Пособие предназначено для врачей клинической лабораторной диагностики и врачей других специальностей. Рецензенты: Доктор медицинских наук, профессор Ю. В. Котловский Доктор биологических наук, профессор И. М. Устьянцева
|
|
Скачать 1.94 Mb.
|
|
^
В процессе ПЦР-исследования, как любого лабораторного исследования, можно выделить три этапа: преаналитический, аналитический и постаналитический.
Надежность результатов исследования обеспечивается качеством его проведения на каждом из этапов: назначение исследования —> получение материала —> проведение исследования —> отчет о результатах исследования. В настоящее время ПЦР-диагностика быстро развивается, что связано с внедрением новых технологий и обновлением приборного парка. Приборы оснащены программами, контролирующими аналитический процесс, благодаря этому количество лабораторных ошибок непосредственно во время анализа минимально. Кроме того, существует достаточно возможностей для внутри - и межлабораторного контроля качества, которые реально используются в практике ПЦР – лабораторий. При этом преаналитический этап в наименьшей мере находится под контролем лаборатории, т.к. значительная его часть проводится сотрудниками других подразделений ЛПУ. Так, причиной ошибочного диагноза, несмотря на безупречно проведенную процедуру анализа, могут быть: неправильная подготовка больного, нарушения процедуры взятия биологического материала у пациента, упущения при доставке материала в лабораторию, халатность или недостаточные знания при хранении и обработке проб.
Зарубежная практика показывает, что важнейшим условием успешного лабораторного обследования пациентов и снижения количества лабораторных ошибок является стандартизация деятельности лаборатории и, прежде всего, процедур преаналитического этапа. Стандартизация предполагает разработку инструкций по операциям, использование которых на всех этапах ПЦР-анализа позволяет свести к минимуму вероятность возникновения ошибок. Разработка инструкций на преаналитическом этапе должна включать следующие разделы работы.
Существуют два вида ошибок на преаналитическом этапе при проведении ПЦР-анализа, которые ведут к неправильной постановке диагноза: ложноположительные и ложноотрицательные. Ложноположительные результаты на преаналитическом этапе (положительный результат при отсутствии возбудителя в пробе) возникают в случаях:
Ложноотрицательные результаты на преаналитическом этапе (отрицательный результат при наличии возбудителя в пробе) возникают в случаях:
Использование лабораторной информационной системы (ЛИС) позволяет существенно уменьшить процент ошибок. Целесообразно автоматизировать процесс обработки направлений. Это можно сделать, формализовав направления и используя сканер для ввода информации в ЛИС. Немаловажную роль играет форма бланка-заявки на исследование, которая должна упрощать работу клиницистов, медсестер и лабораторных регистраторов. При регистрации в лаборатории правильно заполненная форма заявки считывается специальным сканером, и перечень назначенных врачом анализов автоматически переносится в лабораторную информационную систему, формируя заявку на исследования. На рис. 9 представлена форма бланка ИОККДЦ, где для анализов методом ПЦР предусмотрены ячейки для заполнения (направляемый тип биологического материала).
Аналитический этап – первый этап, который осуществляется непосредственно в лаборатории. Для качественного выполнения анализов необходимо современное передовое оборудование, квалифицированные специалисты, набор реагентов, имеющих высокую диагностическую чувствительность и диагностическую специфичность. Для контролирования качества выполняемых исследований проводится внутрилабораторный и внешний контроль качества, контроль оценки качества в ФСВОК – Федеральной Системе Внешней Оценке Качества (Россия) и EQAS (США) - Международной системе оценки качества. Применение метода ПЦР требует строгого соблюдения правил в организации работы и проведении всех этапов анализа. Исследования материала от больного методом ПЦР проводят в учреждениях, имеющих разрешение на работу с патогенными биологическими агентами (ПБА) III–IV групп патогенности. Исследования разделяются на три этапа и проводятся в трех изолированных помещениях (зонах) согласно «Методическим рекомендациям по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции».  Рис. 9. Формализованный бланк направления, включающий анализы методом ПЦР. Проведение ПЦР-диагностики инфекций связано с проблемой, обусловленной высокой чувствительностью метода, возможностью контаминации. Попадание в реакционную пробирку следовых количеств ампликонов из пробирок, в которых успешно прошла амплификация, либо специфическая ДНК из образцов на этапе пробоподготовки, приводит к появлению ложноположительных результатов.
Программы контроля качества, действующие в лабораториях, не обеспечивают 100%-ной гарантии от ошибок, в них содержатся тщательно разработанные требования по квалификации персонала, текущему обслуживанию и контролю состояния оборудования, а также другим стандартным операциям. Помимо внутреннего, за лабораториями налажен внешний контроль со стороны федеральных и региональных органов контроля, а также профессиональных сертифицирующих организаций. Основные мероприятия, предусмотренные на каждом из этих трех этапов работы, представлены в таблицах ниже. Иногда, если результаты исследования не соответствуют другим данным, а состояние пациента нетяжелое и не требует экстренной помощи, врач может применить выжидательную тактику. В других случаях врач может повторить некоторые лабораторные исследования, чтобы убедиться в их соответствии исходному результату, либо в том, что результаты самостоятельно нормализовались. Подтверждение информации – путем повторения исследований, контрольных исследований через некоторое время, получения второго или даже третьего мнения – особенно важно в случаях, когда предполагается тяжелое заболевание или планируется применение сложного метода лечения. Так, ставки очень высоки при подозрении на рак, СПИД, порок развития плода. Если предполагается проведение крупной операции, применение токсичного метода лечения, либо терапия может оказаться очень тяжелой или приводящей к необратимым осложнениям, в интересах пациента провести проверку результатов обследования, даже в случаях, когда время терять нельзя. Как и в других случаях, врач должен тщательно взвесить также данные непосредственного обследования и анамнеза, чтобы понять, поддерживают ли они предполагаемый диагноз или противоречат ему. Обязательным условием для успешного применения методов молекулярной биологии является понимание возможных ошибок на всех этапах анализа, их устранение или сведение к минимуму. Для этого при проведении ПЦР-исследований наряду с внутрилабораторным контролем качества проводится и внешняя оценка качества (Рис. 10), например, в Федеральной системе внешней оценки качества (ФСВОК, Россия). Контроль качества исследований:
Отсутствие внутреннего контроля при рутинном клиническом ПЦР-исследовании, приводит к увеличению ложноотрицательных результатов – в случае присутствия ингибиторов реакции.
Параллельно с опытными пробами ставятся контрольные образцы положительного и отрицательного контроля. Положительный контроль – включает в себя все компоненты реакции, но вместо материала клинического образца вносится контрольный препарат ДНК исследуемого возбудителя. Положительный контрольный образец, используемый в каждой постановке ПЦР должен соответствовать следующим требованиям:
Отрицательный контроль – включает в себя все компоненты реакции, но вместо клинического материала или препарата ДНК вносится соответствующее количество деионизованной воды или экстракта, не содержащего исследуемой ДНК. Отрицательный контроль необходим для проверки компонентов реакции на отсутствие в них ДНК или клеток возбудителя вследствие контаминации, а также позволяет исключить учет ложноположительных результатов.  Рис. 10. Бланк ФСВОК с результатом оценки выявления вирусов гепатита С методом ПЦР.
ВКО – это искусственно сконструированный препарат ДНК или РНК, имеющий те же сайты узнавания праймерами, что и ДНК или РНК микроорганизма, но размер амплифицированного ВКО превышает размер специфического ампликона. ВКО не должен конкурентно ингибировать в ПЦР при минимальных количествах ДНК микроорганизма. Использование ВКО на этапе обработки клинического материала позволяет проверить качество проведения важных элементов ПЦР анализа:
Строгое соблюдение правил работы в ПЦР лаборатории позволяет обеспечить достаточную надежность лабораторных данных, что имеет огромное значение для оказания высококачественной медицинской помощи.
Контаминация – попадание из внешней среды в реакционную смесь специфических и неспецифических молекул ДНК, способных служить мишенями в реакции амплификации и давать ложноположительные или ложноотрицательные результаты. При проведении ПЦР-анализа возможны две причины возникновения контаминации:
Для любой лабораторной методики основной проблемой является профилактика ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Существуют два вида ошибок на аналитическом этапе при проведении ПЦР-анализа: ложноположительные и ложноотрицательные. Ложноположительные результаты на лабораторном этапе могут возникать при Контаминации (загрязнении) как в отдельных пробах, так и во всех пробах (тотальная контаминация). Это наиболее трудно выявляемый вид ошибок. Основной причиной ложноположительных результатов является так называемая перекрестная контаминация продуктами амплификации. В ходе постановки реакции амплификации происходит избирательное размножение участка ДНК (ампликона) искомого возбудителя. Количество ампликона в пробе при завершении реакции может достигать миллиардов копий. При неосторожном обращении с пробами после реакции амплификации, даже просто при открывании пробирки трудно избежать аэрозольного выброса макроколичеств реакционной смеси в атмосферу рабочего помещения. При этом может происходить контаминация воздуха, рабочей поверхности, перчаток, пипеток и т.д. Учитывая тот факт, что чувствительность реакции составляет единичные молекулы ДНК, а при аэрозольном выбросе возможно попадание в атмосферу сотен тысяч молекул, то очень высока вероятность попадания ампликона в исследуемые пробы. В этом случае получается положительный результат не вследствие наличия в пробе искомого инфекционного агента, а в результате размножения ампликона. Ложноотрицательные результаты на лабораторном этапе возникают в случаях: Потери ДНК во время неправильной транспортировки, при несоблюдении технологии выделения ДНК, при использовании некачественных реактивов. Добавление ВКО в пробу до выделения ДНК позволяет решить эту проблему. Ускоренные методы выделение ДНК также увеличивает вероятность потери ДНК/РНК, особенно заметные при работе с небольшими количествами ДНК в образце. Одной из основных причин такого рода результатов является наличие в исследуемой пробе ингибиторов реакции. Чаще всего с такими результатами приходится сталкиваться при анализе клеточного осадка мочи или гнойного отделяемого, т.к. эти образцы содержат большое количество субстанций, способных ингибировать ход реакции полимеризации ДНК-мишени. Проверить наличие ингибиторов в исследуемой пробе можно путем добавления аликвоты пробы в образец с контрольной ДНК-мишенью, имеющейся в каждом наборе (ВКО). Если в результате проведенного эксперимента не получается ожидаемый фрагмент ДНК, значит исследуемый образец содержит ингибирующие компоненты. В этом случае необходимо еще раз тщательно отмыть образец, убедиться в высоком качестве реагентов, используемых для выделения ДНК и повторить реакцию амплификации. Другая причина ложноотрицательных результатов это низкая активность фермента Taq-полимеразы и деградация дезоксинуклеотидтрифосфатов или олигонуклеотидных праймеров, обусловленная неправильным хранением или частым замораживанием и оттаиванием реагентов. Существует несколько способов борьбы с контаминацией:
Все результаты, выходящие за пределы референсных значений, просматриваются врачом-лаборантом или врачом-аналитиком. Результаты, вызывающие подозрение или не укладывающиеся в какую-либо клиническую картину, просматриваются и в случае необходимости принимаются решения о перестановке анализа или выдаче результата с сопроводительной записью. С точки зрения получения ложноотрицательного или ложноположительного результата особенно опасны ошибки, контроль которых невозможно осуществить во время проведения ПЦР-анализа (Табл. 6). Это, прежде всего ошибки, связанные с нарушением правил забора, хранения и транспортировки проб. Поскольку эти процедуры могут осуществляться вне ПЦР-лаборатории, большое внимание следует уделять обучению медицинского персонала, выполняющего забор проб, т.к. именно от него во многом зависит качество ПЦР-анализов. Как показывает практика, при соблюдении правил работы и выполнении требований инструкций во время постановки ПЦР вероятность ошибок невысока. Таблица 6. Ошибки, встречающиеся при проведении ПЦР-диагностики Характер ошибкиПричина ошибкиСледствие ошибкиВозможность лабораторного контроля ошибкиСпособы предотвращения ошибкиКонтаминация пробы на стадии забора материалаИспользование при заборе пробы инструментария, пробирок, перчаток и др. материалов, загрязненных “положительной” ДНКЛожноположительный результатНевозможенИспользование разового инструментария и материалов; повышение образовательного уровня медицинского персоналаЗагрязнение пробы примесями, ингибирующими ПЦРПроба содержит примеси ингибиторов ПЦР. Сильными ингибиторами являются гемоглобин, гепаринЛожноотрицательный результатОсуществляется при использовании тест-систем с внутренним контролемИспользование разового инструментария и материалов; соблюдение правил забора материалаЗабор материала выполнен неадекватно, в пробе отсутствуют клеточные структуры.Несоблюдение правил забора материала (вместо соскоба клеток собрана поверхностная слизь)Ложноотрицательный результатВ некоторых случаях возможен при визуальном контролеСоблюдение правил забора материала; использование специальных одноразовых щеточек-зондовРазрушение ДНК при транспортировке и хранении пробыНесоблюдение правил транспортировки и хранения пробЛожноотрицательный результатНевозможенСоблюдение правил транспортировки и хранения пробПотери ДНК во время пробоподготовкиНесоблюдение инструкции выделения ДНК; использование некачественных реактивовЛожноотрицательный результатВозможен при проведении положительного образца через все стадии пробоподготовкиСоблюдение инструкции выделения ДНК; использование качественных реактивовКонтаминация в отдельных пробахНарушение правил работы в ПЦР-лаборатории; использование одного наконечника при обработке разных проб; при внесении реагентов наконечник касается стенок пробирки; загрязнение дозатораЛожноположительный результатВозможен при постановке параллельных пробСоблюдение правил работы в ПЦР-лаборатории; инструкции выделения ДНК и постановки ПЦР; использование наконечников с фильтрамиТотальная контаминацияЗагрязнение реагентов, дозаторов “положительной” ДНКЛожноположительный результатОсуществляется при постановке отрицательного контроляТо жеВторую группу составляют ошибки, связанные с неверной диагностической стратегией врача, использующего ПЦР-диагностику. Следует обратить внимание на случаи несовпадения результатов ПЦР-анализа с результатами других исследований, например, с результатами определения антител к возбудителю методом иммуноферментного анализа. Рассмотрим случай, когда ПЦР-анализ на хламидии дает отрицательный результат, а ИФА выявляет противохламидийные антитела. Причиной подобного расхождения может быть:
Возможна и обратная ситуация, когда при положительном результате ПЦР-анализа не выявляются специфические антитела. Это возможно при хронических инфекциях, которые зачастую сопровождаются иммунодепрессией. Так, при хроническом хламидиозе до 5% больных имеют титр противохламидийных антител, не превышающий критического уровня. При первичной инфекции следует также учитывать серонегативный период, когда, несмотря на клинические проявления заболевания антител еще нет. Для урогенитальных инфекций этот период может составлять до двух недель. Мировые руководства и стандарты не рекомендуют постановку диагноза «хламидиоз» по наличию антител IgA, IgM, IgG. Также не рекомендовано использовать определение антител для установления излеченности хламидиоза. Для диагностики хламидиоза, трихомониаза, микоплазмоза многолетним клиническим опытом разработаны и опробованы «классические» лабораторные методы – микробиологические (исследование мазка и посев на питательные среды), иммунологические (индикация методом ПИФ). Но под воздействием лечения морфологические и антигенные свойства возбудителей урогенитальных инфекций изменяются, и в этих случаях ПЦР-метод остается практически единственным, способным оценить результаты проведенной терапии урогенитальных инфекций. Взаимодействие лабораторной службы и врачебного персонала, является необходимым условием эффективной диагностики. Назначение тех или иных диагностических исследований целиком и полностью зависит от лечащих врачей. Стремительное развитие диагностической медицины приводит к тому, что клиницисты не могут в полной мере оценить возможности современных технологий. Часто недостаточная осведомленность или невозможность назначить нужное исследование, неправильный забор пробы приводят к тому, что уже на первом этапе допускаются ошибки, снижающие результативность использования дорогих и высокоинформативных технологий. В первую очередь необходимо отметить комплексность современной лабораторной диагностики. Сегодня вряд ли можно говорить о том, что какой-то из методов, применяемый изолированно, способен дать объективные и достоверные результаты. На начальном этапе принятия решения о подборе необходимого комплекса диагностических мер требуется ставить вопрос о разумном сочетании различных – как новейших, так и хорошо зарекомендовавших себя традиционных – методов исследования с целью верификации присутствия инфекционного агента у пациента. Исключительную важность имеет также доказательность участия инфекционного агента именно в том патологическом процессе, который наблюдают клиницисты. Проблема заключается в том, что многие инфекционные агенты, с которыми приходится сталкиваться в ежедневной практике, относятся к так называемой латентной, или оппортунистической группе. Выявление таких агентов, не всегда является свидетельством их участия в патологическом процессе. Иногда инфекционный агент может быть обнаружен, однако его участие в воспалительном процессе оказывается минимальным либо вообще отсутствует, поскольку в данном случае он является сапрофитной флорой. Это касается многих как вирусных, так и бактериальных инфекций. Для того чтобы назначать этиологическое, а не синдромальное лечение, необходимо проводить мультифакторное исследование, стремясь точно определить роль того или иного патогенна в конкретной клинической картине. Использование ПЦР уже на поликлиническом этапе позволяет оперативно выявить больных пациентов и сразу после получения положительного результата анализа, в течение одних–двух суток с момента обращения, назначить антибактериальную терапию. |
отлично
1
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям