36 генная терапия при черепно-мозговой травме экспериментальные данные и клинические перспективы
|
|
Скачать 259.74 Kb.
|
|
Клиническое руководство по черепно-мозговой травме 3  6ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ ПРИ ЧЕРЕПНО-МОЗГОВОЙ ТРАВМЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ДАННЫЕ И КЛИНИЧЕСКИЕ ПЕРСПЕКТИВЫ Е.Г.Педаченко, В.В.Белошицкий, Н.Я.Гридина Генная терапия — новая стратегия лечения с использованием методик переноса генетического материала в клетки с лечебной целью, Генная терапия предполагает использование различных способов доставки фрагментов нуклеиновых кислот (ДНК или РНК), кодирующих определенный полипептид, с целью экспрессии последнего в клетках организма — реципиента. Протеин, запуск или усиление синтеза которого является целью применения генной терапии, может быть энзимом, структурным белком или выполнять другую функцию. Трансгенные протеины могут быть гормонами, нейротрансмиттерами, частями цитоскелета, формировать ионные каналы, рецепторы. Энзимы участвуют в синтезе других белков и прочих биологически активных веществ, которые могут оставаться в клетке или секретиро-ваться экстрацеллюлярно, действовать аутокрин-ным, паракринным или эндокринным способом [5]. В 1997 году B.V. Zlocovic и M.L.J. Apuzzo [49] выделяли 4 основных цели применения генной терапии при неврологических заболеваниях: 1) Трансгены могут быть использованы для лечения нейро-дегенеративных заболеваний, обусловленных ферментной недостаточностью вследствие дефекта единичного гена. Генная терапия может применяться для замещения ^функционирующего гена при рецессивных болезнях. При мутации доминантного гена использование метода может быть направлено на выработку антител к патологическому белку либо его рецептору, а также может включать применение некоторых других методик; 2) Генная терапия может способствовать восполнению функции утраченных нейронов при нейродегенеративных заболеваниях, ликвидируя дефицит нейротрансмит- теров, способствуя секреции нейротрофических факторов, рецепторов клеточной стенки, экспре-сии антиапоптозных генов; 3) Генная терапия применяется при лечении опухолей головного мозга. Примером может быть использование гена тими-динкиназы вируса простого герпеса (HSV-tk), который будучи интегрированным в клеточный геном делает клетку чувствительной к противовирусному препарату ганцикловиру. Последующее назначение ганцикловира приводит к гибели клеток, подвергшихся трансфекции HSV-tk; 4) Изучаются различные методики применения генной терапии при цереброваскулярной патологии. Последние несколько лет характеризуются повышенным интересом к исследованию возможностей применения генной терапии при черепно-мозговых повреждениях, увеличением числа экспериментальных работ в этой области, однако К. Yang и соавторы [48] отмечают, что проблема остается далеко не изученной. ^ На основании данных, приведенных в литературных обзорах К. Yang и соавторы [47] и С. Weil и соавторы [46], выделяют следующие виды генной терапии. Прежде всего, генная терапия может быть:1) фетальной (germ line gene therapy), которая предполагает перенос генов в зиготу с целью замещения генетического дефекта в последующих поколениях. Возможное клиническое применение этого метода сопряжено с целым рядом этических проблем; 2) соматической, предполагающей транс-фекцию зрелых клеток или тканей. 600 ^  Основываясь на различиях клеток-мишеней, возможны такие разновидности метода: 1) генная терапия ex vivo, включающая перенос генов в клетку in vitro с последующей имплантацией в живой организм модифицированных клеток, содержащих необходимый ген. Трансфекции в данном случае могут подвергаться либо собственные клетки реципиента, либо чужеродные; 2) генная терапия in vivo, предполагающая введение генного материала в ткани живого организма in situ.В зависимости от особенностей применяемого вектора (переносчика генного материала) методы трансфекции делятся на две главные категории: 1) с использованием вирусных векторов; 2) с использованием невирусных векторов. ^ Развитию исследований в области генной терапии при черепно-мозговых повреждениях, в первую очередь, способствовало определение терапевтической роли специфических белков, так называемых ней-ротрофинов, при ЧМТ. Нейротрофины, относящиеся к факторам роста, играют важную роль в развитии ЦНС, так как любая клетка для деления и дифференцировки нуждается в целом ряде экстра-целлюлярных сигналов в виде нейротрансмиттеров, гормонов и факторов роста. Большинство из этих молекул (лигандов) представляет собой полипептиды, связывающиеся специфически с рецепторами клеточной мембраны, что приводит к активации внутриклеточного каскада других полипептидов (вторичные мессенджеры) и передаче сигнала в клеточное ядро [20]. На примере мотонейронов показано, что у высших позвоночных эти клетки генерируются в избыточном количестве во время эмбрионального развития и затем значительное число их элиминируется. Во время постнатального развития и дальнейшей жизни популяция мотонейронов поддерживается нейротрофическими факторами, продуцируемыми скелетными мышцами и глиальными клетками [35]. Значительное число изученных факторов роста относится к различным известным семействам. Обнаружено, что в функционировании здоровой ЦНС и при ее патологии важную роль играет семейство рецепторов факторов роста, относящихся к тирозинкиназам. Рецепторы тирозинкиназных факторов роста представляют собой трансмембран- ные полипептиды с лиганд-связывающим доменом в экстрацеллюлярной части, гидрофобным трансмембранным и внутриклеточным тирозинкиназным сегментами. Тирозинкиназный сегмент является каталитическим доменом, который фосфорилирует сначала рецептор, а затем один из нескольких внутриклеточных субстратов. Это активирует вторичную митогенную систему мессенджеров внутри клетки и, при продолжающейся стимуляции факторами роста, приводит к делению клетки. К тирозинкиназным рецепторам относятся эпидермальный фактор роста (EGF), тромбоцит-производный фактор роста (PDGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF), фактор роста фибробластов (FGF), сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), фактор роста нервов (NGF) и соответствующие ли-ганды, мозг-прозводный фактор роста (BDGF) и нейротрофин-3 [20]. Отголоском структурной пластичности, наблюдающейся при развитии ЦНС, может быть ответ взрослого головного мозга на травму [28]. Указывается [43], что повреждение нейронов может иметь одно из трех следствий: клеточную смерть, стойкую атрофию нейронов или восстановление. Способность зрелых нейронов к восстановлению может определяться механизмами, влияющими на нейрональный фенотип во время развития ЦНС и включающими экспрессию генов, кодирующих факторы роста, а также реакцию на сигналы клеточного окружения. Такие сигналы представляют собой нейротрофины и молекулы-субстраты, стимулирующие рост аксонов. Способность реагировать на нейротрофические факторы демонстрируют несколько отделов взрослой ЦНС: базальные отделы переднего мозга, обонятельная кора, гип~ покамп, таламус, ствол мозга и спинной мозг. Специфичность реакций этих регионов на влияние ней-ротрофинов соответствует таковой в период развития ЦНС. Авторы приводят доказательства, что назначение нейротрофинов и субстратов, стимулирующих рост, крысам с экспериментальной ЧМТ способствовало частичному морфологическому и функциональному восстановлению. В качестве одного из эффективных средств доставки этих соединений в ЦНС предлагается метод генной терапии. Экспрессия генов, кодирующих синтез факторов роста, отмечается уже в первые часы после повреждения, однако для увеличения синтеза самих белков могут понадобиться дни [28]. К нейротрофическим факторам роста, оказывающим положительный эффект при ЧМТ, М.Р. Mat-tson и S.W. Scheff [24] относят, помимо вышеназваных NGF, BDGF, IGF, FGF и нейротрофина-3, 601 ^ также глия—производный нейротрофический фактор и интерлейкины (IL-1, 1L-6, IL-8). По мнению авторов, нейротрофины могут действовать путем влияния на свободнорадикально-кальциевые механизмы, уменьшая эффекты кальция. Нарушение поступления нейротрофических факторов во взрослую ЦНС не приводит обязательно к гибели клеток, как это отмечается в случае развития нервной системы, но непременно дестабилизирует нейроны, уменьшая их жизнестойкость и способность отвечать на повреждение, образовывать новые связи.В литературе [7,19,27,37,47] приводятся многочисленные, полученные в ходе экспериментов in vivo, доказательства способности многих факторов роста защищать нейроны от повреждения вследствие энергетического дефицита либо избытка глу-тамата или кальция. Использование NGF путем внутрижелудочковой инфузии способствовало 350% повышению выживаемости септальных холинерги-ческих нейронов при экспериментальной аксото-мии. I. Mocchetti и J.R. Wrathall [28] отмечали, что NGF, BDGF и нейротрофин—3 стимулируют рост аксонов, нужны для реорганизации поврежденной ЦНС, экспресии энзимов, необходимых для синтеза нейротрансмиттеров, что, по мнению авторов, может лежать в основе наблюдающегося в клинике значительного функционального восстановления при отсутствии регенерации поврежденных нейронов через некоторое время после травмы. По данным тех же исследователей, FGF не только поддерживает нейроны, но и стимулирует реваскуля-ризацию и определенные реакции глии на травму. Применение этого фактора в эксперименте также уменьшает эффекты вследствие аксотомии или воздействия возбуждающих токсинов. Суммируя результаты приведенных работ, можно заключить, что назначение нейротрофинов (в частности путем внутрижелудочковой инфузии или внутривенного введения, т.е. без использования методик генной терапии) экспериментальным животным с ЧМТ защищает холинэргические нейроны от смерти или дегенерации (известно, что ЧМТ приводит к утрате холинэргических нейронов), уменьшению дефицита познавательной деятельности, регрессу нарушений поведенческих реакций и памяти. Исходя из этого, можно сформулировать следующую цель генной терапии при ЧМТ — достижение терапевтически полезных уровней экспрессии нейротрофинов в травмированной ЦНС путем применения генетических методик. Следующей предпосылкой применения генной терапии при ЧМТ является доказанная зависимость последствий ЧМТ от индивидуальных генетичес- ких особенностей, в частности от АроЕ-генотипа, что может требовать специфической коррекции. Аполипопротеин Е (АроЕ) представляет собой соединение, необходимое для поддержания жизнеспособности отростков нервных клеток и тормозящее накопление в нервной системе белка амилоида-/?, аггрегация которого приводит к развитию болезни Альцгеймера [2]. В эксперименте, мыши, лишенные гена АроЕ, демонстрировали утрату аксонов и развитие нарушения поведенческих реакций по мере старения или при назначении возбуждающих токсинов. АроЕ имеет несколько изоформ, причем в отличие от АроЕ е2 и АроЕ еЗ, изоформа АроЕ е4 в меньшей степени подавляет аггрегацию амилоида-/? и менее способствует репарации аксонов. У мышей, несущих ген, кодирующий синтез АроЕ е4, отмечаются те же нарушения, что и при полном отсутствии данного гена. Хотя общий синтез белка при Ч МТ часто уменьшается, ген АроЕ относится к тем генам, экспрессия которых и, следовательно, синтез соответствующего протеина наблюдаются в ответ на травматическое и ишемическое повреждение. Считается, что в данном случае АроЕ выполняет функцию ремоделирования липидов мембран глии и нейронов [41]. Изучение зависимости исходов ЧМТ от особенностей АроЕ-генотипа показало, что частота неблагоприятных исходов (смерти и глубокой ин-валидизации) значительно возрастает у лиц, несущих аллель АроЕ е4, по сравнению с АроЕ е4 — отрицательными больными даже в случае более легких повреждений. Данная зависимость особо заметна в более молодом возрасте, в частности у детей [40]. Доказано, что очаги ушиба мозга при прочих равных условиях (возраст, время от момента получения травмы до выполнения компьютерной томографии, тяжесть травмы, оцененная по шкале ком Глазго при поступлении) имеют большие размеры у пациентов с аллелем АроЕ е4 |8|. В настоящее время считается доказанной связь на генетическом уровне между механизмами патогенеза ЧМТ и болезни Альцгеймера [41], В мозге больных, умерших от ЧМТ, в 30 % случаев определяется накопление амилоида-/3 — пептида, ответственного за образование характерных для болезни Альцгеймера бляшек [34]. Считается, что травма головного мозга может действовать как пусковой фактор острого депонирования амилоида-/? в мозговой коре, что обусловлено, вероятно, реакцией цитокинов [12]. Эпидемиологические исследования подтвердили связь между развитием болезни Альцгеймера и перенесенной ранее ЧМТ, причем травма головы с потерей сознания и по- 602 ^  ступлением б лечебное учреждение считается важным фактором риска болезни Альцгеймера [25]. Доказано, что главной генетической причиной этого заболевания является наличие гена АроЕ еЛ, экспрессия которого не препятствует накоплению амилоидного белка и не способствует репарации аксонов [2]. В то время, как у пациентов с отсутствием гена АроЕ еА скопления амилоида-/? после ЧМТ появляются только в 10 % случаев, при наличии одной копии этого аллеля такая частота возрастает до 35 %, а при наличии двух копий аллеля АроЕ £4 скопления амилоидного белка отмечаются у всех больных [30].Понимание роли генетически обусловленных факторов, определяющих те или иные исходы и отдаленные (развитие болезни Альцгеймера) последствия ЧМТ, позволяет так сформулировать следующую возможную цель генной терапии при череп-но—мозговых повреждениях — противодействие генетически обусловленным реакциям на травму, приводящим к развитию каскада патологических изменений в нервной ткани и вторичным, часто необратимым, повреждениям ЦНС. В частности, предлагается назначение аполипопротеинов г! и £3, которые могут оказать в данном случае полезное терапевтическое воздействие [41]. Активация синтеза АроЕ s2 и еЗ в нервной системе может быть осуществлена методами генной терапии или трансплантации клеток, секретирующих эти продукты [2]. Еще одной предпосылкой применения генной терапии при ЧМТ может служить повышение проницаемости гематоэнцефалического барьера при травме, что может облегчить доставку в головной мозг трансгенов с помощью векторов, доступ которых в ЦНС в других условиях ограничен [47]. ^ Учитывая, что использование генной терапии в лечении патологии ЦНС встречает ряд препятствий, таких как постмитотическое состояние нервных клеток и изоляция их гематоэнцефаличес-ким барьером (ГЭБ) [391, важным вопросом является создание оптимальных векторов и методов доставки их в головной мозг. Специалистами в области генной терапии определены свойства так называемого «идеального вектора», который должен внедряться в широкий спектр клеток организма-реципиента, эффективно доставлять терапевтический ген, обеспечивать стабильную экспрессию гена после трансфекции, вызывать незначительный иммунный ответ, обладать тканевой специфичностью и быть способным к получению в больших количествах. На основании данных, приведенных в нескольких литературных обзорах [39,46,47], можно дать следующие характеристики векторов, используемых в настоящее время в генной терапии при экспериментальной ЧМТ. ^ (рис. 36-1) имеет следующие преимущества: 1) внедряется в постмитотичес-  Рис. 36-1. Демонстрируется эффективность трапсфекции клеток ЦНС собак при помощи аденовирусного вектора, несущего ген /?- галактоз ид азы (Ad327 /5-Gal), после интратекального введения (в большую затылочную цистерну). Клетки, секрети-руюшие /3- галактоз ид азу, приобретают голубое окрашивание. (A) Увеличенная фотография базальной поверхности мозга по казывает экспрессию /3-галактозидазы в базальпых цистернах.
603 ^ кие клетки; 2) трансфекция широкого спектра клеток и тканей; 3) аденовирусы легко выращиваются в больших количествах; 4) может переносить большие отрезки ДНК. Недостатками его являются токсичность, непродолжительный эффект и способность вызывать иммунный ответ с выработкой антител, что ограничивает его повторное назначение.Для трансфекции трансплантируемых в ЦНС клеток, в частности фибробластов, использовался ретровирусньш вектор, который интегрируется в геном и поэтому обеспечивает стабильную экспрессию трансгенов. Недостатками его являются: 1) способность инфицировать только делящиеся клетки, в связи с чем ограничена трансфекция нейронов; 2) риск туморогенеза; 3) быстрая инактивация ретровирусов комплементом. В связи с многочисленными несоответствиями природных вирусов качествам «идеального вектора» изучается возможность использования для лечения заболеваний ЦНС новейших смешанных вирусных рекомбинант, в которых свойства одной вирусной системы сочетаются со свойствами другой с целью улучшения трансфера и экспрессии терапевтических генов. Среди невирусных векторов в лечении патологии ЦНС наиболее изученным является применение катионных липосом (рис. 36-2). Метод прост, бе- зопасен, не сопряжен с токсичностью, легко воспроизводим и почти не имеет ограничений в отношении размеров переносимой ДНК и типа клеток-мишеней. Липосомы готовятся следующим образом. Молекулы катионных (положительно заряженных) липидов смешиваются с молекулами ДНК, имеющей отрицательный заряд, частично нейтрализуют его, в результате чего образуются положительно заряженные комплексы, в которых молекула ДНК находится в центре, а липидньге молекулы — по периферии. Эти положительно заряженные комплексы могут связываться с отрицательно заряженной клеточной мембраной, и в результате такого взаимодействия функционально активные гены эффективно доставляются в клеточную цитоплазму. Недостатками метода являются низкая эффективность трансфекции in vivo с помощью липосом, которые готовятся с использованием доступных в настоящее время катионных липидов, и неполное понимание механизмов переноса ДНК в клетку. В то время, как трансфекция клеток-мишеней на молекулярном уровне изучена достаточно активно, проблема доставки вектора в нервную ткань (vector delivery strategies) часто остается недооцениваемым препятствием. Трансваскулярная доставка вирусных векторов ограничена наличием ГЭБ и быстрой инактивацией вирусов в кровеносном рус-  Рис. 36-2. Схематическое изображение трансфекции нейронов с помощью катионных липосом. Положительно заряженные липосомы частично нейтрализуют отрицательно заряженные молекулы ДНК и образуют положительно заряженные комплексы ДНК/ липиды. Эти комплексы связываются с отрицательно заряженной клеточной мембраной, в результате чего функционально активные гены эффективно достаачяются в клеточную цитоплазму. В последующем клетки, подвергшиеся трансфекции, секретируют белки, в данном случае NGF, которые связываются с мембранами поврежденных нейронов и оказывают нейротрофический эффект (по Yang К. et al.,1997). 604 ^  ле комплементом. Указывается, что повышение проницаемости ГЭБ при ЧМТ может обеспечивать уникальную возможность для применения генной терапии как с использованием вирусных векторов, так и липосом, проникновение которых в неповрежденный мозг ограничено, несмотря на отмеченную способность пересекать ГЭБ.С целью повышения проницаемости ГЭБ предлагается ряд терапевтических средств, в частности назначение осмодиуретиков, циркуляция которых б крови приводит к «сморщиванию» эндотелиаль-ных клеток. Проницаемость повышается в течение 5—15 минут после инфузии маннитола и нормализуется в течение 2 часов. Это приводит к эффективной экспресии трансгенов в базальных ганглиях и мозговой коре при использовании аденовирусного вектора и вируса простого герпеса. На наш взгляд, использование осмодиуретиков в комплексе лечения повышенного внутричерепного давления при тяжелой ЧМТ может облегчать применение генной терапии. Другим средством повышения проницаемости ГЭБ служит использование аналогов брадикинина, в частности RMP-7, инфузия которых приводила в ряде исследований к 12-кратному увеличению поступления терапевтических агентов вЦНС. Другим способом доставки векторов в нервную ткань может быть их прямое введение в паренхиму головного мозга. Этот метод позволяет избежать препятствия в виде ГЭБ и инактивации комплементом, его преимущества — низкая системная токсичность и использование небольшого количества вируса. После прямого введения аденовирусов или вируса простого герпеса в мозг трансфекция клеток наблюдалась в радиусе 2 мм вокруг места инъекции, что весьма значительно для мозга крыс, но не обеспечивает достаточную трансфекцию у человека. ^ может вызвать экспрессию трансгенов в клетках эпендимы и сосудистых сплетений. Этот метод может обеспечить секрецию терапевтических белков в ликвор с последующим их проникновением в головной мозг. Прямое введение аденовируса в большую затылочную цистерну приводило также к трансферу генов в лептоменингеальные клетки, окутывающие магистральные артерии, адвентици-альные клетки крупных сосудов и, реже, гладко-мышечные клетки мелких сосудов. По мнению зарубежных ученых, применение вентрикулярных канюль у больных с тяжелой ЧМТ может быть использовано для введения комплексов липосомы/ ДНК. Многообещающим методом является использование нервных стволовых клеток (НСК) в качестве вектора для генной терапии. НСК представляют собой постоянный исходный источник клеток нервной ткани — нейронов, олигодендроглии, аст-роглии, и предназначены, вероятно, для пополнения популяций и субпопуляций клеток мозга в физиологическом (старение) и патологических процессах в организме человека и животного. С момента их открытия известно, что эти клетки являются «бессмертными», т.к. пополняя популяции нервных клеток, они «самовосстанавливаются» [3,13,42J. Изолированные из тканей мозга НСК продолжают размножаться в условиях культивирования in vitro в бессывороточной среде под воздействием как эпигенетических, так и генетических факторов. В качестве эпигенетических факторов используют воздействие на НСК EGF и FGF, а генетическими факторами, которые воздействуют на НСК в условиях in vitro, являются гены v-myc и большой Т-антиген [13, 16, 29, 31, 33]. Важно отметить, что эти клетки, извлеченные из субвентрикулярной зоны головного мозга плода человека, в изолированном состоянии показали способность к дифференцировке в нейрональные и глиальньте клеточные линии, полностью проявив свою мультипотентность [44]. При имплантации мышиных клонов НСК в желудочки мозга новорожденных мышей клетки прививались в субвентрикулярной герминативной зоне, а затем начинали мигрировать к обонятельной луковице, превращаясь в нейроны. E.Y. Snyder и соавторы (38) имплантировали также человеческие клоны НСК в боковой желудочек новорожденных мышей, где они интегрировались в субвентрикулярную зону. Из этой зоны человеческие НСК затем интенсивно мигрировали или вдоль субкортикального белого вещества, или вдоль рострального миграционного тока (rostral migratory stream), как и мышиные НСК. При этом НСК давали такие же дифференцированные клеточные клоны, как если бы это происходило при нормальном развитии головного мозга человека [22, 36, 38]. Современные исследования при экспериментальной ЧМТ [18] показали, что при введении человеческих нервных клеток-предшественников фе-тального происхождения в мозолистое тело крыс с повреждением в области гиппокампа отмечается отчетливая миграция этих клеток к месту травмы. Большинство клеток, происходящих из этих предшественников, демонстрировало иммунореактивность глиальных маркёров, таких как виментин или гли-альный фибриллярный кислый протеин, меньшая 605 ^ же часть — нейрональных маркеров, таких как каль-бидин, парвальбумин или МАР2. Авторы считают, что дальнейшие исследования должны быть направлены на выяснение сигналов окружающих клеток, стимулирующих дифференциацию клеток—предшественников в нейроны in vivo, а также замещение погибших нейронов организма-реципиента. Другие исследователи [26] указывают, что природа таких сигналов в значительной степени распознана. Диф-ференцировка НСК б нейроны определяется контактными и растворимыми факторами. Это сложный процесс, требующий взаимодействия между различными клетками в течение нескольких дней. В тканевых культурах определено, что НСК трансформируются в синаптически активные нейроны под влиянием нейротрофинов, секретируемых глиаль-ными клетками. При взаимодействии нейронов и глии нейротрофины активируют глутаматэргические и GABA-эргические синапсы.Одним из направлений в использовании НСК является создание «бессмертных» клеточных линий путем генетической трансформации эмбриональных предшественников, в частности с целью индукции синтеза ими факторов роста. Перенос ней-ротрофических факторов клонами НСК в ткани зрелого мозга, встраивание самих клонов в уже существующую цитоархитектонику мозга (рис. 36-3) и продолжительная экспрессия этих факторов в поврежденных структурах головного мозга сулят большие надежды на положительный эффект в лечении таких часто встречающихся заболеваний как тяжелая ЧМТ, болезнь Альцгеймера и болезнь Пар-кинсона [10, 21]. Другими исследованиями было показано, что клетки микроглии и астроглии, а также нейроны, могут возникать из стволовых клеток костного мозга, являющихся нормальными клеточными компонентами костного мозга у взрослых индивидуумов. Доказано, что клетки нервной ткани и клетки крови имеют общую стволовую клетку, которая в зависимости от условий внешней среды способна превращаться в головном мозге в нервные клетки, а в костном мозге — в клетки крови. Миграция и дифференцировка клеток костномозгового происхождения после их внутривенной, интратекальной или интрапаренхиматозной имплантации (рис. 36-4 и рис. 36-5) в ткани головного мозга свидетельствуют о реальной возможности использования их при заболеваниях ЦНС [1, 9, 17, 32]. Трансплантация эмбриональной нервной ткани в головной мозг пациента, наряду со множеством положительных эффектов, имеет также и недостатки, заключающиеся в необходимости исследова-  Рис. 36-3. Выживание и интеграция трансплантированных НСК. Модифицированные с помощью ретронирусного вектора НСК крыс, секретирующие NGF, трансплантировались ннтрапарен-химатозно в медиальную септальную область и nucleus basalis magnocellularis. Снимки в темном поле (А и В) — ауторадиог-раммы РН]тимидин-меченьиЫСР-сскретирующихНСК.. Клетки мигрировали из места имплантации и интегрировались в окружающую паренхиму мозга (ic-внутренняя капсула, gp-блед-ный шар, ас-передняя спайка; верхушка стрелки на снимке В указывает среднюю линию). (С) В светлом поле срез медиальной септальной области, окрашенный по Нисслю, демонстрирующий пересаженные клетки (покрыты серебряными гранулами, указаны стрелками) среди нейронов реципиента (верхушки стрелок). (По Martinez-Serrano A. and Bjorklund A.,1998). ния донорской эмбриональной нервной ткани на носительство ВИЧ, других вирусов и белков-при-онов, не говоря об этических аспектах такой трансплантации. Уже сегодня можно предполагать, что пересадка в нервную систему стволовых клеток костного мозга, взятых непосредственно у больного с тяжелой 606 ^   Рис. 36-4. Красными точками указано распределение стволовых клеток костного мозга, меченых 5-бромо-2-дезоксиуридином (BrdUrd), в головном мозге мышей через 12 дней после инъекции их в боковой желудочек (по Kopcn G.C. et al., 1999). ЧМТ, может способствовать стимуляции процесса восстановления структуры, а затем и функций ЦНС. С помощью аутотранеллантации клеток костного мозга в головной мозг можно будет избежать недостатков, присущих трансплантации донорской эмбриональной нервной ткани. В последнее время появились сообщения о возможности выделения и последующего использования в терапии заболеваний ЦНС стволовых клеток кожи и подкожного жира. Это позволяет избежать такой болезненной процедуры как пункция костного мозга и, в случае применения стволовых клеток подкожной жировой клетчатки, получать значительно большее их количество.  Рис. 36-5. Иммуногистохимическая локализация BrdUrd-мече-ных (см. текст к рис.5) стволовых клеток костного мозга в переднем мозге. Гематоксилин-эозиновые (А) и иммуногистохи-мические анти- BrdUrd (В) срезы полосатого тела и бокового желудочка на стороне внутрижелудочковой инъекции. Значительное число донорских клеток обнаруживается в полосатом теле, распространяясь от передней спайки до коры поясной извилины. (С) Микрофотография более латерального участка среза В демонстрирует распространение BrdUrd-меченых стволовых клеток в наружной капсуле вдоль путей белого вещества (СС-мозолистое тело, St-полосатое тело, ЕС-наружная капсула). (D) Длинной стрелкой указан астроцит в молекулярном слое коры гиппокампа, происходящий из стволовой клетки костного мозга. Клетка помечена антителами к BrdUrd и антителами к GFAP (глиальный фибриллярный кислый протеин-маркер астроглии). Короткими стрелками указаны ядра, меченные BrdUrd, верхушками стрелок - BrdUrd-негативные ядра (по Kopen G.C. etal.,1999). ^ Несмотря на огромный интерес к изучению возможностей генной терапии при различной патологии ЦНС, работы по применению данного метода при черепно-мозговых повреждениях немногочисленны. Использование аденовирусного вектора для 607 ^ экспрессии нейротрофинов, в частности NGF, в мозге крыс продемонстрировало потенциальную возможность этой методики предупредить утрату хо-линергических нейронов переднего мозга и развитие дефицита познавательной деятельности [48]. Однако, в связи с наличием значительных иммунных и воспалительных реакций на попадание в организм аденовируса, что ограничивает уровень трансфек-ции, авторы предлагают применение нового поколения аденовирусных векторов. Этот вектор характеризуется делецией большей части вирусного генома, что позволяет избежать экспрессии вирусных протеинов. Эксперименты продемонстрировали в данном случае более высокую эффективность транс-фекции по сравнению с обычными аденовирусами, меньшую токсичность и большую продолжительность экспресии трансгенов при лечении ЧМТ.Инъекция лентивирусного вектора, несущего ДНК, которая кодировала синтез glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), в ядро лицевого нерва мышей предупреждала гибель мотонейронов этого ядра, наблюдающуюся при перерезке лицевого нерва. В то время как в контроле аксото-мия приводила к прогрессирующей и стойкой утрате и/или атрофии более чем 50% лицевых мотонейронов, использование описанного метода способствовало сохранению 95% данных клеток [14]. Изучение терапевтического эффекта катионных липосом при ЧМТ показало, что внутрижелудоч-ковое введение диметиламиноэтан-карбамил-холе-стероловых (DC-Choi) липосом, несущих ДНК, кодирующую синтез NGF, приводило к 9—12-кратному увеличению уровня NGF в цереброспинальной жидкости крыс. Данный метод продемонстрировал эффективную возможность уменьшать утрату холинергических нейронов при ЧМТ [50]. Те же авторы указывают, что в экспериментах in vitro трансфекция септо—гиппокампальных нейронов в культуре при помощи комплексов DC-Chol-липо-сомы/ NGF-ДНК обеспечивала увеличение концентрации тРНК, кодирующей синтез NGF, в культуре в 1-й день после трансфекции, а секрецию культивируемыми клетками активного растворимого NGF в среду — начиная со 2-го дня. Отмечается, что катионные липосомы малотоксичны и обеспечивают непродолжительную экспрессию трансгенов, дающую возможность добиться полезного терапевтического эффекта на протяжении ограниченного временного промежутка (например, в течение острого периода ЧМТ) [47,48]. В 1990 году F.H. Gage и соавторы fill предложили новый способ лечения ЧМТ, а именно трансплантацию генетически модифицированных кле- ток, которая представляет собой комбинацию двух различных подходов. Во-первых, нейротрансплан-тации с целью замещения клеток, погибших в результате травмы. Во-вторых, генной терапии, которой подвергаются пересаживаемые клетки непосредственно перед имплантацией в травмированную ЦНС. Авторы показали, что фибробласты, подвергшиеся трасфекции ретровирусным вектором с целью индукции синтеза NGF, после пересадки в мозг крыс с экспериментальной ЧМТ предотвращали дегенерацию холинергических нейронов, погибающих в результате травмы без соответствующего лечения. Трансплантаты, продуцирующие фактор роста нервов (NGF), продемонстрировали способность уменьшать дефицит поведенческих реакций у крыс с повреждениями в области nucleus basalis magnocellularis [6]. После имплантации в мозг стареющих крыс генетически модифицированных NGF-продуцирующих фибробластов наблюдалось значительное снижение нарушений памяти и увеличение размеров и числа нейронов в базальных отделах переднего мозга [4]. Генная терапия ex vivo, направленная на усиление синтеза NGF, также способствовала выживанию септальных нейронов после аксотомии и регенерации их аксонов в мозге крыс [15]. Имплантация фибробластов, модифицированных генетически с целью экспрессии BDGF, способствовала продукции соответствующей тРНК в мозге крыс, которая продолжалась как минимум 2 недели [23]. Существует ряд работ, свидетельствующих об эффективности трансплантации нейротрофин-продуцирующих клеток при экспериментальной позвоночно-спинномозговой травме, в которых делается вывод о возможном будущем клиническом использовании метода, однако анализ этих исследований не является предметом настоящей работы. В 2000 году Watts et al. [45] указывали, что в настоящее время отсутствуют клинические исследования по клеточной трансплантации при ЧМТ. В то же время разработанные методики для лечения болезней Паркинсона и Гентингтона базируются на принципах, которые приложимы к терапии ЧМТ, и могут облегчить разработку клинических способов восстановления нервной ткани при травме ЦНС. 36.5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Понимание молекулярных механизмов репарации нервной ткани при травме, определение роли нейротрофинов в репарации, роли стволовых нервных клеток в замещении погибших нейронов взрослой 608 ^ ЦНС, исследование естественной регуляции этих процессов и возможностей влияния на нее могут привести к предложению новых методов терапии, эффективность которой очень часто остается недостаточно высокой. Все вышеуказанное делает особо актуальным изучение возможностей генной терапии при ЧМТ с целью улучшения исходов травмы и снижения уровня летальности у потерпевших.Литература I. Azizi S.A., Stokes D,, Augelli BJ. et al. Engraftment and migration of human bone marrow stromal cells in the brains of albino rats — similarities to astrocyte grafts // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1998. - V. 95. - P. 3908-3913. 2.Baum L., Chen L., Ng HK., Pang C.P.Apolipoprotein E isoforms in Alzheimer's disease pathology and etiology // Microsc. Res. Tech. — 2000. - V. 50. - No. 15. - P. 278-281.
10. Fisher L.J. Neural precursor cells: application for the study and repair of the central nervous system // Neirobiol. Dis. — 1997. -V. 4.-P. 1-22. II. Gage F.H., Rosenberg M.В., Tuszynski M.H. etal. Gene therapy in the CNS: intracerebral grafting of genetically modified cells// Prog Brain Res. - 1990. - V. 86. - P. 205-217. 12. Griffin W.S.T., Sheng J.G., Gentleman S.M. et al. Microglial interleukin 1—? expression following head injury: Correlations with neuronal and neuritic/3-amyloid precursor protein expression // Neurosci. Lett. — 1994. — V. 176. — P. 133-136. 13.GrittiA., Parati E.A., CovaL.et al Multi potential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self—renew in response to basic fibroblast growth factor // J.Neurosci. — 1996.-V. 16.-P. 1091-1100. 14. Hottinger A.F., Azzouz M., Deglon N., Acbischer P., Zurn A.D. Complete and long-term rescue of lesioned adult motoneurons bylentiviral-mediated expression of giial cell line-derived neurotrophic factor inthe facial nucleus // J.Neurosci. - 2000. -V. 20. - P. 5587-5593. 15. Kawaja M.D., Rosenberg M.B., Yohida K., Gage F.H. Somatic gene transfer of nerve growth factors promotes the survival axotomized septal neurons and the regeneration of their axons in adult rats //J. Neurosci. —1992. — V. 12. — P. 2849-2864.
- 1997.-V. 3.-Article 5.
- P. 3-33.
30. Nicoll J.A.R., Roberts G.W., Graham D.I. Apolipoprotein E epsilon 4 allele is associated with deposition of amyloid beta—protein following head injury // Nat. Med. -1995. -V.I. — P. 135—137.
609 Клиническое руководство по черепно-мозговой травме
38. Snyder E.Y., Deitcher D.L., Walsh C. el al. Multipotent cell lines can engraft and participate in the development of mouse cerebellum // Cell. — 1992. — V. 68. — P. 1-20.
- 1995.-V. 10.-P. 151-167.
- 2000. - V. 16. — No. 3,4. - P. 245.
610 |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям