Г. Н. Соколова Доктор медицинских наук
|
|
Скачать 1.23 Mb.
|
|
^
Протокол исследования включал 3 временных этапа: 1. На момент поступления в стационар: • верификация диагноза; • диагностика Нр до лечения (инвазивный и малоинвазивный методы); • получение первичных до лечения иммунологических данных. 2. По окончании базисной терапии в сочетании с эрадикационной терапией, на ~ 21 сутки пребывания в стационаре: • эндоскопический контроль; • диагностика Нр после лечения (инвазивный и малоинвазивный методы); • получение вторичных (после лечения) иммунологических данных; Через 12 недель после окончания стационарного лечения: • динамика изучаемых иммунологических показателей.  Рисунок 2.2 Дизайн исследования больных хроническим панкреатитом. Клиническое исследование включало детальный расспрос больных: • данные анамнеза настоящего заболевания: о ранее имеющихся симптомах и признаках хронического панкреатита, о частоте предыдущих обострений, о количестве госпитализаций в стационар по поводу обострения настоящего заболевания; • данные анамнеза жизни: о продолжительности, количестве и виде употребляемого алкоголя, данных наследственности: наличие у родственников желчно-каменной болезни, сахарного диабета, очаговых образований поджелудочной железы; • данные физикального осмотра; • данные лабораторных методов исследования: общий анализ крови, общий анализ кала, анализ мочи на диастазу, сахар суточной мочи, биохимический анализ крови; • данные инструментальных методов: ультразвуковое исследование органов брюшной полости, рентгенологическое исследование верхних отделов пищеварительного тракта, эзофагогастродуоденоскопия, при необходимости проводилась компьютерная томография органов брюшной полости. Диагноз хронического алкогольного панкреатита устанавливался на основании: • жалоб: выраженный болевой синдром различной локализации, чаще в эпигастральной области и левом подреберье, рвота, снижение веса, выраженное нарушения стула: диарея. Чередование запоров с поносами. • данные анамнеза настоящего заболевания: о имеющихся ранее симптомах и признаках хронического панкреатита, о их связи с употреблением алкоголя, о частоте предыдущих обострений, о количестве госпитализаций в стационар по поводу обострения данного заболевания, об операциях по поводу основного заболевания, его осложнений. • данные анамнеза жизни: о продолжительности, количестве и виде потребляемого алкоголя, данных наследственности: наличие у близких родственников хронического алкоголизма и поражений поджелудочной железы. • данные физикального осмотра: дефицит массы тела, болезненность при пальпации в эпигастральной области и левом подреберье. • данные лабораторных методов исследования: в общем анализе крови – повышение количества лейкоцитов, ускоренное СОЭ; в биохимическом анализе – повышение цифр амилазы, липазы, иногда глюкозы. В анализе мочи – повышение уровня диастазы. • данных инструментальных методов исследований: – ультразвуковое исследование органов брюшной полости: увеличение в размерах поджелудочной железы, изменение формы железы; расширение нечеткость контуров главного панкреатического протока, наличие в нем кальцинатов, кист, псевдокист, кальцификатов в ткани поджелудочной железы, выраженное повышение эхогенности ткани железы, ее неоднородность. – рентгенологические данные верхних отделов пищеварительного тракта: косвенные признаки увеличения головки поджелудочной железы; оттеснение большой кривизны тела желудка, инверсия петли 12-перстной кишки. – данные компьютерной томографии: увеличение в размерах головки тела или хвоста поджелудочной железы, наличие кальцинатов, кальцификатов в ткани, в главном протоке, наличие кист, псевдокист железы. – при постановки диагноза ХП алкогольной этиологии применялся опросник CAGE (цитировано по Шейла Шерлок, Дж. Дули, 1999 г. – «Болезни печени»):
Диагноз хронического билиарного панкреатита устанавливался на основании: • жалоб: умеренно выраженные боли в верхних отделах живота, диспепсические расстройства. • данных анамнеза: о ранее имевшихся симптомах и признаках хронического панкреатита, о частоте предыдущих обострений, о связи обострений с погрешностями в диете, о количестве госпитализаций в стационар по поводу обострения данного заболевания, о длительности заболевания, об операциях на желчном пузыре и желчевыводящих протоках. • данных анамнеза жизни: частота и длительность злоупотребления жирной, жареной пищей, данные наследственности – наличие у родственников хронического холецистита, желчно-каменной болезни, холедохолитиаза. • данных физикального осмотра: часто больные повышенного питания, наличие умеренной болезненности при пальпации в правом подреберье. • данных лабораторных методов диагностики: в клиническом анализе крови – незначительное ускорение СОЭ и повышение количества лейкоцитов или нормальные значения; в биохимическом анализе – повышение холестерина, билирубина, щелочной фосфотазы, либо нормальные показатели. • данных инструментальных исследований: – ультразвуковое исследование органов брюшной полости: нечеткость и неровность контуров, неоднородность паренхимы поджелудочной железы при нормальных ее размерах, умеренное гомогенное повышение эхогенности ткани железы. Эзофагогастродуоденоскопия производилась двукратно с помощью гибких эндоскопов «Pentax» с визуальной оценкой верхних отделов пищеварительного тракта и прицельной биопсией. Определение Нр осуществлялось непрямым инвазивным биохимическим методом с использованием тест-системы Pliva-Lachema URE-Hp test. ^ 2.3.1 Скрининговая диагностика Нр (непрямой инвазивный метод)URE-НР test (фирмы PLIVA-LACHEMA, Брно, Чехия). Набор URE-НР test предназначен для быстрого выявления Helicobacter pylori в биоптатах. Выявление Н. pylori основано на ферментативном гидролизе уреазы (сильная уреазная активность – характерное свойство Н. pylori). Для подтверждения диагноза требуется положительный результат выделения культуры либо данные микроскопии. Тест помещен в 8 луночные стрипы микротитровальной пластинки. Набор содержит 3 пластинки и позволяет провести 288 (96х3) определений. Интерпретация реакции представлена на рисунке 2.3.
Рисунок 2.3 Интерпретация реакции URE-НР test. Биохимический метод (непрямой инвазивный метод) является наиболее востребованным в практической медицине и основан на присущей Нр высокой активности уреазных ферментов, в 100 раз превышающей таковую у других уреазопозитивных бактерий (вследствие чего носит название «уреазного теста»). Метод прост в использовании, не требует дополнительных исследований и позволяет с достаточно высокой точностью идентифицировать Нр по изменению цвета индикатора в результате защелачивания среды теста аммиаком, выделившимся в процессе гидролиза мочевины теста микробной уреазой (рис 2.3). В качестве индикатора служит феноловый красный, который изменяет свой цвет с желтого в кислой среде на красный в щелочной. Время срабатывания теста от 5 мин до 3 часов. Специфичность и чувствительность теста зависит от степени обсемененности исследуемого биоптата, сроков хранения и приема антисекреторных препаратов. Основным недостатком уреазных тестов является их непрямая сущность, то ест выявление не бактерий как таковых. А лишь их уреазной активности. При невысокой обсемененности суммарная уреазная активность может быть очень низкой. Что может привести к ложноотрицательному результату. Кроме того, существуют и уреазонегативные штаммы Нр, для которых уреазные тесты непригодны. ^ Гистологический метод, прежде всего, позволяет оценить характер патологического процесса в слизистых оболочках верхних отделов желудочно-кишечного тракта. Наличие, выраженность и активность воспаления, развитие атрофии и кишечной метаплазии. Главным достоинством этого метода является возможность помимо оценки патологического процесса обнаружить бактерии Нр и наблюдать их взаимоотношение с поверхность клеточных элементов слизистой желудка. Гистологическая оценка биоптатов проводилась при помощи световой микроскопии. Кусочки слизистой оболочки тела и антрального отдела желудка, полученные при прицельной биопсии, фиксировали в 10% нейтральном формалине, забуференном по Лили. После фиксации заливали в парафин и получали срезы толщиной 5 мкм. Для оценки общепатологических изменений слизистой оболочки парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином, выраженность и активность воспалительного процесса в СО устанавливали по интенсивности лимфоплазмоцитарной инфильтрации и присутствию в ней нейтрофильного (гранулоцитарного) компонента, используя для объективной оценки результатов визуально-аналоговую шкалу морфологических изменений СО [92]. Диагноз хронического гастрита ставился в соответствии с международной классификацией (модификация Сиднейской системы). Для верификации Helicobacter pylori элективную окраску срезов проводили при помощи реактива Гимзы (фирма «Мерк»). Оценку Helicobacter pylori. – обсемененность слизистой оболочки проводили согласно методике предложенной Л.И. Аруином и соавт., (1995), представленной в таблице 2.2. Таблица 2.2 Оценка степени обсемененности слизистой оболочки Helicobacter pylori
Учитывалось расположение микробных тел: на поверхности слизистой оболочки, в глубине ямок, адгезия. ^ В исследуемой группе больных иммунологические показатели изучались в сыворотке крови больных. Натощак после пункции локтевой вены проводилось взятие 10 мл крови в центрифужную пробирку. Для получения сыворотки проводилось центрифугирование в течение 10-15 мин при 1500 об/мин. Полученная сыворотка замораживалась при t˚ = – 40˚С. Сроки определения иммунологических показателей в сыворотке крови: • при поступлении в стационар на фоне обострения заболевания; • по окончании терапии, на ≈ 20 сутки пребывания в стационаре; • через 12 недель после окончания курса лечения. В сыворотке крови больных уровень основных классов иммуноглобулинов: Ig M, IgG, IgA определяли методом радиальной иммунодиффузии (G. Mancini et al., 1965). Серологический метод диагностики основан на обнаружении антител различных классов (Ig M, IgG, IgA), образовавшихся в крови больного в ответ на инфекцию Helicobacter pylori. Определение антител проводилось с помощью иммуноферментного анализа. ^ В настоящей работе использовались тест-системы «ХеликоБест-антитела» ЗАО «Вектор Бест» (Новосибирск). Суммарные (IgM, IgG, IgA) антитела к Саg А антигену Нр выявлялись в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа в твердофазовой модификации. На лунках стандартного полистиролового микропланшета (твердая фаза) сорбированы рекомбинантные антигены Нр. В используемые лунки вносятся контроли и исследуемые образцы сыворотки в предварительном разведении (1:10), при инкубации иммобилизованным сорбентом улавливаются специфические антитела разных классов иммуноглобулинов, присутствующие в образце. Не связавшиеся антитела удаляются в результате промывки. К образовавшемуся иммунокомплексу добавляют конъюгат – рекомбинантный Cag A белок – в комплексе с пероксидазой хрена. Повторная промывка удаляет несвязанный конъгат. В результате образуется иммунопероксидазный тройной комплекс, при добавлении к которому раствор хромогена (ТМБ с ЦФР) происходит специфическое окрашивание. Внесение стоп-реагента способствует изменению окраски и остановки реакции. Результаты твердой модификации ИФА учитываются спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность (ОП) на длине волны 450 нм ОПкрит по формуле: ОПкрит = ОПср К– + 0.2, где – ОПср К– – среднее значение оптической плотности К–. Один набор рассчитан на проведение 96 анализов, включая контроль. Возможны 12 независимых постановок ИФА, при каждой из которой 3 лунки используют для постановки контролей. Таблица 2.3 Интерпретация результатов
Примечание. Сыворотки с результатом «сомнительный*» исследовались повторно, согласно рекомендации фирмы производителя. Для исключения неточных и ложных результатов проросшие и гиперлипидные сыворотки в исследование не включались. ^ В настоящей работе использовались тест-системы «ЭКОлаб-Хеликобактер-IgA (IgG)», Эко-Лаб (г. Элекрогорск). Выявлялись специфические антитела класса IgG, IgA к очищенным антигенам Нр в сыворотке крови методом двухстадийного непрямого иммуноферментного анализа в твердофазовой модификации. На лунках стандартного полистиролового микропланшета (твердая фаза) сорбирован очищенный антиген Нр. В используемые лунки вносят контрольные сыворотки (К+ – титр 1:400, К–, Кпор – титр 1:100) и исследуемые образцы сыворотки в предварительном разведении (1:101), при инкубации, присутствующие в образце антихеликобактерные IgA (IgG) антитела связываются с иммобилизованным антигеном. Не связавшиеся антитела удаляются в результате промывки. К образовавшемуся иммунокомплексу добавляют конъюгат – специфические антитела к IgA-Нр (IgG-Нр) человека, меченные пероксидазой хрена. Несвязавшийся конъюгат удаляется путем промывки. Образовавшийся комплекс «антиген-антитело-конъюгат» выявляется по реакции с субстратом пероксидазы – тетраметилбензидином (ТМБ), в результате которой меняется окрашивание в лунке планшета. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации специфических антител класса IgA (IgG) к Нр, внесение стоп-реагента меняет цвет и останавливает реакцию. Результаты твердофазной модификации ИФА учитываются спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность (ОП) на длине волны 450 нм, с последующим расчетом пороговой ОП(пор) [ОПпор = ОП (Кпор) + ОП (К-)] и количественной оценкой результатов по выстроенной калибровочной кривой. Интерпретация результатов представлена в таблице 2.4. Таблица 2.4 Определение титра видоспецифических антител к Нр и качественная оценка результата по оптической плотности сыворотки
Примечание. Исследуемые образцы учитываются как «положительные» при ОП ≥ ОПпор, как «отрицательные» при ОП < ОПпор Для исключения неточных и ложных результатов проросшие и гиперлипидные сыворотки в исследование не включались. ^ Накопление и обработка данных производилась с использованием программы МS Excel (Microsoft Office XP Professional, 2002). Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием Statsoft «Statistika 5.5» USA. Оценивая вид распределения: для описания выборочного нормального распределения признака вычисляется среднее значение, среднее квадратичное отклонение (СКО), для выборочного негауссова распределения – медиана и интерквартильный размах. Исследуемые группы являлись зависимыми (связанными), для сравнения использовались параметрический метод – t-критерий Стьюдента – (в случае нормального распределения признака) и непараметрический – критерий Вилкоксона – в случае, когда анализируемый признак является количественным, но хотя бы в одной из выборок его распределение не является нормальным. Различия считались значимыми, при уровне вероятности р<0.05, допустимом при проведении медицинских научных исследований. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям