Методические указания к лабораторным работам и контрольные вопросы и задачи для студентов II курса агротехнического факультета специальности «Зоотехния» Петрозаводск
|
|
Скачать 1.05 Mb.
|
|
^
Ход работы. В пробирку осторожно наливают около 1 мл концентрированной азотной кислоты. Затем, наклонив пробирку, медленно, по стенке добавляют 1 мл 1%-го раствора белка. На границе двух жидкостей появляется осадок в виде белого кольца. Такую же реакцию проделывают с концентрированной соляной и серной кислотами. ^ Ход работы. В три пробирки наливают по 1 мл 1%-го раствора белка и добавляют по 3-4 капли: в первую пробирку – 7%-го раствора сульфата меди, во вторую – 5%-го раствора ацетата свинца, в третью – 5%-го раствора нитрата серебра. Во всех пробирках образуется осадок.
Ход работы. В 2 пробирки наливают по 2 мл 1%-го раствора белка и добавляют: в одну пробирку 4-5 капель 10%-го раствора сульфосалициловой кислоты, в другую – 5-10 капель 10%-й трихлоруксусной кислоты (CCl3COOH). Выпадает осадок белка. ^ Ход работы. К 1 мл 1%-го раствора белка добавляют 2 мл органического растворителя (96%-го этанола, хлороформа, ацетона или эфира) и перемешивают. Образование осадка можно усилить добавлением нескольких капель насыщенного раствора хлорида натрия. ^ Ход работы. В три пробирки наливают по 1 мл 1%-го раствора белка, по 4-5 капель 1%-го раствора уксусной кислоты и по 2-3 капли: в первую пробирку – 10%-го раствора пикриновой кислоты, во вторую – насыщенного раствора танина, в третью – 5%-го раствора железистосинеродистого калия. Наблюдают выпадение осадка. 3. Осаждение белков при нагревании^ . В пять пробирок наливают по 0,5 мл 1%-го раствора яичного белка. Содержимое первой пробирки нагревают до появления опалесценции (помутнения раствора). К раствору белка во второй пробирке осторожно добавляют 1 каплю 1%-го раствора уксусной кислоты, нагревают и наблюдают вначале появление опалесценции, а затем выпадение белого хлопье-видного осадка белка. Это объясняется тем, что белок теряет заряд и находится в изоэлектрическом состоянии. К раствору белка в третьей пробирке добавляют 1-2 капли 10%-го раствора уксусной кислоты и нагревают. Осадок не образуется, так как в кислой среде частицы белка перезаряжаются и приобретают положительный заряд. К раствору белка в четвертой пробирке добавляют 1-2 капли 10%-го раствора уксусной кислоты, 1 каплю насыщенного раствора хлорида натрия и нагревают. Выпадает осадок вследствие адсорбции ионов электролита (образование двойного электрического слоя) и нейтрализации заряда на частицах белка. К раствору белка в пятой пробирке добавляют 1 каплю 10%-го раствора гидроксида натрия и нагревают. Осадок не образуется, так как в щелочной среде отрицательный заряд на частицах белка усиливается. Обратимое осаждение белков (высаливание) При добавлении к водным растворам белков сульфатов или хлоридов щелочных и щелочно-земельных металлов (Na2SO4, NaCl, MgSO4 и др.) происходит дегидратация и нейтрализация белковых частиц, при этом белки выпадают в осадок без изменения нативной структуры. Такой тип осаждения белков называется высаливанием. Высаливание – обратимый процесс, и после удаления соли (разбавлением водой, диализом) белок вновь приобретает природные свойства. Поскольку разные белки высаливаются при различных концентрациях солей, этот метод используется для фракционирования белков. Для разделения белков методом высаливания широко применяется сульфат аммония. ^ сульфатом аммония Принцип метода. Фибриноген выпадает в осадок при 33%-м насыщении плазмы сернокислым аммонием, глобулины – при полунасыщении, а альбумины – при полном насыщении. ^
Оставшийся фильтрат № 2 используют для доказательства обратимости процессов высаливания. Для этого в насыщенный раствор фильтрата № 2 добавляют дистиллированную воду до полного растворения осадка. Для сравнения такой же опыт проделывают с пробиркой, в которой белок был осажден трихлоруксусной кислотой (см. выше). Сравнивают результаты и делают выводы. Общие выводы по работе: Вопросы для тестового контроля
^ РАБОТА 5. ОЗНАКОМЛЕНИЕ С ДЕЙСТВИЕМ НЕКОТОРЫХ ФЕРМЕНТОВ Цель работы: ознакомиться с каталитическим действием некоторых ферментов пищеварительного тракта (амилазы слюны, пепсина и липазы) и каталазы крови. Задание:
1. Амилаза слюны Амилаза слюны осуществляет гидролиз крахмала или гликогена. ^ В две пробирки вносят по 5 мл 0,2 %-го раствора крахмала, в одну из них добавляют 0,5 мл слюны. Содержимое перемешивают и пробы помещают в водяную баню (37 оС) на 15 минут. В обе пробирки добавляют по 5 капель раствора Люголя (йода). В пробирке со слюной (амилазой) раствор не дает реакции на полисахарид, а в пробирке без слюны образуется сине-фиолетовое окрашивание. ^ Липаза гидролизует жиры на глицерин и жирные кислоты, количество которых можно определить титрованием щелочью. Ход работы. В две пробирки вносят по 1 мл растительного масла, 4 мл дистиллированной Н2О, 5 мл 1%-го раствора NaHCO3. Содержимое энергично встряхивают до образования эмульсии. Затем в обе пробирки добавляют по 5 капель спиртового раствора фенолфталеина, в одну из пробирок (опыт) – 1 мл липазы, а в другую (контроль) – 1 мл Н2О. Содержимое тщательно перемешивают и ставят в термостат (37 оС) на 15-20 минут. Вследствие образования жирных кислот в ходе реакции и нейтрализации ими щелочной среды раствор в пробе с липазой становится менее окрашенным или обесцвечивается, а в пробе без липазы не изменяется. 3. Пепсин Пепсин, фермент желудочного сока, гидролизует белки до пептидов и аминокислот. ^ В две пробирки вносят несколько миллилитров раствора белка (альбумина) и легким подогревом на спиртовке или электроплитке денатурируют его. Пробы охлаждают до комнатной температуры и в одну из них добавляют раствор пепсина, а в другую – 1 мл Н2О. Обе пробы помещают в термостат (37 оС) на 20 минут, после чего сравнивают результаты. 4. Каталаза Каталаза инактивирует перекись водорода, разлагая ее на воду и молекулярный кислород: 2Н2О2 2Н2О + О2 Этот фермент содержится в эритроцитах, в клетках печени и других тканей. ^ В две пробирки вносят по 2 мл свежеприготовленного 5%-го раствора перекиси водорода, в одну из проб добавляют 1 каплю крови и перемешивают. В пробе с кровью (каталазой) вследствие выделения кислорода наблюдается интенсивное образование пузырьков. ^ РАБОТА 6. ЗАВИСИМОСТЬ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ ОТ ТЕМПЕРАТУРЫ И рН СРЕДЫ Цель работы: на примере амилазы слюны ознакомиться с некоторыми специфическими свойствами ферментов. Задание:
Каждый фермент имеет свой оптимум рН, температуры и наибольшее сродство к какому-то субстрату. В этих условиях активность фермента максимальна. ^ Ход работы. В три пробирки вносят по 1 мл слюны, одну из них помещают в лед, другую – в термостат с температурой 37 оС, содержимое третьей кипятят 5 минут, охлаждают струей воды и тоже помещают в термостат. Через 5 минут после этого во все пробы добавляют 5 мл 0,2%-го раствора крахмала, перемешивают и помещают в прежние условия. Через 20 минут во все пробы добавляют по 5 капель раствора Люголя. Сравните окраску раствора всех проб и объясните различия. ^ Ход работы. В две пробирки вносят по 1 мл слюны. В одну из них добавляют 5 мл 0,2%-го раствора крахмала, в другую – 5 мл 0,5%-го раствора сахарозы. Пробы помещают на 20 минут в термостат (37 оС), после чего добавляют в них по 1 мл 10%-го раствора NaOH и по 0,5 мл 5%-го раствора сернокислой меди и содержимое доводят до кипения. В пробирке с крахмалом под влиянием амилазы образуется мальтоза, способная восстановить окись меди до закиси (красного цвета), – положительная проба Троммера. На сахарозу амилаза не действует, и в этой пробе окись меди не восстанавливается. 3. Определение оптимума рН активности амилазы ^ Перед началом работы готовят раствор амилазы. Для этого смешивают 1 мл 1%-го раствора крахмала и 0,5 мл слюны, разбавленной в 10 раз. Через каждые 2 минуты отбирают на предметное стекло по 1 капле этой смеси и добавляют к ней 1 каплю раствора Люголя. Крахмал должен полностью расщепиться за 10 минут (желтая окраска пробы с йодом). Если расщепление крахмала происходит быстрее, слюну надо развести еще в 2-4 раза; если медленнее – уменьшить начальное разведение. В восемь пронумерованных пробирок наливают по 2 мл фосфатного буфера соответственно с рН: 5,4; 5,8; 6,2; 6,6; 6,8; 7,0; 7,4; 8,0. Во все пробирки добавляют по 5 мл 0,2%-го раствора крахмала (приготовленного на 0,1%-м растворе NаС1) и по 1 мл разбавленной слюны. Содержимое каждой пробирки тщательно перемешивают стеклянной палочкой, после чего пробирки помещают в термостат при 37 оС. Через каждые 3 минуты 1 каплю жидкости, взятой из пятой пробирки, смешивают на предметном стекле с 1 каплей раствора Люголя. Вначале при смешивании образуется синее окрашивание, затем фиолетовое, фиолетово-красное. Как только проба из пятой пробирки даст с йодом на предметном стекле красно-бурое окрашивание, все пробирки извлекают из термостата, охлаждают под струей холодной воды и добавляют по 2 капли раствора Люголя. Содержимое пробирок хорошо перемешивают и сравнивают окрашивание. Общие выводы по работе: ^ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ПО МЕТОДУ КИНГА Цель работы: ознакомиться с одним из методов определения активности аминотрансфераз, широко используемых в медицинской и сельскохозяйственной практике для выявления заболеваний и прогнозирования хозяйственно полезных признаков у животных. Задание:
Определение активности аминотрансфераз (трансаминаз) крови имеет большое диагностическое значение. Например, при инфаркте миокарда в крови увеличена активность аспартатаминотрансферазы, при инфекционном гепатите возрастает активность аланинамино-трансферазы. ^ Метод Кинга основан на способности аланин- и аспартаттрансаминаз конденсировать 2,4-динитрофенилгидразин и продукты дезаминирования аминокислот – пировиноградную и щавелевоуксусную кислоты:  ^ В одну пробирку вносят 0,2 мл сыворотки крови (опытная проба), в другую – 0,2 мл дистиллированной воды (контрольная проба); в обе пробирки добавляют по 0,5 мл 2%-го раствора аспарагиновой кислоты и по 0,5 мл 0,6%-го раствора -кетоглутаровой кислоты. Пробы перемешивают и помещают на 60 минут в термостат (37 оС), после чего каталитическое действие фермента останавливают добавлением в обе пробы по 1 мл 0,1%-го раствора 2,4-динитрофенилгидразина и вновь помещают в термостат на 15 минут. Затем добавляют по 10 мл 0,4 н раствора NaOH и оставляют на 1-2 минуты до появления окраски. Пробы колориметрируют на ФЭКе с зеленым светофильтром в кюветах с толщиной слоя 10 мм. Активность аминотрансфераз выражают в условных единицах, умножая оптическую плотность на 100. У здоровых людей активность аминотрансфераз в сыворотке крови составляет 10-35 единиц. Результаты: Общие выводы по работе: Вопросы для тестового контроля
^ РАБОТА 8. КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА НЕКОТОРЫЕ ВИТАМИНЫ Цель работы: ознакомиться со свойствами и особенностями структуры некоторых витаминов. Задачи:
1. Диазореакция на тиамин (В1) Принцип метода. Раствор тиамина при добавлении к нему диазобензолсульфокислоты и щелочи окрашивается в оранжевый или красный цвет, вследствие образования соединения тиамина с диазобензолсульфокислотой.  ^ К 5 каплям 1%-го раствора сульфаниловой кислоты прибавляют 5 капель 5%-го раствора азотистокислого натрия, образуется диазобензолсульфокислота. К диазобензолсульфокислоте прибавляют немного порошка тиамина (или раствора), 5-7 капель 10%-го раствора карбоната натрия (соды). Жидкость окрашивается в оранжевый или красный цвет. Если раствор соды осторожно приливать по стенке наклоненной пробирки, то на границе двух жидкостей образуется красное кольцо. ^ Принцип метода. При действии железосинеродистого калия тиамин окисляется с образованием желтого пигмента тиохрома. ^ К 1 капле раствора тиамина прибавляют 5-10 капель 10%-го раствора едкого натра и 1-2 капли 5%-го раствора железосинеродистого калия и перемешивают. При нагревании жидкость окрашивается в желтый цвет в результате превращения тиамина в тиохром.  ^ Ход работы. В пробирку наливают 10 капель взвеси рибофлавина в воде, добавляют 5 капель концентрированной соляной кислоты и опускают кусочек металлического цинка. Начинается бурное выделение пузырьков водорода и жидкость постепенно окрашивается в розовый или красный цвет, затем окраска жидкости начинает бледнеть и обесцвечиваться.  ^ Принцип метода. При нагревании никотиновой кислоты с уксуснокислой медью образуется осадок медной соли никотиновой кислоты.  ^ 5-10 мг никотиновой кислоты растворяют при нагревании в 10-20 каплях 10%-го раствора уксусной кислоты. К нагретому до кипения раствору добавляют равный объем 5%-го раствора уксуснокислой меди. Жидкость становится мутной, окрашивается в голубой цвет, а при стоянии выпадает осадок синего цвета. ^ а) Восстановление феррицианида калия витамином С Ход работы. В двух пробирках смешивают 1 каплю 5%-го раствора К3Fe(CN)6 c 1 каплей 1%-го раствора FeCl3. В одну из пробирок к зеленовато-бурой жидкости прибавляют 5-10 капель 1%-го раствора аскорбиновой кислоты, а в другую – столько же дистиллированной воды. Жидкость в первой пробирке приобретает зеленовато-синюю окраску, выпадает синий осадок берлинской лазури; во второй пробирке (контроль) зеленовато-бурая окраска жидкости остается без изменения. 1. аскорбиновая + 2К3Fе(СN)6 + 2КОН дегидро- + 2К4Fе(СN)6 + 2Н2О кислота феррицианид аскорбиновая ферроцианид калия кислота калия 2. 3К4Fе(СN)6 + 4FеС13 Fе4Fе(СN)63 + 12КСl ферроцианид берлинская калия лазурь б) Реакция с 2,6-дихлорфенолиндофенолом (краской Тильманса) ^ В пробирку с 2,6-дихлорфенолиндофенолом вносят 0,5 мл 0,1%-го раствора HСl и по каплям 0,1%-го раствора аскорбиновой кислоты. Наблюдается обесцвечивание 2,6-дихлорфенолиндофенола. ^ серной кислотой Принцип метода. При добавлении концентрированной серной кислоты к хлороформенной эмульсии рыбьего жира образуется красное окрашивание, переходящее в красно-бурое. ^ В сухую пробирку вносят 1 каплю рыбьего жира и 5 капель хлороформа, перемешивают и добавляют 1 каплю концентрированной серной кислоты. ^ Принцип метода. При нагревании рыбьего жира, содержащего витамин D со смесью анилина и концентрированной HCl, раствор приобретает красную окраску. ^ В сухую пробирку вносят 1 каплю рыбьего жира, 5 капель хлороформа, встряхивают и добавляют 1 каплю анилинового реактива, при нагревании желтая эмульсия принимает красную окраску. Общие выводы по работе: ^ Цель работы: ознакомиться с одним из методов количественного определения витамина в пищевых продуктах и биологических жидкостях. Задачи:
Принцип метода. Метод основан на способности витамина С восстанавливать 2,6-дихлорфенолиндофенол:  2,6-дихлорфенолиндофенол в щелочной среде имеет синюю окраску, в кислой среде – красную, в восстановленном состоянии – бесцветную:  ^ в плодах шиповника Ход работы а) Гомогенизация биоматериала и экстракция витамина С 1 г сухих плодов измельчают в фарфоровой ступке с 2 мл дистиллированной воды, смесь количественно переносят в мерную колбу на 25 мл и доводят объем водой до метки. Через 10 минут смесь фильтруют через бумажный фильтр в мерную пробирку. б) Количественное определение витамина C в экстракте К 2 мл полученного фильтрата добавляют 2-3 капли 10%-го раствора соляной кислоты и 2 мл дистиллированной воды. Содержимое переливают в колбочку на 50 мл и титруют 0,001 н раствором 2,6-дихлорфенол- индофенола до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 30 секунд. Расчет. Содержание витамина C рассчитывают по формуле: Х = (0,088. А. 25 . 100) / Б. В = (мг%), где Х – содержание аскорбиновой кислоты в мг%; А – количество раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола (в мл), пошедшее на титрование; В – количество сухого вещества в г, взятое для анализа; Б – количество вытяжки в мл, взятое для титрования; 25 – общее количество вытяжки в мл; 0,088 – количество аскорбиновой кислоты в мг, эквивалентное 1 мл 0,001 н раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола. ^ и других пищевых продуктах а) Гомогенизация биоматериала и экстракция витамина С Этот этап работы выполняют так же, как в предыдущем случае (при определении содержания аскорбиновой кислоты в шиповнике). б) Количественное определение витамина C в экстракте 10 мл фильтрата* приливают в колбочку на 50 мл, подкисляют 2-3 каплями 10%-го раствора соляной кислоты и титруют так же, как в предыдущем случае. *Примечание: если исходный цвет фильтрата сильно окрашен (например, у моркови или петрушки), берут 2 мл фильтрата и 8 мл дистиллированной воды, но это учитывают при расчетах. Расчет делают по той же формуле, что и при определении витамина C в шиповнике, только количество вытяжки (Б), взятое для титрования, будет равно 10 мл. ^ Ход работы. В коническую колбу вносят 10 мл мочи и 10 мл дистиллированной воды. Добавляют 1 мл концентрированной уксусной кислоты и титруют 0,001 н раствором 2,6-дихлорфенолиндо-фенола до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 30 секунд. Расчет: Х = (0,088 . А . 100) / 10 = (мг%), где А – количество 0,001 н раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола в мл, пошедшее на титрование; 10 – количество мочи в мл, взятое на титрование; 100 – коэффициент для выражения результата в мг%; 0,088 – эквивалент аскорбиновой кислоты. Общие выводы по работе: Вопросы для тестового контроля
(витамина Вс), клиническое проявление гиповитаминоза этого витамина.
^
РАБОТА 10. ОРТОТОЛУИДИНОВЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ В КРОВИ Цель работы: ознакомиться с одним из распространенных методов количественного определения в крови основного показателя углеводного обмена глюкозы. Задачи:
^ Глюкоза при нагревании с ортотолуидином в растворе уксусной кислоты дает сине-зеленое окрашивание, интенсивность которого прямо пропорциональна концентрации глюкозы и определяется на фотоэлектроколориметре:  С ортотолуидиновым реактивом реагируют все альдогексозы, но их содержание в крови невелико, поэтому метод позволяет определить практически одну глюкозу. ^ а) Осаждение белков крови. В две центрифужные пробирки наливают по 0,9 мл 3%-го раствора трихлоруксусной кислоты, затем в одну из них вносят 0,1 мл крови (или сыворотки крови), а в другую – 0,1 мл стандартного раствора глюкозы (концентрация глюкозы в стандартном растворе составляет 100 мг%). Содержимое пробирок перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. б) ^ . В обычные сухие пробирки вносят по 0,5 мл надосадочной жидкости из каждой центрифужной пробирки, добавляют по 4,5 мл ортотолуидинового реактива и помещают в кипящую водяную баню (100 оС) на 8 минут. (Время инкубации проб и температурный режим необходимо соблюдать точно, кроме того, обязательным условием для нормального протекания данной реакции является непрерывное кипение воды в бане!). По истечении времени пробирки вынимают и охлаждают в водопроводной воде до комнатной температуры. в) Измерение оптической плотности растворов. Оптическую плотность проб измеряют на фотоэлектроколориметре в кюветах на 10 мм против воды с красным светофильтром (620 нм) Расчет. Содержание глюкозы в опытной пробе рассчитывают по стандартному раствору глюкозы по формуле: С оп = (С ст. р-ра глюкозы Е оп) / Е ст. р-ра глюкозы , где Cоп – концентрация глюкозы в крови в пробе, ммоль/л, C ст. р-ра глюкозы. – концентрация глюкозы в стандартной пробе, 100 мг%, Е оп. – оптическая плотность исследуемой пробы, Е ст. р-ра глюкозы – оптическая плотность стандартного раствора глюкозы. Примечание. Для перевода показателя в единицы СИ (ммоль/л) полученный результат при расчете необходимо умножить на 0,0555. Нормальное содержание глюкозы в сыворотке крови человека, определенное этим методом, колеблется в пределах 3,33-5,55 ммоль/л (или 60-90 мг%). ^ Работа 11. Глюкозооксидазный метод определения глюкозы в биологических жидкостях Цель работы: ознакомиться с современным энзиматическим методом количественного определения глюкозы в биологических жидкостях, который широко применяется в клинической практике Задачи:
^ Глюкозооксидаза катализирует окисление глюкозы кислородом воздуха с образованием эквимолярного количества пероксида водорода. Под действием пероксидазы перекись водорода окисляет фенол, который превращается в бензохинон, окрашенный в розовый цвет. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации глюкозы в пробе.  Из набора реагентов OLVEX DIAGNOSTICUM готовят перед анализом: ^ 1. Стандартный раствор глюкозы – 10 ммоль/л 2. Рабочий реагент содержащий: а) фосфат-фенольный буфер (рН 7,5), б) глюкозооксидазу (25 000 U/л), в) пероксидазу (1500 U/л). ^ В три обычные химические пробирки наливают: 1) в опытную – 0,01 мл сыворотки крови или свежей мочи, 2) в стандартную – 0,01 мл стандартного раствора глюкозы, 3) в контрольную – 0,01 мл дист. Н2О. Затем во все пробирки добавляют по 2 мл рабочего реагента, смесь тщательно перемешивают и пробы помещают в термостат на 10 минут при 37 оС. После окончания инкубации измеряют оптическую плотность опытной и стандартной пробы против контроля в кюветах на 5 мм (или 3 мм) при длине волны 490-510 нм. Окраска стабильна в течение часа после окончания инкубации при условии отсутствия воздействия прямых солнечных лучей. Примечание Количество глюкозы в моче определяют только при положительной качественной реакции на глюкозу. Реакция считается положительной, если смесь из 0,01 мл исследуемой мочи и 0,5 мл рабочего реагента через 15 минут приобретает розовую окраску. Расчет Расчет концентрации глюкозы проводят по формуле: С = Е0/ Ест. 10, где Е0 – оптическая плотность опыта, Ест. – оптическая плотностьстандарта, 10 – концентрация стандартного раствора глюкозы в моль/л. Нормальное содержание глюкозы, определенное этим методом в сыворотке или плазме крови здорового человека составляет 4,2-6,1 ммоль/л, в моче – 0,8 ммоль/л. Результаты: Общие выводы по работе: Вопросы для тестового контроля
больных сахарным диабетом? Задачи 1. Какой общий метаболит образуется из аминокислот, глюкозы и жирных кислот? 2. Какой из перечисленных ферментов катализирует реакцию биосинтеза гликогена: а) -1,6-глюкозидаза, б) гликогенфосфорилаза, в) гликоген-синтетаза, г) фосфоглюкомутаза? 3. Сколько молекул восстановительных эквивалентов образуется в ЦТК?
а) цитрата в цис-аконитат; б) сукцинил-КоА в сукцинат; в) фумарата в малат; г) оксалоацетата в сукцинат; д) цис-аконитата в изоцитрат? 5. На каких этапах превращения цикла Кребса происходят реакции дегидрирования: а) цитрата в цис-аконитат; б) цитрата в изоцитрат; в) окислительное декарбоксилирование -кетоглутарата; г) малата в оксалоацетат; д) сукцината в фумарат; е) фумарата в малат; ж) изоцитрата в -кетоглутарат? 6. Напишите уравнения реакций пентозофосфатного цикла, связанные с образованием НАДФН+Н+. Какие ферменты катализируют эти реакции? 7. Почему гиповитаминоз В1 приводит к накоплению концентрации пирувата в крови и органах? 8. Какие изменения в обмене углеводов возникают в результате полного голодания: а) в течение 1-2 суток; б) при более длительном периоде (до 7 суток). 9. Почему при анемии организм хуже переносит физические нагрузки? 10. Почему при гипоксии повышено содержание пирувата в крови? 11. Почему при недостаточной обеспеченности организма витаминами В1, В2 и В5 повышено содержание лактата и пирувата в крови и органах? 12. Почему для повышения качества мяса перед транспортировкой животных к месту забоя рекомендуют применять транквилизаторы (мебикар и др.)? 13. Укажите, какие изменения в метаболизме углеводов возникают при приеме алкоголя натощак: а) уменьшается отношение НАД+/НАДH+Н+? б) увеличивается концентрация лактата и уменьшается концентрация пирувата в печени и крови? в) уменьшается скорость глюконеогенеза в печени? г) ускоряется синтез гликогена в печени?
РАБОТА 12. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХОЛЕСТЕРИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ МЕТОДОМ ИЛЬКА Цель работы: ознакомиться с одним из распространенных методов количественного определения холестерина в сыворотке крови. Задачи:
В норме количество холестерина в сыворотке крови составляет в среднем 165 мг%. Обмен холестерина нарушается при ряде заболеваний, особенно при атеросклерозе. Содержание его в крови увеличивается при гипертонии, сахарном диабете, заболевании почек (липоидном нефрите). ^ Метод основан на реакции Либермана - Бурхада. При действии концентрированной серной кислоты происходит дегидратация холестерина, конденсация образовавшихся продуктов в виде непредельных углеводородов, соединяющихся с серной кислотой с образованием окрашенных продуктов. ^ 1. Построение калибровочной кривой В 5 пробирок вносят реактивы в количестве, указанном в таблице:
Содержимое пробирок осторожно перемешивают, закрывают пробками и оставляют в темноте на 20 минут. Затем растворы колориметрируют на ФЭКе против реактива Илька в кюветах на 5 мм с красным светофильтром. Полученные значения экстинкции (Е) используют для построения калибровочной кривой, откладывая по оси абсцисс количество холестерина в мг%, по оси ординат – оптическую плотность раствора. Внимание! При выполнении методики необходимо быть особенно внимательными и осторожными, так как стандартный раствор холестерина приготовлен на концентрированной уксусной кислоте, а в состав реактива Илька входят концентрированная уксусная, концентрированная серная кислоты и уксусный ангидрид (в соотношении 1:1:5). Реактивы набирать только пипеткой с резиновой трубкой и стеклянным наконечником или автоматической пипеткой, не разливать, избегать попадания их на кожу, слизистые и одежду. Во время выполнения анализа пробирки обязательно закрывать пробками, а кюветы – крышками. ^ 2. Определение содержания холестерина в сыворотке крови В пробирку вносят 2 мл реактива Илька и 0,1 мл сыворотки крови. Содержимое перемешивают, закрывают пробкой и ставят в темное место на 20 минут, после чего колориметрируют, как при построении калибровочной кривой. Определяют концентрацию холестерина в сыворотке крови по полученной калибровочной кривой. Результаты: Общие выводы по работе: работа 13. определение концентрации общего холестерина в сыворотке и плазме крови энзиматическим методом ^ ознакомиться с одним из самых распространенных в клинической биохимии методов определения холестерина. Задачи:
^ При гидролизе эфиров холестеридов холестерин-эстеразой образуется холестерин. Общий холестерин (свободный и этерифицированный) окисляется кислородом воздуха под действием холестериноксидазы с образованием эквимолярного количества пероксида водорода:  В присутствии пероксидазы перекись водорода окисляет фенол, который превращается в бензохинон, имеющий розовый цвет. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации холестерина. Реактивы Из набора реагентов серии Olvex Diagnosticum готовят перед анализом:
а) фосфатный буфер (100 ммоль/л), б) фенол (20 ммоль/л), в) холестеринэстеразу (400 U/л), г) холестериноксидазу (250 U/л), д) пероксидазу (500 U/л) ^ В три обычные химические пробирки наливают: 1) в опытную – 0,02 мл сыворотки (или плазмы) крови, 2) в стандартную – 0,02 мл стандартного раствора холестерина, Во все пробирки добавляют по 2 мл рабочего реагента, реакционную смесь тщательно перемешивают и пробы помещают в термостат на 5 минут при 37 оС. Затем измеряют оптическую плотность опытной и стандартной проб против контроля в кюветах с рабочей длиной 5 мм (или 3 мм) при длине волны 490-500 нм. Окраска проб стабильна в течение 2 часов при условии отсутствия воздействия прямых солнечных лучей. Расчет Расчет количества общего холестерина проводят по формуле: С = Ео/Ест. 5,17 [ммоль/л] или С = Ео/Ест. 200 [мг/100мл], где Ео – экстинция опытной пробы, Ест – экстинция стандарта. Содержание холестерина в сыворотке крови здоровых людей разного возраста колеблется в пределах: 20-29 лет – 3,72- 7,11 ммоль/л (144-175 мг/дл), 30-39 лет – 4,27-7,63 ммоль/л (165-295 мг/дл), 40-49 лет – 4,40- 8,15 ммоль/л (170-315 мг/дл), старше 50 лет – 4,58-8,79 ммоль/л (177-340 мг/дл). Результаты: Общие выводы по работе: ^ Цель работы: ознакомиться с некоторыми реакциями выявления кетоновых тел в биологических жидкостях. Задачи:
^ Ацетон и ацетоуксусная кислота образуют с нитропруссидом натрия в щелочной среде комплексное соединение розово-фиолетовой окраски. Интенсивность окраски зависит от количества кетоновых тел в реакции. ^ Ход работы. На кафель или стекло наносят 0,1-0,2 г порошка нитропруссида натрия, прибавляют 2-3 капли сыворотки крови и выдерживают 5 минут. Появление розово-фиолетовой окраски указывает на положительный результат. Минимальный уровень кетоновых тел в крови, дающий положительную реакцию, равен 10 мг/100 мл (10 мг%). Скорость развития окраски и ее интенсивность пропорциональны концентрации кетоновых тел в исследуемой пробе: если фиолетовое окрашивание возникает немедленно – содержание 50-80 мг% и более; если оно появляется через 1 минуту – в пробе содержится 30-50 мг%; развитие слабой окраски через 3 минуты свидетельствует о присутствии 10-30 мг% кетоновых тел. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям