Директива совета от 28 января 1991 г по условиям здоровья животных, регулирующих торговлю овцами и козами внутри Сообщества
|
|
Скачать 8.5 Mb.
|
БРУЦЕЛЛЁЗ^ 1. Стандартная агглютинирующая сыворотка должна соответствовать стандартной сыворотке, изготовленной в Veterinary Laboratory Agence, Addlestone, Weybridge, England. Одна ампула должна содержать 1 000 МЕ агглютинации, полученных методом лиофилизации одного мл бычьей сыворотки. 2. Стандартная сыворотка поставляется учреждениям Bundesgesundheitsamt, Berlin. 3. Степень аггиютинации бруцеллы в сыворотке должна быть выражена в МЕ/мл (т.е. сыворотка Х = 80 МЕ/мл). 4. Показания при проведении замедленной агглютинации сыворотки в пробирках должны быть сняты при завершении агглютинации на 50 или 75 процентов, причём используемый антиген должен быть титрован в идентичных условиях по стандартной сыворотке. 5. Значение агглютинации различных антигенов относительно стандартной сыворотки должно находится в стедующих пределах: - если показания снимаются при 50 %: от 1/600 до 1/1 000, - если показания снимаются при 75 %: от 1/500 до 1/750. 6. Для приготовления антигена, используемого при агглютинации в пробирках (замедленный метод), необходимо использовать штамм Weybridge № 99 и USDA 1119 либо любой другой штамм соответствующий чувствительности. 7. Питательные среды, используемые для содержания штаммов бактерий в лабораторных условиях и при производстве антигена, не должны способствовать бактериальному разложению (S – R); предпочтительным является использование картофельного агара. 8. Бактериальная эмульсия должна быть приготовлена на физиологическом растворе поваренной соли (NaCl 0,85 ‰, фенолизированный при 0,5 %). Не допускается использование формалина.
9. Официальные учреждения, перечисленные ниже, несут ответственность за проведение официальных испытаний антигенов: (а) Германия: Bundesgesundheitsamt, Berlin; (б) Бельгия: Institut national de recherches vétérinaires, Brussels; (в) Франция: Laboratoire central de recherches vétérinaires, Alrort; (г) Великое Княжество Люксембург: institute of the supplying country; (д) Италия: Instituto superiore di sanitá, г. Рим; (е) Нидерланды: Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid (ID-DLO), Lelystadt; (ж) Дания: Statens Veretinaere Serumlaboratorium, Copenhagen V; (з) Ирландия: Veterinaty Resеarch Laboratory, Department of Agriculture and Food, Dublin; (и) Объединённое Королевство: - Великобритания: Veterinary Laboratory Agency, Addlestone, Weybridge, - Северная Ирландия: Veterinaty Resеarch Laboratory, Stormont, Belafast; (к) Греция: Κέντρο Κτηνιατριχών Ιδρυμάτων Νεαπόλεως 25, 153 10 Αθήνα; (л) Испания: Centro Nacional de Brucellosis; Laboratorio de Sanidad y Producción Animal de Santa Fé (Granada); (м) Португалия: Laboratorio Nacionalo de Investigação Veterinária, Lisbon; (н) Австрия: Bundesanstalt für Tierseuchenbekämpfung, Mödling; (o) Финляндия: Eläinlääkintä – ja elintarvikelaitos, Helsinki-anstalten för veterinärmedicin och livsmedel, Helsingsfors; (п) Швеция: Statens veterinärmedicinska anstalt, Uppsala. 10. Антигены могут перевозиться в концентрированном виде при условии, что на ярлыке бытылки будет указан коэффициент разведения. 11. Для проведения пробы на агглютинацию сыворотки необходимо приготовить три раствора для каждого образца сыворотки. Растворы сомнительной сыворотки должны быть приготовлены таким образом, чтобы показания при реакции на пределе инфекции были сняты со средней пробирки. В случае положительной реакции в этой пробирке, сомнительная сыворотка содержит не менее 30 МЕ агглютинации на мл.
Б. Проба на реакцию сгущения комплемента. 1. Используется стандартная сыворотка, как указано в пункте А. 1 настоящего Приложения. В дополнение к агглютинации в международных единицах, один миллилитр такой лиофилизированной бычьей сыворотки должен содержать 1 000 единиц активизации для сгущения комплемента. Такие единицы активизации называются единицами активизации ЕЕС. 2. Стандартная сыворотка поставляется институтом Bundesgesundheitsamt, Berlin. 3. Уровень антител в сыворотке, связывающих комплемент, должен быть выражен в единицах активизации ЕЕС (например: сыворотка Х = 60 единиц активизации ЕЕС на мл). 4. Сыворотка, содержащая 20 и более единиц активизации ЕЕС (т.е. активность эквивалентна 20 % активности стандартной сыворотки) на мл, считается положительной. 5. Сыворотки должны инактивироваться следующим образом: (а) бычья сыворотка: 56 –60 °С в течение 30 – 50 минут; (б) свиная сыворотка: 60 °С в течение 30 – 50 минут. 6. Для приготовления антигена необходимо использовать штамм Weybridge № 99 или USDA 1119. Антиген представляет собой бактериальную суспензию на физиологической сыворотке при 0,85 % либо на насыщеном растворе веронала. 7. Для проведения пробы необходима доза комплемента больше минимальной дозы, используемой для проведения общего гемолиза. 8. При проведении пробы на реакцию сгущения комплемента каждый раз необходимо осущетвлять контроль за следующими аспектами: (а) противокомплементное действие сыворотки; (б) антиген; (в) активированные красные кровяные тельца; (г) комплемент; (д) использование положительной чувствительности сыворотки в начале реакции; (е) специфика реакции с использовании отрицательной сыворотки.
9. Надзор и официальный контроль за производством стандартных сывороток и антигенов возлагается на учреждения, перечисленные в пункте А. 9 настоящего Приложения. 10. Антигены могут перевозиться в концентрированном виде при условии, что на ярлыке бутылки будет указан коэффициент растворения. В. Кольцевой анализ 1. Данному анализу подвергается содержимое каждой маслобойки либо содержимое каждой цистерны, поступающих из хозяйств. 2. Используемый стандартный антиген должен быть получен из одного из учреждений, перечисленных в пунтке А. 9 (а) – (и). Рекомендуется использовать антигены, стандартизированные в соответствии с рекомендациями ВОЗ/ФАО. 3. Антиген может быть окрашен исключительно гематоксилином либо тетразолиумом; предпочтительно использование гематоксилина. 4. В случае, если не используется консервация, анализ на реакцию должен быть проведён между 18 и 24 часами после забора образца от коровы. В случае, если планируется провести анализ спустя более 24 часов после забора образца, необходимо прибегнуть к консервации; в качестве консервантов возможно использовать формалин либо двухлористую ртуть (в случае использования любого из этих консервантов анализ должен быть проведён в течение 14 дней со дня забора образца). Формалин добавляется в такой пропорции, чтобы его окончательная концентрация в образце молока составила 0,2 %; в таких случаях соотношение молока и раствора формалина должно быть не менее 10 : 1. Вместо формалина может быть использована двухлористая ртуть, с окончательной концентрацией в образце молока 0,2 % в таких случаях соотношение молока и раствора двухлористой ртути должно быть не менее 10 : 1. 5. Анализ выполняется по одному из следующих методов: - на столбике молока высотой не менее 25 мм, а так же на объёме молока в 1 мл, к которому добавлено 0,03 мл одного из стандартизированных окрашенных антигенов, - на столбике молока высотой не менее 25 мм, а так же на объёме молока в 1 мл, к которому добавлено 0,05 мл одного из стандартизированных окрашенных антигенов, - на объёме молока в 8 мл, к которому добавлено 0,08 мл одного из стандартизированных окрашенных антигенов,
- на столбике молока высотой не менее 25 мм, а так же на объёме молока в 2 мл, к которому добавлено 0,05 мл одного из стандартизированных окрашенных антигенов. 6. Смесь молока и антигенов необходимо инкубировать при температуре 37 °С в течение не менее 45 минут и не более 60 минут. Анализ должен быть выполнен в течение 15 минут после забора образца из инкубатора. 7. Реакция должна быть оценена исходя из следующих критериев: (а) отрицательная реакция: окрашенное молоко, неокрашенные сливки; (б) положительная реакция: идентично окрашенные молоко и сливки, либо неокрашенное молоко и окрашенные сливки. ^ Буферизированный анализ на антиген бруцеллы может быть выполнен по одному из следующих методов: (а) вручную 1. стандартной сывороткой является антибруцелловая сыворотка выкидыша второго международного стандарта, поставляемая Veterinary Laboratory Agencу, Addlestone, Weybridge, England. 2. Антигенг должен быть приготовлен без учёта клеточной концентрации, но его чувствительность должна быть стандартизирована по отношению к антибруцелловой сыворотке выкидыша второго международного стандарта таким образом, чтобы антиген давал положительную реакцию в растворе с сывороткой при концентрации 1 : 47,5 и отрицательную реакцию при концентрации 1 : 55. 3. Антиген должен быть распущен в буферном растворе антигена бруцеллы с уровнем pH 3,65 ±0,5 (антиген может быть окрашен с использованием красителя бенгальская роза). 4. Для приготовления антигена необходимо использовать штамм Weybridge № 99 либо USDA 1119 или другой штамм с эквивалентной чувствительностью. 5. Питательные среды, используемые для содержания штамма в лабораторных условиях, а так же при производстве антигена, должны быть такого качества, чтобы не способствовать бактериальному разложению (S - R); предпочтительным является использование питательной среды картофельного агара либо непрерывных методов культивирования.
6. Необходимо испытать антиген на восьми образцах замороженных обезвоженных сывороток, с установленной положительной или отрицательной реакцией. 7. Официальный надзор и контроль за качеством стандартной сыворотки и антигена производится официальными учреждениями, перечисленными в пункте А. 9. настоящего Приложения. 8. Антиген поставляется в готовом виде. 9. Буферизированный анализ на антиген бруцеллы проводится следующим способом: (а) поместите одну каплю (0,03 мл) антигена рядом с одной каплей (0,03 мл) сыворотки в белую чашку; (б) смешайте обе капли при помощи аппликатора, вначале соединив капли по прямой линии, а затем сформировав кружок диаметром приблизительно 10 – 12 мм; (в) покачивайте чашку из стороны в сторону в течение 4 минут (приблизительно 30 раз в минуту); (г) показания необходимо снимать при хорошем освещении; в случае отсутствия признаков агглютинации результат анализа считается отрицательным; при наличии любой степени агглютинации результат анализа считается положительным, за исключением случаев чрезмерно интенсивного подсыхания по краям. (б) автоматический метод При использовании автоматического метода анализ должен проводиться с той же степенью чувствительности и точности, как при проведении вручную. ^ (а) Экстрагирование плазмы Пробирка с кровью, свёртываемость которой подавлена путём добавления EDTA, помещают в центрифугу на 3 минуты при скорости вращения 3 000 оборотов / минуту, а затем выдерживают при температуре 37 °С в течение 12 – 24 часов.
(б) Оценка 0,2 мл стабилизированной плазмы помещают в пробирку, содержащую 1 мл необработанного молока. Перемешав, добавляют одну каплю (0,05 мл) антигена ABR и снова хорошо перемешивают. Антиген должен быть стандартизирован относительно стандартного антигена, поставляемого учреждением, указанным в пункте А. 9. (а). По завершении 45-минутного инкубационного периода при температуре 37 °С, в течение 15 минут снимают показания. Результат анализа считается положительным в случае, если кольцо становится одного цвета со столбиком молока, либо темнее. ^ Плазма, экстрагированная как указано в пункте Д (а), может использоваться немедленно после центрифугирования без дополнительной термостабилизации. 0,05 мл плазмы перемешивают с 1 мл антигена для 50 % агглютинации сыворотки, что соответствует разведению 1 : 20 для агглютинации сыворотки. Показания снимают после инкубирования при температуре 37 °С в течение 18 – 24 часов. Положительным результатом считается 50 % и более агглютинации. Ж. Анализ на микроагглютинацию 1. Растворы приготавливаются на 0,85 %-ом физиологическом растворе поваренной соли, фенолизированном при 0,5 %. 2. Антиген должен быть приготовлен как указано в пунктах А. 6., 7. и 8. и титрован как указано в пункте А. 5. Непосредственно перед использованием антигена необходимо добавить сафранин О (0,02 % окончательного раствора). 3. Стандартная сыворотка аналогична указанной в пункте А. 1. 4. Стандартная сыворотка поставляется учреждением Bundesgesundheitsamt, Berlin. 5. Анализ на микроагглютинацию проводится на чашках, имеющих углубления, с коническим дном, объёмом 0,250 мл. Анализ производится следующим способом: (а) предварительное разведение сыворотки: 0,050 мл каждой исследуемой сыворотки доливают в углубления, содержащие 0,075 мл раствора. Смеси встряхивают в течение 30 секунд;
(б) постепенное разведение сыворотки: приготовьте не менее 3 растворов для каждой сыворотки. Для этого заберите 0,025 мл каждого образца сыворотки из предварительных растворов (1 : 2,5) и поместите в углубление, содержащее 0,025 мл раствора. Таким образом первый раствор достигает концентрации 1 : 5, а последующие растворы получаются путём дублирования; (в) добавление антигена: добавьте 0,025 мл антигена в каждое углубление с различными растворами сыворотки. Встряхивайте чашки в течение 30 секунд, затем закройте соответствующими крышками и выдерживайте при температуре 37 °С в течение 20 – 24 часов в увлажнённой среде; (г) снятие показаний: оценка выпадения антигена в осадок производится путём обследования дна углубления при помощи вогнутого зеркала, размещённого над углублением. В случае отрицательной реакции, антиген образует осадок в форме небольшого диска интенсивного красного цвета с чётким краем. В случае положительной реакции, оборазуется расплывчатая розовая вуаль, равномерно распределяющаяся. Различное процентное содержание агглютинации определяется путём сравнения с результатами проверок антигена, в результате которых получено 0, 25, 50, 75 и 100 % агглютинации. Титр каждой сыворотки выражается в международных единицах агглютинации на мл. Контрольные образцы отрицательной и положительной сыворотки, разведённой до концентрации 30 международных единиц агглютинации на мл, должны быть включены в анализ. ^ 1. Используемые материалы и реактивы (а) твёрдофазные микрочашки, кюветы либо любая другая твёрдая фаза; (б) антиген прикрепляется к твёрдой фазе с помощью или без помощи поликлоновых либо моноклоновых захватывающих антител; (в) исследуемая биологическая текучая среда; (г) соответственно положительный или отрицательный контрольный образец; (д) сопряжение; (е) субстрат, адаптиованный к используемому ферменту; (ж) раствор ингибитора, в случае необходимости;
(з) растворы для разведения образцов для анализа, приготовления реактивов и мытья; (и) система снятия показаний (в зависимости от типа используемого субстрата). 2. ^ (1) Образцы молока из цистерн классифицируются как отрицательные в случае, если они дают реакцию менее 50 % от результата, полученного при испытании раствора второй международной бруцеллёзной стандартной сыворотки на отрицательном молоке концентрацией 1:10000. (2) Отдельные образцы сыворотки классифицируются как отрицательные в случае, если они дают реакцию менее 10 % от результата, полученного при испытании раствора второй международной бруцеллёзной стандартной сыворотки на физиологическом растворе либо любом другом утверждённом растворе, в соответствии с процедурой по Статье 17, с одобрения Научного Ветеринарного Комитета. (3) Титры твёрдофазного иммуноферментного анализа для выявления бруцеллёза рогатого скота соответствуют указанным в пунктах А. 1 и 2. (использовать в концентрациях, указанных на ярлыке). 3. ^ Elisa) для выявления бруцеллёза рогатого скота. Данный метод применяется для исследования образцов молока или сыворотки молока, собранных в хозяйстве от по меньшей мере 30 % дойных коров. В случае, если используется данный метод, необходимо принять меры к тому, чтобы можно было с уверенностью идентифицировать животное, от которого был взят данный образец молока или сыворотки.
^ ГЛАВА I СТАДА, СТРАНЫ-ЧЛЕНЫ ЕС И РЕГИОНЫ, ОФИЦИАЛЬНО ПРИЗНАННЫЕ СВОБОДНЫМИ ОТ ЭНЗООТИЧЕСКОГО ЛЕЙКОЗА РОГАТОГО СКОТА А. Стадом, официально признанным свободным от энзоотического лейкоза рогатого скота, считается стадо, в котором: (i) не зафиксировано, клинически или в результате лабораторного анализа, ни одного случая энзоотического лейкоза рогатого скота в стаде, а так же ни одного случая такого заболевания не выявлено в предшествующие два года; а так же (ii) все животные в возрасте от 24 месяцев показали отрицательную реакцию в течение предшествующих 12 месяцев при двух анализах, выполненных в соответствии с настоящим Приложением, с интервалом не менее четырёх месяцев; либо (iii) выполняются все требования пункта (i); стадо находится на територии страны-члена ЕС или региона, официально признанного свободным от энзоотического лейкоза коров. Б. Стадо сохраняет статус официально признанного свободным от энзоотического лейкоза рогатого скота при условии: (i) продолжают выполняться условия пункта А (i); (ii) все животные, поступающие в стадо, происходят из стада, официально признанного свободным от энзоотического лейкоза рогатого скота; (iii) все животные в возрасте от 24 месяцев продолжают показывать отрицательную реакцию при анализе, проводимого в соотствие с положениями главы II с интервалом в три года; В. Действие статуса стада, официально признанного свободным от лейкоза, должно быть приостановлено, если требования, определённые в пункте Б, не выполняются. Г. Действие статуса остается приостановленным до тех пор, пока не будут соблюдаться следующие условия: 1. Если отдельное животное в стаде, официально признанном свободным от энзоотического лейкоза рогатого скота, показывет положительную реакцию при одном из анализов, упомянутых в главе II:
(i) животное, показавшее положительную реакцию, либо, для коров, любой телёнок, рождённый таким животным, должны быть удалёны из стада для забоя под надзором ветеринарных врачей; (ii) все оставшиеся животные показали отрицательную реацию при анализе на серологическую реакцию, проведённом в соответствии с полпожениями главы II ни менее трёх месяцев спустя после удаления животного, показавшего положительную реакцию, а так же его возможного потомства; (iii) было проведено эпидемиологическое расследование, показавшее отрицательный результат, и стада, эпидемиологически связанные с инфицированным стадом, подверглись мероприятиям, определённым в пункте (ii). Однако компетентный орган может предоставлять частичную отмену обязательства для забоя телёнка от инфицированной коровы, в случае, если телёнок был разлучён с матерью немедленно после отёла. В этом случае телёнок должен пройти мероприятия, определённые в пункте 2 (iii). 2. В случае, если в стаде, официально признанном свободным от энзоотического лейкоза рогатого скота, более одного животного показало положительную реакцию при одном из анализов, упомянутых в главе II, либо подтверждается наличие инфекции в стаде: (i) все животные, показавшие положительную реакцию и их телята должны быть удалены из стада для забоя под наблюдением ветеринарного врача; (ii) все животные в стаде в возрасте от 24 месяцев должны показать отрицательную реакцию при двух анализах, проведённых в соответствии с требованиями главы II с интервалом не менее четырёх месяцев и не более двенадцати месяцев; (iii) все остальные животные в стаде после идентификации должны оставаться в хозяйстве до достижения 24 месяцев и, по достижении этого возраста, пройти анализы в соответствии с пунктом (ii); (iv) было проведено эпидемиологическое расследование, показавшее отрицательный результат, и стада, эпидемиологически связанные с инфицированным стадом, подверглись мероприятиям, определённым в пункте (ii). Однако компетентный орган может предоставлять частичную отмену обязательства для забоя телёнка от инфицированной коровы, в случае, если телёнок был разлучён с матерью немедленно после отёла. В этом случае телёнок должен пройти мероприятия, определённые в пункте 2 (iii).
3. В случае приостановки действия статуса стада, официально признанного свободным от энзоотического лейкоза рогатого скота, по иным причинам, все животные в стаде в возрасте от 24 месяцев должны пройти анализ на серологическую реакцию, в соответствии с требованиями главы II, с отрицательным результатом. Д. В соответствии с процедурой по Статье 17 страна-член ЕС либо регион страны-члена ЕС могут быть официально признаны свободными от энзоотического лейкоза рогатого скота, если: (а) не менее 99,8 % стад рогатого скота официально признаны свободными от энзоотического лейкоза рогатого скота, в соответствии с требованиями раздела А; либо (б) ни одного случая заболевания энзоотическим лейкозом рогатого скота не было зафиксировано в стране-члене ЕС или регионе страны-члена ЕС в течение трёх предыдущих лет, а так же для страны-члена ЕС, все животные в возрасте от 24 месяцев в, поменьшей мере, 10 % стад, отобранные в произвольном порядке, показали отрицательную реакцию при анализах,проведенных в соответсвие с положениями главы II в предшествующие двадцать четыре месяца, либо для региона страны-члена ЕС, все животные в возрасте от 24 месяцев при проведении анализа в соответствии с положениями главы II показали отрицательную реакцию. Е. Страна-член ЕС либо регион страны-члена ЕС сохраняет статус официально признанного свободным от энзоотического лейкоза рогатого скота при соблюдении следующих условий: (i) ежегодно в результате произвольного отбора со степенью вероятности 99 % установлено, что менее 0,2 % стад инфицированы, либо не менее 20 % голов рогатого скота в возрасте от 24 месяцев проходят анализы и показывают отрицательную реакцию на анализ, выполненный в соответствии с требованиями главы II; либо (ii) в случае, если ни одного случая заболевания энзоотическим лейкозом рогатого скота не было зафиксировано в стране-члене ЕС или регионе страны-члене ЕС в соотношении одно стадо из 10 000 стад на протяжении не менее 3 лет, может быть принять постановление, в соответствии со процедурой по Статье 17, о прекращении проведения текущих анализов на серологическую реакцию при условии, что:
- весь рогатый скот, забиваемый на территории страны-члена ЕС или региона страны-члена ЕС, направляется на вскрытие официальным ветеринарным врачом, который должен направлять все случаи опухолей на лабораторной исследование, а так же - страна-член ЕС обязана уведомлять Комиссию обо всех случаях заболевания энзоотическим лейкозом рогатого скота в регионе. Комиссия может, в соответствии с процедурой по Статье 17, вынести предложение о приостановке либо отмене постановления о прекращении текущих анализов на серологическую реакцию, а так же - все животные, показывающие положительную реакцию при анализе на иммунодиффузию, забиваются, и стадо подлежит ограничениям до возобновления его статуса в соответствии с требованиями Главы IГ. Ж. (i) Действие статуса страны-члена ЕС либо региона страны-члена ЕС, официально признанных свободными от энзоотического лейкоза рогатого скота, должно быть приостановлено, в соответствии с процедурой по Статье 17, в случае обнаружения и подверждения заболеваний энзоотическим лейкозом рогатого скота в более 0,2% хозяйств в регионе или стране-члене ЕС. (ii) Статус свободного от энзоотического лейкоза рогатого скота может быть восстановлен в соответствии с процедурой по Статье 17 при условии, если: (а) в дополнение к мерам, установленным в параграфах Г.I и II, не менее 20 % других стад, отобранных произвольно, в стране-члене ЕС или регионе страны-члена ЕС в 12 месячный период подвергаются одному из анализов, установленных в главе II; (б) в результате этого анализа со степенью вероятности 99 % подтвержается, что инфицировано менее 0,2 % стад.
ГЛАВА II ^ Пробы на энзоотический лейкоз рогатого скота должны проводиться с использованием иммуно-диффузного анализа в условиях, указанных в пунктах А. и Б., либо твёрдофазного иммуноферментного анализа (Elisa) в условиях, описанных в пункте В. Иммуно-диффузный метод используется только при индивидуальных пробах. В случае, если имеются основания считать результаты анализа неточными, необходимо провести дополнительную проверку методом иммуно-диффузного анализа. ^ 1. Антиген, используемый при проведении анализа, должен содержать глюкопротеиды вируса лейкоза рогатого скота. Антиген должен быть стандартизирован по стандартной сыворотке (сыворотка El), поставляемой Государственной Ветеринарной Лабораторией Сыворотки, Копенгаген. 2. Государственные учреждения, перечисленные ниже, должны нести ответственность за калибровку стандартного рабочего антигена в лаборатории по сыворотке официального стандарта ЕС (сыворотка El), поставляемой Государственной Ветеринарной Лабораторией Сыворотки, Копенгаген. (а) Германия: Bundesforschungsanstalt für Viruskrankheiten der Tiere, Tubingen; (б) Бельгия: Institut national de recherches vétérinaires, Brussels; (в) Франция: Laboratoire national de pathologie bovine, Lyon; (г) Великое Княжество Люксембург:_ (д) Италия: Instituto zooprofilattico spenmentale , Perugia; (е) Нидерланды: Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid (ID-DLO), Lelystadt; (ж) Дания: Statens Veretinaere Serumlaboratorium, Copenhagen; (з) Ирландия: Veterinaty Resеarch Laboratory, Abbotstown, Dublin; (и) Объединённое Королевство: - Великобритания: Veterinary Laboratory Agency, Addlestone, Weybridge, - Северная Ирландия: Veterinaty Resеarch Laboratory, Stormont, Belfast; (к) Греция: Κέντρο Κτηνιατριχών Ιδρυμάτων Νεαπόλεως 25, 153 10 Αθήνα;
(л) Испания: Subdirreccion general de sanidad animal. Laboratorio de sanidad y producction animal, Algete, Madrid; (м) Португалия: Laboratorio Nacionalo de Investigação Veterinária, Lisbon; (н) Австрия: Bundesanstalt für Tierseuchenbekämpfung, Mödling; (o) Финляндия: Eläinlääkintä – ja elintarvikelaitos, Helsinki-anstalten för veterinärmedicin och livsmedel, Helsingsfors; (п) Швеция: Statens veterinärmedicinska anstalt, Uppsala. 3. Стандартные антигены, используемые в лабораторных условиях, не менее 1 раза в год должны быть представлены в справочные лаборатории ЕС, перечисленные в пункте 2, для проверки по сыворотке официального стандарта ЕЕС. Кроме стандартизации, используемый антиген может быть калиброван в соответствии с требованиями пукта Б. 4. Реактивы для анализа: (а) антиген: антиген должен содержать специфические глюкопротеиды вируса энзоотического лейкоза рогатого скота, стандартизированные по сыворотке официального стандарта ЕЕС; (б) аналитическая сыворотка; (в) контрольный образец положительной сыворотки; (г) агаровый гель: 0,8 % агара, 8,5 % NaCl, 0,05 М трибуферный pH 7,2; 15 мл данного агара необходимо поместить в чашку Петри диаметром 85 мм так, чтобы образовался слой агара толщиной 2,6 мм. 5. Необходимо прорезать в агаре семь сухих отверстий, достигающих дна чашки; отверстия должны располагатся в определённом порядке: одно отверстие в центре и шесть отверстий вокруг центрального. Диаметр центрального отверстия: 4 мм. Диаметр периферийных отверстий: 6 мм. Расстояние между центральным и периферийными отверстиями: 3 мм.
6. Центральное отверстие заполняется стандартным антигеном. Периферийные отверстия 1 и 4 заполняются положительной сывороткой, отверстия 2, 3, 5 и 6 заполняются испытуемыми сыворотками. Отверстия заполняются до исчезновения мениска. 7. При этом должно быть израсходовано следующее количество: антигена: 32 мкл контрольной сыворотки: 73 мкл испытуемой сыворотки: 73 мкл 8. Инкубируйте в течение 72 часов при комнатной температуре (20-27 °С) в закрытой увлажнительной камере. 9. Показания можно снимать по истечении 24 или 48 часов, но окончательный результат может быть получен только по истечении 72 часов: (а) испытуемая сыворотка является положительной, если она образует особую преципитиновую линию с антигеном вируса лейкоза рогатого скота и образует линию полной идентичностьи с контрольной сывороткой; (б) испытуемая сыворотка является отрицательной, если она не образует особой преципитиновой линии с антигеном антигеном вируса лейкоза рогатого скота и не отклоняет линию контрольной сыворотки; (в) реакцию нельзя считать определённой в случае, если: (i) испытуемая сыворотка отклоняет линию контрольной сыворотки по направлению к отверстию, содержащему этот антиген без образования видимой преципитиновой линии с антигеном; либо (ii) полученный результат нельзя считать положительным или отрицательным. В случае неопределённого результата анализ можно повторить с использованием концентрированной сыворотки. 10. Анализ можно проводить с использованием любой другой конфигурации или расположения отверстий при условии, что сыворотка E4, разведённая в отрицательной сыворотке в соотношении 1 : 10, может быть определена как положительная.
Б. Метод стандартизации антигена Необходимые растворы и материалы: 1. 40 мл 1,6%-ной агарозы на буферном растворе 0,05 М трис/HCl, уровень pH 7,2 с 8,5 % NaCl; 2. 15 мл сыворотки ЛРС, содержащей антитела к глюкопротеидам вируса лейкоза рогатого скота, разведённой в соотношении 1 : 10 в буферном растворе 0,05 М трис/HCl, уровень pH 7,2 с 8,5 % NaCl; 3. 15 мл сыворотки ЛРС, содержащей антитела к глюкопротеидам вируса лейкоза рогатого скота, разведённой в соотношении 1 : 5 в буферном растворе 0,05 М трис/HCl, уровень pH 7,2 с 8,5 % NaCl; 4. четыре пластмассовые чашки Петри диаметром 85 мл; 5. пуансон диаметром 4 –6 мм; 6. справочный антиген; 7. антиген, подлежащий стандартизации; 8. водяная баня с поддержанием температуры 56 °С. Процедура Растворите агарозу (1,6 %) в буферном растворе Трис\HCl при аккуратном нагревании до 100 °С. Поместите на водяную баню при температуре 56 °С приблизительно на 1 час. Так же поместите растворы сыворотки ЛРС на водяную баню при температуре 56 °С. Затем смешайте 15 мл раствора агарозы температурой 56 °С и 15 мл сыворотки ЛРС (1 : 10), быстро встряхните и налейте по 15 мл в 2 чашки Петри. Повторите процедуру с сывороткой ЛРС контцентрацией 1 : 5. После того, как агароза затвердеет, проделайте отверстия и заполните следующим образом: ^ (i) чашки Петри 1 и 3: отверстие А – неразведённый справочный антиген, отверстие Б – справочный антиген, разведённый в соотношении 1 : 2, отверстия В и Д – справочный антиген, отверстие Г – неразведённый испытуемый антиген.
(ii) чашки Петри 2 и 4: отверстие А – неразведённый испытуемый антиген, отверстие Б – испытуемый антиген, разведённый в соотношении 1 : 2, отверстие В – испытуемый антиген, разведённый в соотношении 1 : 4, отверстие Г – испытуемый антиген, разведённый в соотношении 1 : 8. Дополнительные инструкции 1. Эксперимент необходимо проводить с использованием 2 растворов сыворотки (1 : 5) и (1 : 10) для достижения оптимального осаждения. 2. В случае, если диаметр осаждения очень мал в обоих растворах, сыворотку необходимо развести дополнительно. 3. В случае, если диаметр осаждения в обоих растворах очень велик и слаб, нужно использовать более слабый раствор сыворотки. 4. Окончательная концентрация агарозы должна составить 0,8 %; окончательная концентрация сыворотки – 5 % и 10 % соответственно. 5. Нанесите полученные значения диаметров на график в следующей системе координат. Раствор испытуемого антигена с тем же диаметром, что и у справочного антигена, является рабочим раствором. ^ 1. Используемые материалы и реактивы (а) твёрдофазные микрочашки, кюветы либо любая другая твёрдая фаза; (б) антиген прикрепляется к твёрдой фазе с помощью или без помощи поликлоновых либо моноклоновых захватывающих антител. В случае, если антиген прикрепляется непосредственно к твёрдой фазе, все аналитические образцы, показывающие положительную реакцию, должны быть повторно проверены по контрольному антигену в случае энзоотического лейкоза рогатого скота. Контрольный антиген должен быть идентичен антигену (кроме антигенов вируса лейкоза рогатого скота). В случае, если антитела прикрепляются к твёрдой фазе, антитела не должны реагировать на антигены, кроме антигенов вируса ЛРС; (в) исследуемая биологическая текучая среда; (г) соответственно положительный или отрицательный контрольный образец;
(д) сопряжение; (е) субстрат, адаптиованный к используемому ферменту; (ж) раствор ингибитора, в случае необходимости; (з) растворы для разведения образцов для анализа, приготовления реактивов и мытья; (и) система снятия показаний (в зависимости от типа используемого субстрата). 2. ^ Чувствительность твёрдофазного имунного анализа (Elisa) должна быть такого уровня, чтобы сыворотка Е4 считалась положительной, если она разведена в 10 раз (образцы сыворотки) или в 250 раз (образцы молока) сильнее, чем раствор, полученный при объединении отдельных образцов. При проведении анализов, при которых образцы (сыворотка и молоко) проверяются отдельно, сыворотка Е4, разведённая в соотношении 1 : 10 (в отрицательной сыворотке) либо 1 : 250 (в отрицательном молоке), считается положительной при проверке в пробном растворе, используемом для анализов отдельных образцов. Государственные учреждения, перечисленные в пункте А. 2., несут ответственность за проверку качества твёрдофазного имунного анализа и, в частности, за определение (для каждой производственной партии) числа образцов, подлежащих объединению, на основании значения, полученного для сыворотки Е4. Сыворотка Е4 поставляется Национальной Ветеринарной Лабораторией, г. Копенгаген. 3. ^ Elisa) для выявления лейкоза рогатого скота. Данный метод применяется для исследования образцов молока или сыворотки молока, собранных в хозяйстве от по меньшей мере 30 % дойных коров. В случае, если используется данный метод, необходимо принять меры к тому, чтобы можно было с уверенностью идентифицировать животное, от которого был взят данный образец молока или сыворотки.
^ (а) Заболевания рогатого скота - Ящур - Бешенство - Туберкулёз - Бруцеллёз - Контагеозная плевропневмония рогатого скота - Энзоотический лейкоз рогатого скота - Сибирская языва (б) Заболевания свиней - Бешенство - Бруцеллёз - Классисческая чума свиней - Африканская чума свиней - Ящур - Везикулярная болезнь свиней - Сибирская язва ^ - Синдром Ауджезски - Инфекционный ринотрахеит рогатого скота Инфекционный бруцеллёз свиней - Заразный гастроэнтерит
^ Рогатый скот/ свиньи для забоя/ разведения/ производства продукции(1)
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям