Практикум по курсу «Биохимия» для студентов специальностей 260204 «Технология бродильных производств и виноделие» и240901 «Биотехнология» Бийск
|
|
Скачать 0.82 Mb.
|
ВВЕДЕНИЕПрактикум является частью учебно-методического комплекса по курсу «Биохимия». Лабораторные методы исследований биомолекул изложены с учетом новых достижений современной биохимии. Цель настоящего практикума – закрепление теоретических знаний путем формирования практических навыков в области статистической, динамической и функциональной биохимии. При выполнении лабораторных работ студент приобретает основные экспериментальные навыки – качественного и количественного определения продуктов биосинтеза живой клетки, активности ферментов, получения ферментных препаратов, фракционирования клеточного содержимого. В практикум вошли основные методы по определению общего количества сахаров, белков, липидов, витаминов, определения активности ферментов, биохимические методы исследования растений, микроорганизмов, дрожжей. Лабораторные работы содержат изложение принципа методов с указанием структурных формул и реакций взаимодействующих веществ, перечень основных материалов, реактивов и оборудования, подробное описание хода работы и ожидаемых результатов. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
сякая несущая заряд частица – ион, или полярная молекула, в растворе окружена сольватной оболочкой из молекул растворителя.
,
составляет 1×10-4, то концентрация ионов ОН соответственно 
= 1×10-10. Их произведение всегда составляет 1×10-14 г-ион/л.
.
;
.
.
.
и водородный показатель
.Раствор |
Значение рН |
1Н NaOH |
14,0 |
Отбеливатель |
13,0 |
Нашатырный спирт |
12,0 |
Сода питьевая |
9,0 |
Морская вода |
8,0 |
Молоко |
6,5–7,0 |
Черный кофе |
5,0 |
Пиво |
4,5 |
Томатный сок, красное вино |
3,5–4,0 |
Кока-кола |
3,0 |
Уксус пищевой |
3,0 |
Лимонный сок |
2,0 |
Желудочный сок |
1,0–1,5 |
1Н НСl |
0,0 |
На практике определение рН осуществляют различными методами. Это электрометрический метод, колориметрический (буферный и безбуферный), определение рН с помощью различных индикаторов.
^
Постоянство внутренней среды и поддержание рН организма обеспечивается совместным действием ряда физико-химических и физиологических систем, из которых основная роль принадлежит буферным системам. Буферными системами (буферами) называют растворы, обладающие свойством достаточно стойко сохранять постоянство концентрации водородных ионов как при добавлении кислот и щелочей, так и при разведении буферных растворов. Буферные системы по составу подразделяются на три вида:
а) состоят из слабой кислоты и ее соли, образованной сильным основанием;
б) состоят из слабого основания и его соли, образованной сильной кислотой;
в) состоят из двух солей (кислой и основной).
На практике чаще всего используют следующие буферные смеси:
СН3СООН + СН3СООNa – ацетатный буфер;
H2CO3 + NaHCO3 – бикарбонатный буфер;
NH4OH + NH4Cl – аммиачный буфер;
NaH2PO4 + Na2HPO4 – фосфатный буфер.
^
Каждая буферная система характеризуется определенной концентрацией водородных ионов, которую она стремится сохранить при добавлении кислых или щелочных продуктов.
Рассмотрим, что определяет рН ацетатной буферной системы. Ацетатный буфер представляет собой смесь из слабой уксусной кислоты и ее натриевой соли.
Константа диссоциации уксусной кислоты выражается следующим образом:
,отсюда
При добавлении к слабодиссоциирующей уксусной кислоте ее сильно диссоциированной соли СН3СООNа произойдет резкое увеличение концентрации СН3СОО-. Это, в свою очередь, вызовет смещение равновесия влево, т.е. приведет к увеличению кислотности, и слабая диссоциация уксусной кислоты будет подавлена. При этом концентрация недиссоциированной уксусной кислоты будет практически равна общей концентрации кислоты. Так как соль диссоциирует полностью, можно принять концентрацию анионов СН3СОО- (без учета их количества, образующегося при диссоциации кислоты) равной общей концентрации соли в буферном растворе. Исходя из этого, уравнение можно представить в следующем виде:
Следовательно, рН буферных систем зависит от константы диссоциации кислоты или основания и от соотношения концентраций компонентов буферных смесей. При одинаковых соотношениях компонентов у ацетатной, фосфатной или аммиачной буферных смесей значения рН будут различными, в зависимости от разной величины констант диссоциации кислот и оснований. Константы диссоциации некоторых кислот и оснований представлены в таблице 2.
Таблица 2 – Константы диссоциации слабых кислот и оснований
Вещество |
К |
Муравьиная кислота НСООН |
2,00×10-4 |
Уксусная кислота СН3СООН |
1,85×10-5 |
Фосфорная кислота Н3РО4 |
1,00×10-7 |
Угольная кислота Н2СО3 |
3,30×10-7 |
Гидроокись аммония NH4OH |
1,87×10-5 |
Таким образом, для приготовления буферных смесей с необходимым значением рН следует использовать кислоты или основания с соответствующими константами диссоциации, а также подбирать определенные соотношения компонентов. При одинаковых соотношениях компонентов (например, 9:1) у ацетатной, бикарбонатной или фосфатной буферных смесей значение рН будет различно, т.к. зависит и от константы диссоциации.
Таблица 3 – Значения водородных показателей буферных систем
в зависимости от соотношения компонентов
Соотношение «кислота:соль» или «основание:соль» |
Ацетатная |
Фосфатная |
Аммиачная |
9:1 |
3,72 |
5,91 |
10,28 |
8:2 |
4,05 |
6,24 |
9,95 |
7:3 |
4,27 |
6,47 |
9,73 |
6:4 |
4,45 |
6,64 |
9,55 |
5:5 |
4,63 |
6,81 |
9,37 |
4:6 |
4,80 |
6,98 |
9,20 |
3:7 |
4,99 |
7,17 |
9,01 |
2:8 |
5,23 |
7,38 |
8,77 |
1:9 |
5,57 |
7,73 |
8,43 |
При разбавлении буферных систем даже в значительной степени рН не меняется. В незабуференном растворе, например, сильной кислоты, при разведении концентрация водородных ионов уменьшается. При разведении кислоты в 10 раз концентрация ионов Н+ уменьшится во столько же раз: 0,1н раствор НСl имеет концентрацию 10-2 (рН = 2), при разведении в 100 раз концентрация Н+ становится 10-4, т.е. рН = 4. В буферных же смесях значение рН зависит от соотношения компонентов буфера. При разведении буферных смесей в тех же пропорциях соотношение их компонентов остается прежним, поэтому значение рН не изменяется. Рассмотрим этот процесс на примере:
и т.д.^
При добавлении кислот и щелочей к буферным системам происходит обезвреживание этих кислот и щелочей. Рассмотрим этот процесс на примере ацетатного буфера:
При добавлении кислоты к ацетатному буферу происходит взаимодействие кислоты с солью
Как видно из уравнения, сильная кислота (НСl) заменяется эквивалентным количеством слабой кислоты (СН3СООН). Повышение концентрации кислоты снижает степень ее диссоциации (по закону разведения Оствальда). В результате концентрация ионов Н+ в растворе остается практически на прежнем уровне.
При добавлении щелочи:
Таким образом, сильная щелочь заменяется эквивалентным количеством слабодиссоциированной соли. Анионы СН3СОО-, образующиеся при диссоциации этой соли, будут оказывать угнетающее воздействие на диссоциацию уксусной кислоты. Поэтому при добавлении кислот и щелочей соотношение компонентов буферной смеси несколько изменяется.
При добавлении небольших количеств кислоты и щелочи они мало влияют на изменение значения рН, однако дальнейшее добавление этих веществ значительно сдвигает рН. Подобным образом работают и другие буферные системы. Следовательно, способность буферных систем стойко удерживать рН на определенном уровне ограничена.
Способность буферной системы противодействовать смещению рН среды определяется ее буферной емкостью.
Буферная емкость определяется свойством буфера и выражается в количестве г-экв сильной кислоты или основания, которое следует добавить на один литр буферного раствора, чтобы сместить рН на одну единицу.
,где В – буферная емкость;
С – количество кислоты, г-экв;
рН0 – водородный показатель до добавления кислоты;
рН1 – водородный показатель после добавления кислоты.
Наибольшей буферной емкостью обладают концентрированные буферные растворы и те буферы, которые состоят из равного количества компонентов, т.е. соотношение кислота/соль равно единице.
^
Буферные системы крови обеспечивают постоянство внутренней среды живых организмов. В процессе метаболизма в организме постоянно образуются как кислые продукты (органические кислоты, кислые соли, продукты брожения и др.), так и щелочные соединения (аммиак, кератин, основные аминокислоты и др.) В организме человека образуется от 20 до 30 л кислот в сутки. Однако, рН крови поддерживается на постоянном уровне, колеблясь в ту или другую сторону на 0,05…0,07 единиц. У разных животных рН крови несколько различается.
^
Кислотно-основные индикаторы – сложные органические соединения, которые в растворах меняют окраску в зависимости от реакции среды, т.е. от значения рН. Окраска индикаторов обусловлена наличием в их молекуле хромофорных групп (азогруппы, хиноидные группы и др.). Индикаторы представляют собой слабые кислоты или слабые основания, которые могут находиться в растворах в диссоциированном или недиссоциированном состоянии. При этом молекулы окрашены в один цвет, а ионы – в другой. Поскольку степень диссоциации зависит от реакции среды, то при различных значениях рН в растворах будет находиться различное количество молекул и ионов, и от их соотношения будет зависеть окраска раствора. Индикаторы, имеющие различную окраску в кислых и щелочных средах, называют двухцветными (метиловый красный, лакмус, диметиламиноазобензол и др.). Индикаторы, имеющие только одну окраску, называют одноцветными (фенолфталеин, нитрофенолы и др.).
Универсальная индикаторная бумага содержит полоски фильтровальной бумаги, пропитанные универсальным индикатором (по Богену), в состав которого входят: фенолфталеин 0,2 г, метиловый красный 0,4 г, диметиламиноазобензол 0,6 г и бромтимоловый синий 1,0 г. Смесь индикаторов растворяют в спирте и добавляют едкий натр до появления желтой окраски. Изменения окраски универсального индикатора в зависимости от рН среды следующие: при рН = 2 – красный, при рН = 4 – оранжевый, при рН = 6 – желтый, при рН = 8 – зеленый, при рН = 10 – синий.
Таблица 4 – Окраска индикаторов при различных значениях рН
Индикаторы |
Кислая среда |
Щелочная среда |
||||||||||||
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
13 |
14 |
|
Диметиламино-азобензол |
Красная |
Желтая |
||||||||||||
Метиловый оранжевый |
Красная |
Желтая |
||||||||||||
Метиловый красный |
Красная |
Желтая |
||||||||||||
Лакмус |
Красная |
Синяя |
||||||||||||
Бромтимоловый синий |
Желтая |
Синяя |
||||||||||||
Фенолфталеин |
Бесцветная |
Ярко-розовая |
||||||||||||
Ализариновый желтый |
Желтая |
Фиоле-товая |
||||||||||||
^
Определение рН растворов основано на установлении потенциала электрода, погруженного в раствор. Величина электрического потенциала ех зависит от рН раствора. Значение ех определяют по величине э.д.с. цепи, составленной из электрода определения (измерительный электрод) и электрода сравнения с известным потенциалом (сравнительный электрод). Электродом сравнения с известным значением э.д.с. обычно выступает хлорсеребряный (или каломельный) электрод.
Э.д.с. цепи измеряют компенсационным методом, т.е. сравнением с постоянной э.д.с. сравнительного электрода, которая составляет 1,0183 В при температуре 20 С. Определение производится с помощью приборов – универсальных иономеров (рН-метров). Такое определение рН очень удобно, имеет высокую степень точности, занимает мало времени. Особенно удобен такой метод определения при исследовании биологических жидкостей, а также окрашенных и мутных растворов. Точность измерения рН таким методом составляет 0,001 единиц рН.
^ фосфатный, ацетатный, трисглициновый буферы; вытяжки из растений.
Оборудование: универсальный иономер (рН-метр), стеклянные палочки, пробирки, колбы конические (объем 50 мл), воронки, ступки, фильтровальная бумага, пипетки, капельницы, бюретки, штатив для пробирок.
^ в подписанные соответственно стаканчики налить предложенные буферные растворы и измерить их рН с помощью иономера. Записать результат в таблицу. Таким же образом измерить рН неизвестных растворов – 1, 2, 3. Результаты оформить в табличной форме. Между измерениями обязательно промывать электроды дистиллированной водой (электроды поместить в стаканчик с водой) и промокнуть фильтровальной бумагой.
^
Производится с помощью универсальной индикаторной бумаги и красителей – индикаторов.
^ универсальная индикаторная бумага (полоски); фосфатный, ацетатный, трис-глициновый буферы; растительные вытяжки.
Оборудование: стеклянные палочки, пробирки, колбы конические (объем 50 мл), воронки, ступки, фильтровальная бумага, пипетки, капельницы, штатив для пробирок.
^ положить на фильтровальную бумагу полоски универсальной индикаторной бумаги, нанести на полоски стеклянной палочкой несколько капель буферных растворов с известным рН. Сравнить со шкалой. Затем определить тем же способом рН неизвестных растворов в колбах 1, 2, 3. Результаты опыта оформить в форме таблицы, приведенной ниже.
Результаты работы:
Номер раствора |
рН известных растворов |
рН раствора, измеренный с помощью иономера |
рН раствора, измеренный с помощью индикаторной бумаги |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям