-го раствора ацетата свинца. При интенсивном кипячении жидкость окрашивается в бурый или черный цвет. Реакцию Фоля проделывают с 1%-м раствором желатина, сравнивают полученные результаты и делают вывод. ^ (на ароматические аминокислоты) Принцип метода. При нагревании с концентрированной азотной кислотой белки дают желтое окрашивание. Реакция обусловлена наличием в белках ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина и триптофана) и основана на образовании нитропроизводных этих аминокислот, имеющих желтую окраску:  Нитропроизводные аминокислот в щелочной среде образуют соли хиноидной структуры, окрашенные в оранжевый цвет:  ^ К 1 мл 1%-го раствора альбумина или яичного белка добавляют 5 капель концентрированной азотной кислоты. Появляется осадок. При осторожном нагревании смесь окрашивается в желтый цвет. После охлаждения осторожно добавляют 10 капель концентрированного раствора аммиака (или 30%-й раствор едкого натра), при этом желтая окраска переходит в оранжевую. Проделывают эту реакцию с 1%-м раствором желатина и 0,1%-м раствором тирозина, сравнивают результаты и делают выводы. 6. Реакция Миллона (на тирозин) ^ Реакция Миллона открывает в белке тирозин, в составе которого имеется фенольный радикал. При нагревании белка с реактивом Миллона (смесь нитратов и нитритов ртути (I) и (II), растворенных в концентрированной азотной кислоте) образуется осадок, окрашенный сначала в розовый, а затем в красный цвет. Реактив Миллона дает окрашивание почти со всеми фенолами:  ^ К 1 мл 1%-го раствора яичного белка добавляют 3-5 капель реактива Миллона и осторожно нагревают до образования окрашенного в красный цвет осадка. Аналогично проделывают реакцию с растворами желатина, тирозина и фенола. Полученные результаты сравнивают и делают вывод. 7. Реакция Адамкевича (на триптофан) ^ Белки, содержащие триптофан, в присутствии глиоксиловой и серной кислот дают красно-фиолетовое окрашивание. Реакция основана на способности триптофана взаимодействовать в кислой среде с альдегидами (глиоксиловой кислотой) с образованием окрашенных продуктов конденсации:  Глиоксилевая кислота всегда присутствует в небольшом количестве в ледяной уксусной кислоте, которую используют в реакции Адамкевича. ^ К 1 мл 1%-го раствора белка добавляют 1 мл ледяной (концентрированной) уксусной кислоты и осторожно нагревают до растворения осадка. После охлаждения к смеси осторожно добавляют 1 мл концентрированной серной кислоты (по каплям, по стенке пробирки, чтобы жидкости не смешались). Через 5-10 минут на границе раздела двух слоев наблюдают образование красно-фиолетового кольца. Проделывают реакцию Адамкевича с 0,1%-м раствором триптофана, сравнивают полученные результаты и делают вывод. 8. Реакция Ваузене (на триптофан) ^ Белки, содержащие триптофан, дают в кислой среде в присутствии нитрита натрия и формальдегида сине-фиолетовое окрашивание. В этой реакции триптофан взаимодействует с формальдегидом с образованием продукта конденсации (бис-2-триптофанил-метана), который окисляется нитритом натрия до бис-2-триптофанил-карбинола, который в присутствии минеральных кислот образует соли сине-фиолетового цвета.  ^ К 2 мл 1%-го раствора яичного белка добавляют 1 каплю 2,5%-го раствора формальдегида. К полученной смеси, тщательно перемешивая, добавляют осторожно, по каплям 6 мл концентрированной серной кислоты, охлаждая пробирку в ванночке со льдом. Через 10 минут добавляют, перемешивая, 10 капель 0,5%-го раствора нитрита натрия. Появляется сине-фиолетовая окраска. 9. Реакция Паули (на гистидин и тирозин) ^ Реакция Паули позволяет обнаружить в белке аминокислоты гистидин и тирозин, которые образуют с диазобензол-сульфоновой кислотой соединения вишнево-красного цвета. Диазобензолсульфоксилота кислота образуется в реакции диазотирования при взаимодействии сульфаниловой кислоты с нитритом натрия (или калия) в кислой среде:   ^ К 1 мл 1%-го раствора сульфаниловой кислоты (готовится на 5%-м растворе соляной кислоты) прибавляют 2 мл 0,5%-го раствора нитрита натрия, тщательно перемешивают, добавляют 2 мл 1%-го раствора яичного белка и после перемешивания 6 мл 10%-го раствора карбоната натрия. После перемешивания смесь окрашивается в вишнево-красный цвет. Проделывают эту реакцию с 0,1%-м раствором гистидина, сравнивают полученные результаты и делают вывод. Общие выводы по работе: ^ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ. ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА простых и сложных белков Цель работы: ознакомиться с основными этапами изучения состава простых и сложных белков (гомогенизация биоматериала, экстракция белков, гидролиз и разделение смеси аминокислот методом распределительной хроматографии, определение составных компонентов простетической группы). Задачи:
^ Выделение белков из биоматериала а) Выделение белков из мышечной ткани Принцип метода. Миофибриллы мышечной клетки содержат сократительные белки (миозин и актин) и регуляторные белки (тропомиозин и тропонин). Белки миофибрилл не растворяются в воде, но их можно экстрагировать из мышечной ткани солевыми растворами с концентрацией соли 0,5 моль/л. Многие белки саркоплазмы (гиалоплазмы мышечных клеток) растворимы в воде или солевых растворах низкой концентрации (0,05 моль/л). При экстракции мышечной ткани 5%-м раствором хлорида калия извлекаются как миофибриллярные, так и саркоплазматические белки. ^ 1. Взвешивают 2 г мышечной ткани. Измельченную ножницами навеску помещают в фарфоровую ступку, добавляют 2 мл 5%-го раствора хлорида калия и растирают со стеклянным песком до гомогенного состояния. К гомогенату добавляют 3 мл раствора хлорида калия и растирают кашицу в течение 5 минут, после чего прибавляют еще 5 мл 5%-го раствора хлорида калия и продолжают растирание в течение 5 минут. 2. Полученный гомогенат фильтруют через два слоя марли или центрифугируют в течение 15 минут при 4000 об/мин. 3. С фильтратом (или центрифугатом) проделывают цветные реакции на белки (биуретовую, ксантопротеиновую, реакцию Миллона, Фоля и Сакагучи). б) Выделение яичного альбумина ^ Яичный белок представляет собой смесь нескольких белков. Примерно 70% яичного белка составляет альбумин, который легко отделяется от глобулинов. При десятикратном разведении яичного белка дистиллированной водой глобулины выпадают в осадок, а альбумин остается в растворе. ^ 1. Чтобы отделить белок от желтка, осторожно проделывают отверстия в скорлупе яйца с двух концов и выливают белок в стакан емкостью 500 мл, затем в стакан добавляют 250 мл дистиллированной воды и содержимое тщательно перемешивают стеклянной палочкой с резиновым наконечником. 2. Раствор переносят в мерный цилиндр и объем доводят дистиллированной водой до 300 мл. Раствор оставляют на 30 минут при комнатной температуре для образования хлопьевидного осадка глобулинов. Примечание: работу, описанную в пунктах 1 и 2, выполняет и демонстрирует дежурный студент, приготовленную суспензию затем использует каждый студент в группе.
^ Кислотный гидролиз белков Принцип метода. В процессе гидролиза белков происходит разрыв пептидных связей и молекула белка распадается сначала на высокомолекулярные полипептиды, затем на более простые пептиды и, наконец, на аминокислоты. Кислотный гидролиз белков проводят в присутствии соляной или серной кислот при кипячении. Гидролиз, проводимый в лабораторных условиях, является важным методом изучения первичной структуры белка. В организме гидролиз постоянно протекает в процессе пищеварения и в тканях под действием протеолитических ферментов. ^ В небольшую колбочку, снабженную обратным холодильником, наливают 2-3 мл 2%-го раствора альбумина и 15-20 мл 25%-го раствора серной кислоты. Содержимое колбы кипятят под тягой в течение 60-90 минут. Через каждые полчаса (с момента закипания) с гидролизатом проделывают биуретовую реакцию, для этого к 0,5 мл гидролизата добавляют 30%-й раствор щелочи до нейтральной реакции по универсальной индикаторной бумаге и 1-2 капли 1%-го раствора сульфата меди. Отрицательная биуретовая реакция указывает на полное расщепление белка до аминокислот. Для сравнения биуретовую реакцию делают с 2%-м раствором альбумина. ^ Третий этап. Разделение смеси аминокислот методом распределительной хроматографии на бумаге Принцип метода. Метод основан на различной растворимости аминокислот в двух частично смешивающихся жидкостях: воде и органическом растворителе. Водная фаза неподвижна, так как вода сорбирована на инертном носителе – целлюлозе, которая в насыщенной влагой атмосфере (хроматографической камере) удерживает до 20-22% воды. Подвижной фазой является насыщенный водой органический растворитель. Чем больше растворимость аминокислот в воде и меньше в органическом растворителе, тем медленнее движется аминокислота на бумаге. Положение аминокислот на бумаге можно определить с помощью нингидриновой реакции: в присутствии нингидрина отдельные аминокислоты выявляются в виде окрашенных пятен. Показателем скорости движения аминокислоты является коэффициент распределения (Rf). Коэффициентом распределения называется отношение расстояния (в миллиметрах) от места нанесения аминокислоты (точка старта) до середины ее пятна (а) к расстоянию от точки старта до фронта растворителя (в): Rf = а/в. Коэффициент распределения является характерной величиной для каждой аминокислоты и постоянен при данных условиях опыта (растворитель, температура, сорт бумаги и др.). Идентификация аминокислот на хроматограммах проводится путем сравнения Rf разделяемых и известных аминокислот (стандартов). Существуют различные способы хроматографического разделения смеси аминокислот на бумаге. ^ Для разделения смеси аминокислот используется растворитель, состоящий из смеси н-бутанола, ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 4:1:5. Приготовленная смесь встряхивается в делительной воронке в течение 5 минут, а затем отстаивается 7-10 часов, после чего нижний слой используется для насыщения хроматографической камеры парами, а верхний – для разделения аминокислот. Хроматографической камерой служит эксикатор. ^
В качестве хроматографической камеры используют высокие стеклянные банки с выступом в верхней части. На выступ в строго горизонтальном положении ставят лодочку – специальный стеклянный сосуд для растворителя. ^
Результаты: Выводы: ^ Определение составных компонентов сложных белков. Качественные реакции на продукты гидролиза нуклеопротеидов дрожжей Нуклеопротеиды – сложные белки, простетической группой которых являются нуклеиновые кислоты. Для качественного анализа химического состава нуклеопротеидов могут быть использованы дрожжи, богатые этими сложными белками. Продукты кислотного гидролиза нуклеопротеидов дрожжей обнаруживают c помощью специфических качественных реакций. ^
а) Биуретовая реакция на полипептиды К 5 каплям гидролизата добавляют 10 капель 10%-го раствора гидроксида натрия и 1 каплю 1%-го раствора сульфата меди. Жидкость окрашивается в розово-фиолетовый цвет. б) Серебряная проба на пуриновые основания К 10 каплям гидролизата добавляют по каплям концентрированный раствор аммиака до щелочной реакции (проверить по индикаторной бумажке, опущенной в пробирку), затем 10 капель 2%-го аммиачного раствора нитрата серебра. При стоянии через 3-5 минут выпадает осадок серебряных соединений пуриновых оснований (аденина и гуанина), окрашенный в светло-коричневый (бурый) цвет. в) Проба Молиша на пентозу К 10 каплям гидролизата добавляют 3 капли 1%-го спиртового раствора тимола, перемешивают и по стенке пробирки осторожно приливают 20-30 капель концентрированной серной кислоты. После перемешивания развивается красное окрашивание, обусловленное продуктом конденсации тимола с фурфуролом, образовавшимся из пентозы. г) Проба Троммера на рибозу и дезоксирибозу К 5 каплям гидролизата добавляют 10 капель 30%-го раствора гидроксида натрия и 1-3 капли 7%-го раствора сульфата меди до появления неисчезающей мути гидроксида меди (II); перемешивают. При нагревании до кипения выпадает желтый осадок гидроксида меди (I) или красный осадок оксида меди (I). д) Качественная реакция на рибозу и дезоксирибозу с дифениламином Дифениламин дает синее окрашивание с дезоксирибозой и зеленое – с рибозой. К 5 каплям гидролизата добавляют 20 капель 1%-го раствора дифениламина и пробирку ставят в кипящую водяную баню на 15 минут. Развивается сине-зеленое окрашивание. е) Качественная реакция на углеводы с -нафтолом К 5 каплям гидролизата добавляют 3 капли 0,2%-го спиртового раствора -нафтола и 20 капель концентрированной серной кислоты. Появляется розово-фиолетовое окрашивание. ж) Молибденовая проба на фосфорную кислоту К 10 каплям гидролизата приливают 20 капель молибденового реактива и кипятят. При этом жидкость окрашивается в лимонно-желтый цвет. Пробирку сразу охлаждают в струе холодной воды. На дне пробирки появляется кристаллический лимонно-желтый осадок фосфорно-молибденовокислого аммония. Общие выводы по работе: ^ Цель работы: изучение важных свойств белков – способности к растворению и реакциям осаждения. Задачи:
1. Растворимость белков Многие белки растворяются в воде, что обусловлено наличием на поверхности белковой молекулы свободных гидрофильных групп. Растворимость белка в воде зависит от структуры белка, реакции среды, присутствия электролитов. В кислой среде лучше растворяются белки, для которых характерны кислотные свойства, а в щелочной – белки, обладающие основными свойствами. Альбумины хорошо растворяются в дистиллированной воде, а глобулины растворимы в воде только в присутствии электролитов. Не растворяются в воде белки опорных тканей (коллаген, кератин, эластин и др.). ^ 1. К 2 каплям неразведенного яичного белка прибавляют 1 мл дистиллированной воды и перемешивают. При этом яичный альбумин растворяется, а яичный глобулин выпадает в виде небольшого осадка. 2. К 2 каплям яичного белка прибавляют 1 мл 5%-го раствора хлорида калия. В слабом солевом растворе растворяются как альбумины, так и глобулины. 3. Проверяют растворимость в воде и 5%-м растворе хлористого калия белка кератина, содержащегося в шерсти и волосах. ^ Реакции осаждения белков могут быть необратимыми и обратимыми. Необратимое осаждение белков (денатурация) Принцип метода. Необратимые реакции осаждения приводят к денатурации белков, при этом разрушается пространственная структура молекулы и белки утрачивают свои естественные биологические и физико-химические свойства. Денатурацию белков можно вызвать физическими воздействиями (кипячение, замораживание, высокое давление, вибрация, радиоактивное излучение и др.) и химическими осадителями.
|
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям