Пособие предназначено для врачей клинической лабораторной диагностики и врачей других специальностей. Рецензенты: Доктор медицинских наук, профессор Ю. В. Котловский Доктор биологических наук, профессор И. М. Устьянцева
|
|
Скачать 1.94 Mb.
|
^
Праймеры.Праймеры – искусственно синтезированные короткие, длиной 20–30 оснований, одноцепочечные ДНК (дезоксиолигонуклеотиды), комплементарные 3’-концам цепей искомой ДНК-матрицы. В геноме искомого организма выбирается консервативная (редко подвергающаяся генетическим перестройкам), строго специфическая нуклеотидная последовательность. К ней синтезируются специфические праймеры. Таким образом, фрагмент молекулы, который будет фланкировать (ограничивать) праймер, должен присутствовать только у интересующего вида микроорганизмов или в исследуемом гене человека и отсутствовать в ДНК других возбудителей болезней или других генах человека. Правильно подобранные праймеры играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации и обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы. Полимераза.Термостабильная ДНК-полимераза – фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов. Для определения РНК-содержащих вирусов используется фермент обратная транскриптаза, который по РНК-матрице синтезирует ДНК-копию, которая затем участвует в ПЦР. Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты.Строительный материал для синтеза комплементарных цепей. (дАТФ, дТТФ, дЦТФ, дГТФ)
В стандартной ПЦР используются солевые буферы на основе 10–70 мМ Трис-HCl при рН 8–9 (20oC). В буфер добавляются активаторы ПЦР – соли хлорида калия или сульфат аммония и стабилизаторы ДНК-полимераза – бычий сывороточный альбумин или желатин, а также неионные детергенты Triton X100, Nonidet NP40 и Tween 20.
Подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, который может содержать искомую ДНК. Например, ДНК микроорганизмов, служащая мишенью для последующего многократного копирования. При отсутствии ДНК-мишени специфический продукт амплификации не образуется.
Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов (Рис. 1).  Рис. 1. Этапы ПЦР-анализа.
В ПЦР эти процессы осуществляются в пробирке в циклическом режиме. Переход от одного этапа реакции к другому достигается изменением температуры инкубационной смеси. При нагревании раствора до 93–95оС происходит денатурация ДНК. Для перехода к следующему этапу – присоединению или “отжигу” праймеров – инкубационную смесь охлаждают до 50–65оС. Далее смесь нагревают до 70–72оС – оптимум работы Тaq-ДНК-полимеразы. На этом этапе происходит достраивание новой нити ДНК. Далее цикл повторяется снова. Многократное, или циклическое, повторение этой процедуры позволяет наработать значительное количество копий участка ДНК (ампликона).
ПЦР-диагностике состоит из трех основных процедур: подготовки исследуемой пробы материала, которая сводится к выделению ДНК или РНК, проведению ПЦР (амплификации) и детекции продукта ПЦР. Для РНК-содержащих вирусов дополнительно проводят реакцию обратной транскрипции (получение кДНК, являющейся комплементарной вирусной РНК-матрице).
До начала работы необходимо подготовить пробы для выделения из них ДНК. Для этого сыворотку и плазму крови, мочу, синовиальную и спинномозговую жидкости, мазки и соскобы (доставленные в транспортной среде) концентрируют, мокроту разжижают, биопсийный и аутопсийный материалы аккуратно измельчают. Процедура подготовки образца (ДНК, РНК) включает очистку образца от форменных элементов, лизис микроба, экстракцию (извлечение) ДНК из биопрепарата и удаление или нейтрализацию посторонних примесей, способных оказать ингибирующее действие на процесс реакции амплификации. Высочайшая чувствительность ПЦР обычно достигается при работе с чистой культурой микроба или с очищенной нуклеиновой кислотой. Эта чувствительность автоматически не трансформируется в чувствительность метода при работе с клиническим материалом. Комплект реагентов для выделения НК должен обеспечивать эффективность экстракции ДНК/РНК (не менее чем 80–95 %) и высокую эффективность амплификации ДНК (в 100000 — 1000000 раз). Существует два подхода при обработке проб: сложный и простой (Табл. 2). Сложный – используют с «грязными» пробами: с гемолизом и/или слизью, дебрисом и т.д. Метод направлен на выделение из образца чистых нуклеиновых кислот за счет их избирательной сорбции. Такая очистка ДНК достигается на специальных микроколонках или с помощью сорбентов, приготовленных на основе силикагеля. Выделение ДНК с помощью сорбентного метода является наиболее оптимизированной и технологичной процедурой пробоподготовки и позволяет увеличить чувствительность метода, что влечет за собой увеличение числа выявления возбудителей инфекций, присутствующих в биологических пробах в минимальных количествах. Простой – используют при работе с «чистыми» пробами, т.е. без гемолиза, слизи, дебриса и т.д. Метод подготовки проб состоит в простом лизисе исследуемого материала в сочетании с температурной обработкой. При его использовании формируется определенный процент ложноотрицательных результатов, что объясняется неполной экстракцией ДНК и присутствием ингибиторов реакции в пробе. Существуют следующие подходы очистки нуклеиновых кислот.
Таблица 2 Основные отличия методов выделения ДНК ПростыеСложныеВысокие требования к забору материалаУпрощенные требования к забору клинического материалаБыстрое исполнениеБолее трудоемкоеНизкая эффективность выделения ДНКВысокая эффективность выделения ДНК/РНКНизкая эффективность очистки от ингибиторовВысокая эффективность удаления ингибиторов Возможность автоматизации
Для подготовки пробы к постановке ПЦР используют различные методики в зависимости от поставленных задач. Выбор конкретной методики особенно важен при анализе клеточного осадка мочи или гнойного отделяемого, так как эти образцы содержат большое количество субстанций, способных ингибировать ход реакции полимеризации ДНК-мишени. Стандартным и ставшим уже классическим считается сорбентный метод получения чистого препарата ДНК/РНК. Сорбентный метод выделения ДНК/РНК в различных модификациях является наиболее предпочтительным для ПЦР-диагностики. Его преимуществом является возможность длительного хранения проб в замороженном состоянии, поскольку ДНК сорбируется на носителе и оттаивание проб не оказывает особого влияния на ДНК/РНК. Метод удобен, технологичен, является наиболее оптимизированной процедурой пробоподготовки, при которой достигается хорошая очистка ДНК. Этот метод позволяет увеличить диагностическую чувствительность и количество выявлений возбудителей инфекций, присутствующих в биологических пробах в минимальных количествах. На этапе экстракции ДНК/РНК важно обеспечить получение максимального количества высокоочищенной нуклеиновой кислоты. Показателями эффективности экстракции являются минимальные потери ДНК/РНК в процессе экстракции, максимальное удаления ингибиторов и нейтрализации нуклеаз, низкий риск перекрестной контаминации «от образца к образцу». Для оценки эффективности экстракции комплект реагентов для выделения НК должен содержать внутренний контрольный образец (ВКО), который вносится в пробу на этапе экстракции ДНК/РНК и обеспечивает контроль качества проведения всех этапов анализа. АмплификацияАмплификация в молекулярной биологии – увеличение числа копий ДНК. В клетке амплификация происходит в результате репликации ДНК. В искусственных условиях увеличения числа копий ДНК добиваются с помощью полимеразной цепной реакции (Рис. 2). Две получившиеся ДНК-цепи служат матрицей для следующего цикла, поэтому количество матричной ДНК в ходе каждого цикла удваивается. В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. Таким образом, происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2n, где n – число циклов амплификации. Если в исходном растворе первоначально находилась только одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 30–40 циклов в растворе накапливается около 108 молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле после соответствующего окрашивания. Двунитевые фрагменты ДНК, равные по длине расстоянию между двумя праймерами, начинают накапливаться после третьего цикла. В ходе первого цикла ПЦР цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента нуклеиновой кислоты генома вируса, бактерий или человека. В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза все новых и новых цепей. Таким образом, происходит накопление ампликонов в реакционном растворе в геометрической прогрессии. ПЦР дает экспоненциальное увеличение специфического участка ДНК возбудителя.  Рис. 2. Схематическое изображение первого цикла ПЦР. (1) Денатурация при 94–96°C. (2) Отжиг при 68°C . (3) Элонгация при 72 °C (P-полимераза). (4) Закончен первый цикл.
Одним из перспективных направлений в модификации амплификационного этапа является разработка систем, реализующих "твердофазную" амплификацию. В таких системах один из олигонуклеотидных праймеров ковалентно иммобилизован на специально модифицированном слое пластика пробирки. Получаемые в ходе ПЦР ампликоны также остаются иммобилизованными на твердой фазе, что исключает риск контаминаций и упрощает последующую процедуру их детекции. В последнее время большое внимание ученых обращено на дизайн амплификационных смесей, благодаря чему стало возможно применение мультипраймерной ПЦР, что увеличивает производительность и дает возможность выявления большего количества патогенных микроорганизмов или иных определяемых признаков и в перспективе будет иметь большое значение при использовании в современных устройствах регистрации ДНК-биочипах.
Для оптимизации ПЦР, для повышения эффективности прохождения реакций, уменьшения риска образования неспецифических продуктов реакции амплификации используют подход, получивший название «горячий старт» (“Hot-start”). Суть его состоит в предотвращении возможности начала реакции до момента достижения в пробирке условий, обеспечивающих специфический отжиг праймеров. Специфичность получаемого продукта ПЦР в значительной степени определяется температурой отжига праймеров, при которой они взаимодействуют с комплементарными участками ДНК-матрицы, образуя двухцепочечные структуры. Температура отжига определяется длиной праймера и содержанием GC-пар и рассчитывается по следующей формуле: Tm =[(A+T) x 2] + [(G + C) х 4]. В зависимости от GC -состава и размера праймеры имеют определенную температуру плавления (Tm), при которой образование водородных связей нестабильно. Если температура системы превышает Тm, праймер не в состоянии удерживаться на цепи ДНК и денатурирует. При соблюдении оптимальных условий, т.е. температуры отжига, близкой к температуре плавления, праймер образует двухцепочечную молекулу только при условии его полной комплементарности и, таким образом, обеспечивает специфичность реакции.
ПЦР проводят в амплификаторе – приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, с точностью не менее 0,1 °C, который имеет совершенные характеристики переходных температурных процессов, увеличенный ресурс работы и обеспечивает значительное сокращение времени протекания реакции. Современные амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе, с возможностью «горячего старта» и последующего хранения амплифицированных молекул при 4°C. Характерной чертой современных амплификаторов является возможность поддержки пробирочного, планшетного и других форматов амплификации в одном приборе Амплификация проводится по заданной программе, соответствующей виду определяемой инфекции и занимает от 2 до 3 часов. Приборы оснащены программами, контролирующими аналитический процесс, поэтому количество лабораторных ошибок во время анализа минимально, а средства контроля качества наиболее развиты и реально применяются в практике ПЦР-лабораторий.
Амплифицированный фрагмент ДНК выявляют методом электрофореза в агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Бромистый этидий образует с фрагментами ДНК устойчивый комплекс: он внедряется в «стопку» остатков азотистых оснований ДНК, составляющую сердцевину двойной спирали. В результате они оказываются в гидрофобном окружении, в котором бромистый этидий начинает флуоресцировать. В водной среде он этим свойством не обладает. Поэтому ДНК выявляется в виде светящихся полос при облучении геля УФ светом с длиной волны 290–330 нм. В зависимости от размера образующихся в результате ПЦР-ампликонов используют гель с содержанием агарозы от 1,5% до 2,5%. Для приготовления агарозного геля расплавляют в СВЧ-печи или на водяной бане смесь агарозы, буфера и воды, добавляют раствор бромистого этидия. Охлажденную до 50–60оС смесь заливают в форму слоем толщиной 4–6 мм и с помощью специальных гребенок делают в геле карманы для нанесения образца. Гребенки устанавливают таким образом, чтобы между дном лунок и основанием геля оставался слой агарозы 0,5–1 мм. После застывания геля в карманы наносится амплификат в количестве 5–10 мкл. Рекомендуется параллельно с контрольными и опытными пробами проводить электрофорез смеси маркеров длин фрагментов ДНК. Обычно такая смесь содержит десять фрагментов ДНК длинной 100, 200, 300 и т.д. пар оснований. Постановка такой пробы позволяет верифицировать длину ампликонов в контрольных и опытных пробах. Гель с нанесенным образцом переносят в камеру для электрофореза (Рис. 3), заполненную буфером. Камеру подключают к источнику питания и проводят электрофоретическое разделение продуктов амплификации в течение 30–45 мин при напряженности электрического поля 10–15 В/см. При этом фронт красителя, входящего в состав реакционной смеси должен пройти не менее 3 см.  Рис.3. Камера для электрофоретических разделений ПЦР-продуктов в агарозном геле. Результаты оцениваются по наличию специфических фрагментов ДНК в агарозном геле. Специфичность синтезированного фрагмента ДНК подтверждается по его положению (размерам) относительно положительного ДНК-контроля, полосы которых устанавливаются на том же уровне в геле, что и полосы в образцах с положительным контрольным препаратом ДНК, видимых в агарозном геле в присутствии бромида этидия при УФ облучении. После окончания электрофореза гель переносят на стекло трансиллюминатора и просматривают в ультрафиолетовом свете (Рис. 4) и документируют. В электрофоретической дорожке, соответствующей положительному контролю, должна присутствовать оранжевая светящаяся полоса. Ее электрофоретическая подвижность должна соответствовать длине ампликона, указанной в инструкции. В электрофоретической дорожке, соответствующей отрицательному контролю, такая полоса должна отсутствовать. Наличие специфического сигнала в отрицательном контроле свидетельствует о контаминации – загрязнении используемых реагентов исследуемой ДНК или ампликоном. В последнее время особенно много внимания уделяется модификации и модернизации методов регистрации результатов ПЦР. В целом можно выделить следующие принципиальные направления.
 Рис. 4. Свечение продуктов ПЦР-реакции в ультрафиолетовом свете.
В основе технологии ПЦР в реальном времени лежит принцип флюоресцентной детекции продуктов ПЦР во время амплификации. Такая технология дает возможность осуществлять регистрацию непосредственно в реакционной пробирке, что исключает попадание продуктов реакции в окружающую среду и контаминацию лаборатории. Детектор амплификаторов может одновременно фиксировать свет от шести флюорофоров в 96 лунках и разделять сигналы от разных красителей. Это позволяет вести наблюдение за шестью амплификациями одновременно в каждой лунке одного планшета.  Рис. 5. График регистрации результатов ПЦР в режиме реального времени (Quantitative real-time PCR). |
отлично
1
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям