Практикум по курсу «Биохимия» для студентов специальностей 260204 «Технология бродильных производств и виноделие» и240901 «Биотехнология» Бийск
|
|
Скачать 0.82 Mb.
|
|
3.5 Лабораторная работа «Диализ солевого раствора белка» Материалы и реактивы Ход работы. 3.6 Лабораторная работа «Определение изоэлектрической точки белков» Материалы и реактивы Ход работы. |
|
^
Метод диализа основан на способности малых по геометрическим размерам молекул (кристаллоидов) диффузно проникать через полупроницаемые мембраны, а макромолекул (коллоидов) – не проникать. Белки являются высокомолекулярными веществами и не диффундируют через полупроницаемые мембраны (например, коллодиевую или целлофановую пленки). Это свойство белков лежит в основе очистки белков от низкомолекулярных органических и молекулярных примесей. ^ целлофановый или коллодиевый мешочки; 1 %-ный раствор яичного белка; 1 %-ный раствор желатина, 10 %-ный раствор азотной кислоты; 1 %-ный раствор нитрата серебра; 10 %-ный раствор гидроксида натрия; 1 %-ный раствор сульфата меди. Оборудование: стеклянные палочки, пробирки, капельницы, пипетки, диализатор (или стеклянный стакан объемом 0,5 л), штатив для пробирок. ^ Вначале с помощью биуретовой реакции определяют, содержит ли исследуемый раствор белок. Для этого к 10 каплям раствора белка добавляют три капли 10 %-ного раствора гидроксида натрия, одну каплю 1 %-ного раствора сульфата меди и полученную смесь тщательно перемешивают. Красно-фиолетовая окраска свидетельствует о наличии в растворе белка. Целлофановый (коллодиевый) мешочек наполняют на 1/3 объема 1 %-ным раствором исследуемого белка. Мешочек помещают в диализатор, заполненный дистиллированной водой (или в стеклянный стакан с водой), зажимая у верхнего края двумя стеклянными палочками, которые скреплены резиновыми колечками. Через 1,5 ч с диализатом (наружная жидкость) и используемой для диализа дистиллированной водой проводят реакцию на обнаружение хлоридов. Готовят две пробирки, в одну из них добавляют 1 мл дистиллированной воды, в другую – 1 мл диализата, затем по одной капле 10 %-ного раствора азотной кислоты и 1 %-ного раствора нитрата серебра. В пробирке, содержащей диализат, наблюдают выпадение белого осадка хлорида серебра, а в пробирке с дистиллированной водой такого осадка нет. Делают вывод о том, что при диализе солевого раствора белка хлориды проникли в диализат через полупроницаемую мембрану. Для проверки содержания белка в первую пробирку добавляют 3 мл диализата, во вторую – 3 мл диализируемой жидкости, а так же по 1 мл 10 %-ного раствора гидроксида натрия и 12 капли 1 %-ного раствора сульфата меди (проводят биуретовую реакцию). Содержимое перемешивают и наблюдают красно-фиолетовый цвет в пробирке, содержащей диализируемую жидкость. Такое окрашивание отсутствует в пробирке с диализатом. Делают вывод о том, что белок не проникает через полупроницаемую мембрану. ^ Определение изоэлектрической точки белков основано на способности белков под действием осадителей, вызывающих дегидратацию белков, при значении pH среды, соответствующем их изоэлектрической точке, легко осаждаться. ^ : 1 %-ные растворы казеина и желатина; 0,01, 0,1 и 1 моль/л растворы уксусной кислоты; 0,1 моль/л раствор ацетата натрия; 96 %-ный этиловый спирт (или 95 %-ный ацетон); дистиллированная вода. Оборудование: стеклянные палочки, пробирки, пипетки, штатив для пробирок. ^ В шесть пробирок помещают соответствующие количества (мл) растворов уксусной кислоты, ацетата натрия, дистиллированной воды и овальбумина (яичного белка) согласно данным таблицы 6. Содержание каждой пробирки перемешивают. Затем во все пробирки медленно по стенке доливают по 2 мл спирта (или ацетона). Через 30 мин определяют изоэлектрическую точку. Она будет соответствовать pH пробирки с максимальной степенью помутнения. Далее провести аналогичный опыт с желатином согласно данным таблицы 7. Таблица 6 – Соотношение компонентов реакционной смеси (мл) для образования значения рН при выявлении изоэлектрической точки овальбумина
Таблица 7 – Соотношение компонентов реакционной смеси (мл) для образования рН при выявлении изоэлектрической точки желатина
Оформить результаты в табличной форме (таблица 8). Таблица 8 – Отчетная таблица экспериментальных данных
|
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям