Практикум по курсу «Биохимия» для студентов специальностей 260204 «Технология бродильных производств и виноделие» и240901 «Биотехнология» Бийск
|
|
Скачать 0.82 Mb.
|
5 ЖИРЫЛипиды – это гетерогенная группа соединений, непосредственно или опосредовано связанных с жирными кислотами. Их общими свойствами являются:
В зависимости от химического состава липиды подразделяют на несколько классов: – простые липиды, включают вещества, молекулы которых состоят только из остатков жирных кислот (или альдегидов) и спиртов; к ним относятся жиры (триглицериды), воски (эфиры жирных кислот и жирных спиртов); – сложные липиды могут присоединять функциональные группировки с образованием фосфолипидов (остатки фосфорной кислоты), сульфолипидов (остатки серной кислоты), гликолипидов (углеводы), липопротеидов (белки) (Приложения Л, М). ^ Числом омыления называется количество миллиграммов едкого калия, необходимое для нейтрализации всех, как свободных, так и входящих в состав триацилглицеролов жирных кислот, содержащихся в 1 г жира. ^ растительное масло, 0,1 %-ный раствор фенолфталеина; раствор HCl (0,5 моль/л); спиртовый раствор KOH (0,5 моль/л). Для приготовления этого реактива растворяют 40 г КОH в 30 мл воды, в зависимости от концентрации спиртового раствора берут соответствующее количество водного раствора КОH и разводят перегнанным в присутствии NаОН (на 100 г спирта 5 г NаОH) спиртом. Спирт с таким соотношением NаОН кипятят с обратным холодильником в течение часа, затем перегоняют. Раствор отстаивают сутки, фильтруют и сохраняют в склянке темного стекла, хорошо закупорив (для защиты от углекислоты воздуха). Оборудование: колбы емкостью 50 мл, обратный холодильник, водяная баня, пипетки, бюретки, капельницы. ^ В одну колбу (исследуемая проба) помещают 0,5 г растительного масла, в другую (контрольная проба) – 0,5 мл воды. В обе колбы доливают по 15 мл спиртового раствора КОН и кипятят с обратным холодильником на водяной бане в течение 50 мин до полного омыления глицеридов и нейтрализации свободных жирных кислот. Затем в обе колбы доливают по 10 капель раствора фенолфталеина и титруют в теплой воде раствором НС1 до исчезновения розовой окраски (до нейтральной реакции). Количество КОН (мг) или число омыления (ЧО), которое пошло на нейтрализацию свободных жирных кислот в 1 г жира, равно:  ,где (В – А) – разность результатов титрования контрольного и опытного образцов раствором соляной кислоты (0,5 моль/л), мл; a – навеска исследуемого жира, г; f – коэффициент поправки на титр раствора НС1 (0,5 моль/л); Q – количество КОН (28,05 мг), эквивалентное 1 мл раствора КОН (0,5 моль/л). ^ Кислотностью жира или кислотным числом называется число миллиграммов едкого калия, необходимое для нейтрализации свободных жирных кислот, содержащихся в 1 г жира. ^ спирт; нейтрализованный по фенолфталеину; раствор КОН (0,1 моль/л); 0,1 %-ный раствор фенолфталеина, жир (подсолнечное масло). Оборудование: колбы емкостью 50 мл, пипетки, бюретки. ^ К 1 г растительного масла добавляют 5 мл спирта, нейтрализованного по фенолфталеину, тщательно перемешивают для максимального растворения свободных жирных кислот и титруют раствором КОН до появления не исчезающей после взбалтывании розовой окраски (окраска не должна исчезать в течение 0,5…1 мин). Количество КОH (мг) или кислотное число (КЧ), которое пошло на титрование свободных жирных кислот в 1 г жира, рассчитывают по формуле:  ,где А – объём раствора КОН (0,1 моль/л), израсходованного на титрование исследуемой пробы; f – коэффициент поправки на титр раствора КОН (0,1 моль/л); Q – количество КОН (5,61 мг), эквивалентное 1 мл раствора КОН (0,1 моль/л). ^ Эфирным числом называется число миллиграммов едкого калия, небходимое для нейтрализации всех жирных кислот, образующихся при омылении триацилглицеролов, содержащихся в 1 г жира. Это число определяют как разницу между числом омыления данного жира и его кислотным числом. ^ Йодным числом называется количество граммов йода, которое прореагировало с 100 г жира. Это число указывает на содержание в жире непредельных жирных кислот. Определение йодного числа основывается на реакции присоединения йода по месту двойной связи, которая протекает по уравнению:  ^ растительное масло; эмерсионное масло; спиртовой раствор йода (0,1моль/л); 1 %-ный раствор крахмала; раствор Na2S2O3 (0,5 моль/л). Оборудование: две конические колбы ёмкостью 50 мл, пипетки, бюретки. ^ В первую колбу помещают навеску жира от 0,1 до 0,2 г (исследуемая проба), во вторую от 0,1 до 0,2 мл воды (контрольная проба), прибавляют по 10 мл спиртового раствора йода и перемешивают. Через 15 мин содержимое колб оттитровывают раствором Na2S2O3 сначала до появления слабо-желтого окрашивания, а потом, прибавив 1 мл раствора крахмала, титруют до исчезновения синего окрашивания. Йодное число вычисляют по формуле:  ,где (В – А) – разность результатов титрования контрольного и опытного образцов в растворе гипосульфита (0,5 моль/л), мл; a – навеска исследуемого жира, г; f – коэффициент поправки на титр раствора Na2S2O3 (0,5 моль/л); Q – количество йода (12,69 мг), эквивалентное 1 мл раствора Na2S2O3 (0,5 моль/л). 6 ВИТАМИНЫВитамины – важнейший класс незаменимых биологически активных веществ. Организм человека и животных не синтезирует витамины или синтезирует их в недостаточном количестве. В отличие от других незаменимых веществ (аминокислоты и жирные кислоты) витамины не являются пластическим материалом или источником энергии и участвуют в обмене веществ преимущественно как коферменты при биокатализе и регуляторы биохимических и физиологических процессов (Приложение Н). ^ Принцип реакции. Витамин В1 в щелочной среде под действием гексоциано-III феррата калия окисляется в тиохром пигмент желтого цвета, который в изобутиловом спирте дает интенсивно синюю флюоресценцию:  ^ тиамин в концентрации 5 мкг в 1 мл; 1 %-ный раствор K3Fe(CN)6; 30 %-ный раствор NaOH; изобутиловый спирт. Оборудование: источник ультрафиолетового излучения (флюороскоп), штатив с пробирками, пипетки. ^ . К 1 мл раствора витамина В1 прибавляют 2 мл смеси (1 мл раствора K3Fe(CN)6 и 1 мл раствора NaOH), тщательно перемешивают и оставляют на три минуты. Затем прибавляют 5 мл изобутилового спирта, энергично и равномерно встряхивают в течение 2 мин. Изобутиловый экстракт тиохрома в ультрафиолетовых лучах имеет интенсивную синюю флюоресценцию. Это очень чувствительная специфическая реакция. ^ Образующийся при добавлении металлического цинка к концентрированной соляной кислоте водород восстанавливает желтый рибофлавин сначала в родофлавин (промежуточное соединение) красного цвета, а затем в бесцветный лейкофлавин: ^ концентрированная HCl; металлический цинк; 0,025 %-ный раствор витамина B2 (эмульсия рибофлавина в воде). Оборудование: пробирки, пипетки. Ход работы. В пробирку приливают 1 мл раствора витамина В2, 0,5 мл концентрированной соляной кислоты и опускают кусочек металлического цинка. Выделяющийся водород реагирует с рибофлавином, восстанавливая его, и жидкость постепенно окрашивается в розовый цвет, а затем обесцвечивается. При взбалтывании обесцвеченного раствора лейкофлавин вновь окисляется кислородом воздуха в рибофлавин. ^ При взаимодействии пиридоксина с раствором хлорида железа жидкость окрашивается в красный цвет вследствие образования комплексной соли типа фенолята железа. ^ водный 1 %-ный раствор витамина В6; 1 %-ный раствор FeCl3. Оборудование: пробирки, пипетки. Ход работы. В пробирке смешивают 1 мл водного раствора пиридоксина и 2 капли раствора хлорида железа. Смесь встряхивают. Наблюдают окрашивание жидкости в красный цвет. ^ Фолиевая кислота хорошо растворима в 0,1 моль/л растворе NaOH. При экстрагировании фолиевой кислоты из дрожжей и ультрафиолетовом облучении наблюдается ее интенсивная голубая флюоресценция. ^ дрожжи пищевые; ледяная уксусная кислота; 0,4 %-ный раствор перманганата калия; 3 %-ный раствор пероксида водорода; 0,1 моль/л и 0,005 моль/л растворы гидроксида натрия; индикаторная бумага; кварцевый песок. Оборудование: центрифуга, флюороскоп, центрифужные пробирки, ступка с пестиком, пипетки. ^ В ступку помещают 10 г дрожжей, прибавляют 10 мл 0,1 моль/л раствора NaOH, 2 г кварцевого песка и растирают в течение 5 мин. Затем центрифугируют в течение 15 мин при скорости 800 об/мин. К 10 каплям надосадочной жидкости приливают 20 капель ледяной уксусной кислоты (pH=3,0) и 10 капель раствора KMnO4 так, чтобы розовая окраска не исчезала в течение 10 мин (при её исчезновении следует прилить ещё несколько капель KMnO4). Через 10 мин избыток перманганата калия удаляют путем добавления 45 капель раствора H2O2 и приливают 0,005 моль/л раствора NaOH (около 5 мл) до pH 4,04,5 (в присутствии индикатора). При ультрафиолетовом облучении фолиевой кислоты в щелочном растворе в флюороскопе наблюдается интенсивная голубая флюоресценция. 6.5 Реакции на аскорбиновую кислоту (витамин С) ^ Аскорбиновая кислота способна легко вступать в окислительно-восстановительные реакции и восстанавливать 2,6-дихлорфенолиндо-фенол, гексоциано-(III)-феррат калия, нитрат серебра, метиленовый синий. При этом окисленные формы 2,6-дихлорфенолиндофенола (синий цвет) и метиленового синего восстанавливаются в бесцветные лейкосоединения, а K3Fe(CN)6 восстанавливается до K4Fe(CN)6, который с ионами валентного железа дает соль Fe[Fe(CN)6]3 синего или зеленого цвета. Реакция восстановления метиленового синего происходит по уравнению:  ^ 0,1 %-ный раствор 2,6-дихлорфенол-индофенола; 10 %-ный раствор аскорбиновой кислоты; 0,01 %-ный раствор метиленового синего; 10 %-ный раствор Na2CO3; 1 %-ный раствор K3Fe(CN)6; 1 %-ный раствор FeCl3. Оборудование: штатив с пробирками, капельницы, пипетки, термостат. ^ Для проведения реакции с 2,6-дихлорфенолиндофе-нолом в пробирку вносят 0,5 мл раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, 12 капли раствора HCl и каплями раствор аскорбиновой кислоты. Раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола обесцвечивается. Для проведения реакции с метиленовым синим в две пробирки вносят по одной капле раствора метиленовой сини и по одной капле раствора бикарбоната натрия. В первую вливают пять капель раствора аскорбиновой кислоты, во вторую – пять капель воды и ставят обе пробирки в термостат при температуре от 37 до 40 °С. Через некоторое время в пробирке с раствором аскорбиновой кислоты жидкость обесцвечивается. Для реакции с гексациано-(III)-ферратом калия к 1 мл раствора аскорбиновой кислоты прибавляют 1 мл раствора K3Fe(CN)6 и 0,5 мл раствора FeCl3. Наблюдают образование сине-зеленого окрашивания. ^ Метод количественного определения аскорбиновой кислоты основан на ее способности окисляться 2,6-дихлорфенолиндофенолом до дегидроаскорбиновой кислоты. По количеству 2,6-дихлорфенол-индофенола, затраченного на титрование, определяют количество аскорбиновой кислоты в исследуемом материале. Как только все количество витамина С окислится, титруемый раствор приобретает розовую окраску за счет образования недиссоциированных молекул 2,6-дихлор-фенолиндофенола (в кислой среде). В щелочной среде 2,6-дихлор-фенолиндофенол имеет синюю окраску, в кислой – красную, а при восстановлении обесцвечивается:  ^ соляная кислота (2 %-ный раствор); натриевая соль 2,6-дихлорфенолиндофенола 0,0005 моль/л раствор (молекулярная масса – 290, грамм-эквивалент – 145). Оборудование: растительные продукты (капуста, хвоя, картофель, шиповник), фарфоровая ступка с пестиком, коническая колба, микробюретка, стаканы для титрования, пипетки, воронки, весы с разновесами, стеклянный песок. ^ Взвешивают 1 г растительного продукта, тщательно растирают в фарфоровой ступке со стеклянным песком. К растертой массе прибавляют 9 мл раствора соляной кислоты и отстаивают. Через 10 мин содержимое перемешивают и фильтруют. Для количественного определения берут 3 мл фильтрата, помещают в коническую колбу и титруют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола до появления розовой окраски, сохраняющейся в течение 30 секунд; 1 мл 0,0005 моль/л раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола соответствует 0,088 мг аскорбиновой кислоты. Массовую концентрацию аскорбиновой кислоты (мг) рассчитывают по формуле  ,где Q – количество аскорбиновой кислоты (0,088 мг), соответствующее 1 мл 0,0005 моль/л раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола; А – количество 0,0005 моль/л раствора 2,6-дихлорфенолиндо-фенола, затраченного на титрование, мл; V0 – общее количество экстракта, мл; V1 – объем экстракта, взятый для титрования, мл; а – количество пищевого продукта, мг. ^ Нуклеиновые кислоты – это макромолекулы кислотного характера, содержащиеся в ядре, а так же в митохондриях, хлоропластах и цитоплазме, состоят из нуклеотидов. В живых организмах присутствуют два типа нуклеиновых кислот: рибонуклеиновая кислота (РНК) и дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). Их биологическая функция заключается в хранении и передаче наследственной информации живых организмов. Наследственная информация (наследственные признаки) определяет вид, форму, химический состав и функции живой клетки и всего организма в целом. Мономеры нуклеиновых кислот – нуклеотиды, принимают участие во множестве биохимических процессов. Наиболее известна роль пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов в качестве мономеров-предшественников при биосинтезе РНК и ДНК. Помимо этого пуриновые рибонуклеотиды выполняют функции универсальных источников энергии (например, АТФ), входят в состав коферментов (ФАД, НАД, НАДФ). Пиримидиновые нуклеотиды входят в состав макроэргов углеводного обмена (Приложения ПУ). ^ Метод основан на образовании комплексов пуриновых оснований с солями серебра. ^ концентрированный раствор аммиака; 1 %-ный раствор АgNО3; дрожжи (в круглодонную колбу для гидролиза помещают 1 г пекарских дрожжей, доливают 20 мл 10 %-ного раствора серной кислоты и 20 мл дистиллированной воды, колбу закрывают пробкой, в которую вставлена в качестве холодильника стеклянная трубка длиной от 20 до 30 см, кипятят под тягой в течение 1 ч на асбестовой сетке при слабом нагревании, после окончания гидролиза жидкость охлаждают, доводят водой до первоначального объема и фильтруют). Оборудование: колба, пипетки, пробирки, воронки, стеклянная трубка длиной от 25 до 30 см, газовая горелка. ^ К 1 мл гидролизата добавляют концентрированный раствор аммиака до получения щелочной среды (по лакмусу) и 0,5 мл раствора АgNО3. Через 3…5 мин образуется рыхлый осадок серебряных солей пуриновых оснований. ^ Для подтверждения наличия белков в составе нуклеопротеидов проводят биуретовую реакцию. Эта реакция характерна для соединений, содержащих не менее двух пептидных связей. Такие полимеры (белки) в щелочной среде образуют с сульфатом меди окрашенные комплексные соединения, цвет которых зависит от длины полипептидной цепи. Раствор нативного белка дает сине-фиолетовое окрашивание, а продукты его гидролиза (пептиды) – красно-фиолетовое. ^ гидролизат нуклеопротеидов дрожжей; 10 %-ный раствор гидроксида натрия; 1 %-ный раствор сульфата меди. Оборудование: пробирки, пипетки, капельница. Ход работы. В пробирку вносят 0,5 мл гидролизата дрожжей, нейтрализуют (по лакмусу) раствором NaОН, затем добавляют 0,5 мл раствора NаОН и 23 капли раствора СuSО4. Смесь перемешивают и наблюдают появление окраски, что свидетельствует о присутствии в пробе полипептидов, образующихся в результате гидролиза белковой части нуклеопротеидов. ^
4. Лабораторная работа № 4 (4 часа). «Ферменты». Изучение действия ферментов. Свойства ферментов. Определение активности ферментов (каталазы, пероксидазы, амилазы, протеазы) в солоде ржи, проса, ячменя, овса, пшеницы, в молоке, в дрожжевой воде. Влияние рН и температуры на активность ферментов. 5. Лабораторная работа № 5 (4 часа). «^ ». Омыление жира и образование свободных жирных кислот. Определение числа омыления липидов (касторовое масло, подсолнечное масло, сливочное масло). Определение кислотного числа жира. Определение эфирного, йодного, перекисного чисел жира.
7. Лабораторная работа № 7 (4 часа). «^ ». Выделение нуклеопротеидов. Обнаружение углеводов, пуриновых оснований, фосфорной кислоты, белков в составе нуклеопротеидов. 8. Лабораторная работа №8 (4 часа). Защита выполненных лабораторных работ. ЛИТЕРАТУРА
9. Аверьянова, Е.В. Крахмал: методические указания по курсу «Методы переработки растительного сырья» / Е.В. Аверьянова, В.П. Севодин. – Бийск: Изд-во АлтГТУ, 1999. – 33 с. 10. Викторов, Д.П. Малый практикум по физиологии растений / Д.П. Викторов. – М: Высшая школа, 1983. – 120 с. 11. Гильманов, А.П. Методы очистки и изучения ферментов растений / А.П. Гильманов, О.В. Фурсов, А.П. Францев. – Алма-Ата: Наука, 1981. – 84 с. 12. Кошелев, Ю.А. Витамины: методические указания к лабораторному практикуму по курсам «Биохимия», «Пищевая химия» / Ю.А. Кошелев, М.Э. Ламберова. – Бийск: Изд-во АлтГТУ, 2005. – 56 с. 13. Мезенцева, Н.И. Определение активности оксидоредуктаз растений, экстрагируемых различными буферами / Н.И. Мезенцева // И.Л. КазГос ИНТИ ВК ЦНТИ. № 2, 1995. – 4 с. 14. Мезенцева, Н.И. Применение электрофореза белков / Н.И. Мезенцева, С.В. Лаптев, И.В. Рогова // И.Л. КазГос ИНТИ ВК ЦНТИ. № 1, 2000. – 4 с. 15. Мезенцева, Н.И. Биохимия: методические указания к изучению дисциплины и выполнению контрольных работ для студентов всех форм обучения / Н.И. Мезенцева, Е.В. Аверьянова, С.В. Лаптев. – Бийск: Изд-во АлтГТУ, 2006. – 96 с. 16. Пустовалова, Л.М. Практикум по биохимии / Л.М. Пустовалова. – Ростов-н/Д: Феникс, 1999. – 544 с. 17. Рухлядева, А.П. Методы определения активности гидролитических ферментов / А.П. Рухлядева, Г.В. Полыгалина. – М: Легкая и пищевая промышленность, 1981. – 287 с. 18. Савронь, Е.С. Практикум по биохимии животных / Е.С. Савронь, В.И. Воронянский. – М.: Высшая школа, 1967. – 239 с. 19. Северин С.Е. Практикум по биохимии / С.Е. Северин, Г.А. Соловьев. – М: Изд-во МГУ, 1989. – 509 с. 20. Третьяков, Н.Н. Практикум по физиологии растений / Н.Н. Третьяков, Т.В. Карнаухова, Л.А. Паничкин. – М: Агропромиздат, 1990. – 271 с. 21. Филиппович, Ю.Б. Практикум по общей биохимии / Ю.Б. Филиппович, Т.В. Бурова, Г.А. Севастьянова. – М: Изд-во МГУ, 1982. – 78 с. 22. Практикум по биохимии / под редакцией В.П. Комова. – М.: Дрофа, 2004. – 215 с. 24. Сельскохозяйственная биотехнология / под редакцией В.С. Шевелухи. – М.: Высшая школа, 1998. – 415 с. 25. Суханова, Г.А. Биохимия клетки / Г.А. Суханова, В.Ю. Серебров. – Томск: Изд-во ТГУ, 2000. – 184 с. 26. Лаптева, Т.А. Основы физколлоидной химии: учебно-методическое пособие для студентов факультета ветеринарной медицины / Т.А. Лаптева. – Томск: Изд-во ТСХИ, 2006. – 38 с. 27. Коряжнов, В.П., Макаров В.А. Практикум по ветеринарно-санитарной экспертизе молока и молочных продуктов / В.П. Коряжнов, В.А. Макаров. – М.: Колос, 1981. – 170 с. 28. Лаптев, С.В. Лабораторный практикум по ветеринарно-санитарной экспертизе с основами технологии и стандартизации продуктов / С.В. Лаптев, Н.И. Мезенцева. Томск: Изд-во ТСХИ, 2008. 146 с. ^ Классификация моносахаридов  ПРИЛОЖЕНИЕ БДисахариды  ^ Глюконеогенез  ПРИЛОЖЕНИЕ ГСхема потока метаболитов пентозофосфатного пути и их связи с гликолизом  ^ Взаимопревращение питательных веществ  ПРИЛОЖЕНИЕ ЕКлассификация аминокислот, основанная на полярности и заряде R-групп  ^ Элементы вторичной структуры белков: а -спираль; б -слой  ^Некоторые -аминокислоты, не входящие в состав белков, но играющие важную роль в метаболизме  ^ Цикл мочевины (орнитиновый цикл)  ПРИЛОЖЕНИЕ Л-Окисление жирных кислот  ^ Биосинтез жирных кислот  ПРИЛОЖЕНИЕ НКоферменты  Кофермент А      |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям