Практикум по курсу «Биохимия» для студентов специальностей 260204 «Технология бродильных производств и виноделие» и240901 «Биотехнология» Бийск
|
|
Скачать 0.82 Mb.
|
4 ФЕРМЕНТЫФерменты являются белковыми катализаторами биохимических реакций, большая часть которых в отсутствие фермента протекала бы крайне медленно. В отличие от химических катализаторов каждый фермент способен катализировать лишь очень небольшое число реакций, часто только одну. Таким образом, ферменты это реакционно-специфические катализаторы. Практически все биохимические реакции катализируются ферментами. Многие ферменты оказывают каталитическое действие на субстраты только в присутствии специфического термостабильного низкомолекулярного органического соединения – кофермента. В таких случаях холофермент (каталитически активный комплекс) состоит из апофермента (белковая часть) и связанного с ним кофермента (Приложение Н). Кофермент может быть связанным с апоферментом ковалентными и нековалентными связями. Термин «простетическая группа» относится к ковалентно связанному коферменту. К числу реакций, требующих присутствия кофермента, относятся: окислительно-восстановительные, переноса групп, изомеризации, а также реакции конденсации (по системе IUB это классы 1, 2, 5, 6). Реакции расщепления протекают в отсутствие коферментов (по системе IUB это классы 3 и 4). ^ Метод Вольгемута основан на определении минимального количества фермента, способного при определенных условиях полностью гидролизовать 1 мл 0,1 %-ного раствора крахмала. Амилазная активность солода выражается количеством миллилитров 0,1 %-ного раствора крахмала, которое может быть гидролизовано 1 мл вытяжки из солода при температуре 38 °С в течение 30 мин. В норме амилазная активность равна от 160 до 320 единиц активности. Метод Вольгемута широко используется в клинической практике для определения амилазной активности крови и мочи, в пивоварении – для определения амилазной активности солода. Резкое повышение амилазной активности в крови и моче (в 10–30 раз) наблюдается при острых панкреатитах, опухолях поджелудочной железы. ^ вытяжка из солода зерновых, разбавленная в 10 раз; 0,1 %-ный раствор крахмала; 0,1 %-ный раствор йода в 0,2 %-ном растворе иодида калия. Оборудование: штатив с пробирками, пипетки, капельницы, термостат. ^ В десять пробирок наливают по 1 мл дистиллированной воды. В первую пробирку прибавляют 1 мл разведенной в 10 раз вытяжки, перемешивают, 1 мл смеси переносят во вторую пробирку. Содержимое этой пробирки снова перемешивают и 1 мл переносят в третью пробирку и так до десятой пробирки. Из последней пробирки отбирают 1 мл и выливают. Таким образом, в каждой последующей пробирке содержание фермента в два раза меньше, чем в предыдущей. Разведение вытяжки в десяти пробирках составит: 1:10; 1:20; 1:40; 1:80; 1:160; 1:320; 1:640; 1:1280; 1:2560; 1:5120; 1:10240. Далее во все пробирки прибавляют по 1 мл воды и по 2 мл раствора крахмала, перемешивают и помещают в термостат при температуре 38 °С на 30 мин. После инкубации пробирки охлаждают водопроводной водой для прекращения действия фермента, добавляют по две капли раствора йода, хорошо взбалтывают и наблюдают за изменением окраски. При реакции с йодом жидкость окрашивается в желтый, розовый и фиолетовый цвет. Отметив, при каком разведении произошел полный гидролиз крахмала с минимальным содержанием фермента (пробирка с желтоватой окраской содержимого), по количеству неразведенной вытяжки (А) в данной пробирке рассчитывают амилазную активность вытяжки (А мл вытяжки расщепляет Х мл 0,1 %-ного раствора крахмала). Например, желтый цвет появился в четвертой пробирке, где вытяжка разведена в 160 раз. Это количество вытяжки способно гидролизовать 2 мл 0,1 %-ного раствора крахмала, а 1 мл неразведенной вытяжки в тех же условиях гидролизует 320 мл: Х = 2×160/1. Следовательно, амилазная активность равна 320. ^ Метод основан на определении количества пероксида водорода, оставшегося после действия на него каталазы, титрованием на него раствора KMnO4. Реакция протекает по уравнению  1 мл 0,1 моль/л раствора перманганата калия соответствует 85 мг пероксида водорода. ^ препарат каталазы (1 г проростков солода ячменного растирают в фарфоровой ступке с 6 мл фосфатного буфера и фильтруют); 10 %-ный раствор H2SO4; 0,1 %-ный раствор пероксида водорода на фосфатном буфере, pH=7,0 (35,0 мл 0,2 моль/л NaH2PO4 в 13,6 мл 0,2 моль/л NaH2PO4); 0,1 моль/л раствор KMnO4. Оборудование: колбы емкостью 100 мл, пипетки, бюретки, термостат. ^ В две колбы вносят по 2 мл препарата каталазы, в одну из них (проба) прибавляют 1 мл 10%-ного раствора H2SO4, затем наливают по 2 мл раствора пероксида водорода в каждую колбу, ставят в термостат на 40 мин при температуре 38 °С. По истечении времени инкубации во вторую колбу (контроль) прибавляют 1 мл 10 %-ного раствора H2SO4 и оба раствора титруют 0,1 моль/л раствором KMnO4 до появления стойкого розового окрашивания от излишка перманганата калия. Активность каталазы определяют по количеству разложенного пероксида водорода (мл) и рассчитывают по формуле:  ,где  – разность результатов титрования контрольного и исследуемого образцов 0,001 н раствором KMnO4, мл;Q – количество пероксида водорода (85 мг), соответствующее 1 мл 0,1 моль/л раствора KMnO4. ^ Амилолитическая активность, обусловленная в основном наличием в препарате α-амилазы, характеризует способность фермента катализировать гидролиз крахмала до неокрашиваемых йодом продуктов. При наличии в препарате α-амилазы и глюкоамилазы этим методом определяется суммарное действие всех амилолитических ферментов. За единицу амилолитической активности в этом методе принято такое количество фермента, которое катализирует расщепление 1 г растворимого крахмала до продуктов, неокрашиваемых йодом, за 1 час при температуре 30 ºС в строго определенных условиях. Амилолитическую активность АС выражают числом указанных единиц в 1 г препарата, культуры или в 1 см3 раствора. Величина АС показывает, сколько граммов крахмала может быть гидролизовано до неокрашиваемых йодом соединений 1 г препарата, культуры или 1 см3 раствора за 1 ч в условиях определения. Окончание реакции контролируют визуально по йодной пробе. Чувствительность метода определяют минимальным количеством времени, за которое можно визуально уловить изменение окраски йода. Допускают, что скорость ферментативной реакции прямо пропорциональна количеству применяемого фермента и остается постоянной на протяжении от 5 мин до 1 ч, то есть реакция подчиняется закону реакции нулевого порядка. Кроме того, установлено влияние величины рН и химической природы буфера на величину АС. С ацетатным буфером (рН=4,7) величина АС у грибных препаратов в среднем в 1,5 раза выше, чем при определении с фосфатным буфером (рН=6,0). Поэтому, при определении величины АС грибных культур рекомендуется брать ацетатный буфер. Недостатком метода является нечеткость визуального определения окончания реакции. ^ ацетатный буфер с рН=4,7 для ферментов грибного происхождения; фосфатный буфер с рН=6,0 для ферментов бактериального происхождения; 1 %-ный раствор крахмала (раствор крахмала, употребляемый для анализа грибных препаратов, должен иметь рН=4,7, для анализа бактериальных препаратов – 6,0); растворы йода. Для приготовления основного раствора йода в тарированный стаканчик с притертой крышкой отвешивают 4,4 г йодида калия, 1,4 г металлического йода, добавляют около 2 см3 дистиллированной воды. Стаканчик закрывают крышкой, содержимое перемешивают и после растворения йода переводят раствор в мерную колбу объемом 100 см3 с притертой пробкой. Доводят объем дистиллированной водой до метки. Содержимое колбы хранят в темном прохладном месте. Основным раствором йода можно пользоваться в течение 30 дней со дня его приготовления. Рабочий раствор йода готовят из основного раствора. Для этого 20 см3 основного раствора йода наливают в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 4,4 г йодида калия и доводят общий объем раствора до 100 см3. Рабочий раствор йода может быть употреблен в течение шести дней после его приготовления. Оборудование: широкие пробирки, стеклянные палочки, пипетки, стаканы объемом 50 мл, чашки Петри, термостат. ^ Для определения значения АС важно строго соблюдать условия реакции. Для этого предварительно все растворы – субстрат (1 %-ный раствор крахмала), раствор фермента и дистиллированная вода должны быть нагреты до температуры 30 °С. Субстрат в количестве 25 см3 (12,5 мл) помещают в широкую пробирку, в которую вставлена стеклянная палочка. 30 см3 (15 мл) вытяжки и 30 см3 (15 мл) воды наливают в отдельные пробирки, помещают в термостат и выдерживают при температуре 30 ºС в течение 10 минут. Затем в широкую пробирку к раствору крахмала, не вынимая пробирок из термостата, с помощью пипеток добавляют от 1 до 25 см3 исходного ферментного раствора и соответствующее количество воды так, чтобы общий объем реакционной смеси был 50 см3. Если ферментная вытяжка малоактивна, то можно внести только ее в количестве 25 см3, а воду вообще не добавлять. Содержимое пробирки перемешивают палочкой и отмечают время по секундомеру, когда была добавлена вытяжка к раствору крахмала. Через каждые 60 секунд из пробирки, не вынимая ее из термостата, отбирают палочкой каплю пробы. Каплю помещают на белую фарфоровую пластину, соединяют эту каплю с каплей рабочего раствора йода и наблюдают окраску. Реакция расщепления крахмала считается оконченной, когда йод перестает давать изменение окраски при соединении с каплей испытуемого раствора в течение первых 10 секунд. Изменение окраски отчетливо видно на границе соприкосновения двух капель – йода и реакционной смеси. Время, за которое происходит расщепление крахмала до продуктов, не окрашивающихся йодом, должно быть в пределах от 10 до 20 минут. Если время гидролиза менее 10 мин, определение повторяют, беря на гидролиз меньше вытяжки и больше воды. Если гидролиз не заканчивается в течение 20 мин, то анализ также повторяют, беря на определение больше ферментной вытяжки и меньше воды. Количество ферментной вытяжки, которое необходимо брать на повторный анализ, вычисляют с учетом полученного времени гидролиза. Если ферментная вытяжка имеет малую или слишком высокую активность, и количество ферментного раствора от 1 до 25 см3 не обеспечивает длительности гидролиза крахмала в течение 10…20 мин, то для анализа берут не 25 см3 раствора крахмала, а большее или меньшее его количество, например, 10 или 40 см3, внося соответствующую поправку в расчетную формулу (соответственно 0,1 или 0,4 вместо, обычных 0,25). Величину значения амилолитической активности АС (ед./г) рассчитывают по формуле:  где 0,25 – количество крахмала, которое находится в 25 см3 1 %-ного раствора, г; 60 – коэффициент пересчета на 1 ч; n – количество фермента, участвующего в реакции, г или см3 (эта величина определяется с учетом концентрации исходной вытяжки и последующего разведения); t – время, за которое произошло расщепление крахмала до не окрашиваемых йодом продуктов, мин. Пример. Для анализа взята ферментная вытяжка воздушной культуры гриба. Исходный раствор приготовлен из расчета 5 г культуры в 100 см3 забуференной воды. Известно, что данная культура очень активна, поэтому сделано дополнительное разведение исходного раствора: 20 см3 доведено в мерной колбе до 50 см3 дистиллированной водой и оттуда на анализ взято 2 см3, т.е. получена такая последовательность разведения: 5 г → 100 см3 → 20 см3 → 50 см3 → 2 см3. Для гидролиза 0,25 крахмала (25 см3 1 %-ного раствора крахмала) ферментным раствором последнего разведения (2 см3) потребовалось 12 мин. Тогда АС воздушно-сухой культуры (ед./г) составит:  При пересчете ферментативной активности следует учитывать не абсолютно сухое вещество ферментного препарата, а с учетом влажности. Расчет следует производить по формуле:  ,где W – влажность культуры или препарата. ^ Метод основан на определении свободных карбоксильных групп в спиртовых растворах аминокислот и полипептидов. Активность (ПС) выражается количеством миллиграммов аминного азота, которое образуется при гидролизе определенного количества 5 %-ного раствора желатина с величиной рН от 7,3 до 7,5 1 г препарата или 1 см3 ферментного раствора за 1 ч при температуре 40 ºС. За единицу протеолитической активности принимается количество фермента, которое образует 1 мг аминного азота за 1 ч при принятых условиях опыта. ^ 96 %-ный этиловый спирт; 1 %-ный раствор тимолфталеина; 0,1 н раствор NaOH; субстрат – 5 %-ный раствор желатина; вытяжка из анализируемого растения. Приготовление вытяжки для определения протеолитической активности: навеска 0,25 г растительного материала помещается в фарфоровую ступку и растирается в течение 2,5 мин с 2,5 мл фосфатного буфера (рН=7,3), далее масса фильтруется. Приготовление 5 %-ного раствора желатина (субстрат): 5 г желатина предварительно замачивается в стеклянном стаканчике в 15…20 см3 дистиллированной воды в течение 20…30 мин. Набухший белок заливается 20…25 см3 буферного раствора с температурой от 70 до 80 °С и тщательно перемешивается стеклянной палочкой. Растворившаяся часть сливается в мерную колбу объемом 100 см3, к нерастворившейся части добавляется еще 20…25 см3 буферного раствора, и полученный раствор снова переносится в эту же колбу. Охлажденный до 40 °С раствор желатина доводится до метки буферным раствором такой же температуры. Готовый раствор желатина хранится в холодильнике при температуре от 2 до 5 °С и используется для анализа в течение двух суток. Перед анализом раствор желатина нагревается до температуры 40 °С на водяной бане. Оборудование: конические колбы объемом от 200 до 250 мл, мерные колбы объемом 50 мл, стеклянные палочки, пипетки, бюретки, термостат. ^ К 10 см3 5 %-ного раствора желатина с величиной рН от 7,3 до 7,5 приливают 2 см3 испытуемого ферментного раствора и сразу же отбирают 1 см3 реакционной смеси в коническую колбу емкостью от 50 до 100 см3, куда предварительно наливают 20 см3 96 %-ного этилового спирта и 0,2 см3 1 %-ного тимолфталеина. Пробу титруют 0,1 н раствором NaOH до появления голубой окраски. Оставшуюся смесь желатина с ферментным раствором помещают в термостат с температурой 40 ºС для гидролиза. Через 3 ч 1 см3 реакционной смеси отбирают во вторую колбу емкостью от 50 до 100 см3, куда предварительно наливают 20 см3 96 %-ного этилового спирта и 0,2 см3 1 %-ного тимолфталеина. Пробу титруют, как в случае контрольного варианта. Расчет протеолитической активности ПС проводят по формуле:  ,где А – количество аминного азота, накопленного за время опыта из реакционной среды, мл; t – продолжительность протеолиза, ч; Р – коэффициент, учитывающий разведение и пересчет на 1 г препарата или 1 см3 жидкого ферментного раствора. Величину А рассчитывают по формуле:  ,где а – количество 0,1 н раствора NaOH, пошедшее на титрование 1 см3 опытной пробы, см3; ак – то же для контрольной пробы; 1,4 – коэффициент пересчета количества 0,1 н раствора щелочи в миллиграммы азота аминокислот и полипептидов; К – поправка к титру щелочи. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям