Учебно-методическое пособие Составители: Д. А. Васильев, А. А. Щербаков, Л. В. Карпунина С. Н. Золотухин удк 619: 616
|
|
Скачать 3.74 Mb.
|
^
Общая характеристикаРод Yersinia организован в 1946 году и назван (по предложению ван Логхема) в честь Александра Иерсена. Ранее бактерии данного рода относили к роду Pasteurella. Сейчас род Yersinia включает микроорганизмы 11 видов (Y. aldovae, Y. bercow, Y. enterocolitica, Y. fredenksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii, Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. rohdei и Y. ruckeri), типовой вид — Y. рestis. С 1954 г бактерии рода Yersinia включены в семейство Enterobacteriaceae. МорфологияНаиболее часто клетки иерсинии имеют овоидную форму (коккобациллы), с повышением температуры культивирования (от 37оС) бактерии имеют чаще форму палочек. Окрашиваются грамотрицательно, возможна биполярная окраска (может служить дифференциальным признаком при исследовании на Y.pestis). Палочки склонны к полиморфизму, образуя в субоптимальных условиях нитевидные, колбовидные или шарообразные (инволюционные) формы (например, на агаре с содержанием поваренной соли). В зависимости от вида (некоторые штаммы Y. ruckeri и вид Y. рestis) и температуры культивирования они могут быть подвижными и неподвижными споронеобразующими палочками (иногда коккобациллами) размерами 1-30,5-0 8 мкм. Бактерии неподвижны при 37°С, но подвижны при выращивании с температурным режимом ниже 30°С (подвижные виды - перитрихи). Некоторые штаммы Y. ruckeri и все изоляты Y. pestis неподвижны (но броуновское движение очень выражено) и имеют капсулу, а остальные виды – капсульное вещество. Для Y. pestis характерны морфологически обособленный нуклеоид, наиболее хорошо видимый у инволюционных гигантских клеток и отсутствие подвижности. Виды Yersinia образуют серовато-слизистые (S-формы) или шероховатые R-колонии, также выделяют переходные формы. Вирулентные штаммы образуют R-колонии. Микроскопическое изучение колоний Y. pestis выявляет колонии двух типов: молодые — микроколонии с неровными краями («битое стекло»), позднее они сливаются, образуя нежные плоские образования с фестончатыми краями («кружевные платочки»), зрелые — крупные с бурым зернистым центром неровными краями («ромашки»). Многие, особенно вирулентные, штаммы Y. pestis способны образовывать темный пигмент, восстанавливать красители (янус зеленый, индиго, метиленовый синий) в реакциях дегидрирования. На скошенном агаре через 48 ч при 28° С образуют серовато-белый налет, врастающий в среду. На бульоне через 48 ч образуют нежную пленку на поверхности и хлопьевидный осадок, при выращивании в аэрированном бульоне дают гомогенный рост, также хорошо растут на желатине, не вызывая ее разжижения. На плотных средах колонии Y. enterocolitica мелкие, блестящие, часто выпуклые с голубоватым оттенком в проходящем свете. При культивировании (48 ч при 37°С) на среде Эндо колонии имеют розоватый оттенок. Полиморфизм колоний выражен слабо. При старении у Y.enterocolitica часто отмечают сливной рост. Бактерии проявляют пектиназную активность, на пектиновом агаре колонии окружены зоной разжижения. При культивировании на жидких средах микроорганизм вызывает их помутнение. Принято считать, что вирулентные штаммы иерсиний образуют преимущественно R-колонии, но для Y.enterocolitica образование шероховатых колоний нехарактерно. Колонии Y.pseudotuberculosis отличают серовато-желтоватый оттенок в проходящем свете и меньшая прозрачность. При культивировании (48 ч при 37°С) на среде Эндо колонии Y. pseudotuberculosis остаются бесцветными. Часто образуют R-формы — выпуклые, бугристые, с фестончатой зоной (или без нее), напоминающие колонии Y. pestis. При старении колонии увеличиваются в размере и теряют прозрачность. На бульоне диссоциированные культуры Y.pseudotuberculosis растут в виде хлопьевидного осадка, оставляя среду прозрачной, а гладкие — вызывают ее равномерное помутнение. Факультативные анаэробы, метаболизм окислительный и бродильный, паразиты человека и животных. Температурный оптимум — 25-28°С; оксидазоотрицательны и каталазоположительны, образование индола варьирует у разных видов, большинство изолятов дает положительную реакцию с метиловым красным и отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра при 37°С, но вариабельную при 25-28°С. Большинство не образует лизиндигидролазу и аргининдекарбоксилазу, но синтезирует орнитиндекарбоксилазу (исключая Y.pestis, Y.pseudotuberculosis и Y.rohdei). He образуют H2S, проявляют уреазную активность (исключая Y. pestis, Y. bercovieri и Y. ruckeri). Хемоорганотрофы; хорошо растут на простых питательных средах, ферментируют большинство углеводов (исключая лактозу) без образования газа, не сбраживают дульцит, эритрит, фукозу, гликоген, инозит, раффинозу, проба с метиленовым синим положительна. Основные признаки видов представлены в табл. 15; при идентификации следует помнить, что иерсинии способны существенно изменять свой метаболизм в зависимости от температуры (табл. 16). Иерсинии широко распространены в природе, некоторые из них — паразиты различных животных (особенно грызунов и птиц) и человека; их также выделяют из почвы, воды и пищевых продуктов. Y.pestis вызывает чуму, Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica патогенны для различных животных и иногда для человека, вызывают брыжеечный лимфаденит, хроническую диарею и тяжелые септицемии. Y. ruckeri вызывает «болезнь красного рта» у рыб, прочие виды не патогенны; либо вызывают оппортунистические инфекции у человека (табл. 14). ^
^
* Возможна положительная реакция у свежевыделенных штаммов. В данном разделе использованы результаты диссертационной работы Д.А.Померанцева. ^
Температурные пределы роста иерсиний варьируют от 0 до 39°С (для Y.pestis до 45°С); оптимум роста — 28-30°С; температура 37°С — селективная для образования капсулы Y.pestis. Границы рН для роста — в пределах 5,8-8,0; оптимум рН — 6,9-7,2. Хорошо растут на простых питательных средах, медленный рост бактерий (до 3 суток) можно ускорить добавлением гемолизированной крови или сульфата натрия (Y. pseudotuberculosis практически не растут на среде Плоскирева). Наиболее благоприятная температура для выделения Y. enterocolitica — 22-29°С. На средах для изучения подвижности (например, содержащих индол и орнитин) Y. enterocolitica неподвижны или малоподвижны при 35°С и подвижны при 25°С. ^ Все виды иерсинии имеют O-Аг (эндотоксин), похожий на Аг многих грамотрицательных бактерий и токсичный для животных и человека. Липополисахаридно-белковые комплексы O-Аг разделяют на основе химических и антигенных характеристик на «гладкие» (S) и «шероховатые» (R); последние — общие для Y.pseudotuberculosis и Y.pestis. Все штаммы Y. enterocolilica обладают поверхностным Аг энтеробактерий, общим с представителями семейства. Имеются публикации о наличии у Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolilica продуктов, напоминающих экзотоксины. У Y. pestis выделяют разнообразные (до конца неисследованные) Аг, роль которых как факторов вирулентности неясна. Фракция 1 ( Fl ) – капсульный антиген, представлен поверхностным гликопротеиновым Аг. Он предохраняет бактерии от поглощения полиморфно – ядерными лейкоцитами, не оказывает токсического действия, но проявляет иммуногенные свойства. ^ — протеаза, активирующая лизис фибриновых сгустков, препятствующих диссеминированию возбудителя, и инактивирующая СЗЬ и С5а компоненты комплемента. V/W( Vi )-Aг Y.pestis состоит из белка (V-фракции) и липопротеина (W-фракции); проявляет антифагоцитарные свойства и способствует внутриклеточному росту бактерий. Штаммы Y. pestis, содержащие только V/W-Аг, вирулентны для мышей. ^ представлен белковоподобным веществом, локализованным внутриклеточно; LD50 для мышей — менее 1 мг (также токсичен для крыс), вызывает шок и смерть, эффект — антагонист адренергических рецепторов. Показана способность Y. pestis выделять бактериоцины (пестицин I и пестицин II), обладающие иммуногенными свойствами и оказывающими бактерицидное действие на Y. pseudotuberculosis и некоторые штаммы Escherichia coli. Чума. Y. pestis вызывает чуму (от арабского «джумма») — зооантропоноз, поражающий грызунов (основной природный резервуар) и проявляющийся спорадическими вспышками или эпидемиями (эпизоотии). Человеку передается через блох, а также контактным, алиментарным и аспирационным путями; также опасны вторично загрязненные объекты и трупы. Эпидемии чумы известны с III в. до н.э., иногда они приобретали характер пандемии. Первая достоверная пандемия 527-565 гг. («юстинианова чума»), начавшаяся в Египте и Эфиопии, привела к огромным потерям среди населения Восточной Римской империи, но самой опустошительной была вторая пандемия чумы в XIV-XV вв., вошедшая в историю под названием «великой» или «черной» смерти и унесшая около 60 миллионов жизней, только в Европе погибло более 25 миллионов человек. Как последствие второй пандемии рассматривают эпидемию чумы в Лондоне (1664-1665 гг.), повлекшую смерть 20% населения. Третья пандемия началась в Гонконге в 1894 г., продолжалась около 20 лет и унесла жизни 10 миллионов человек. В самом ее начале были сделаны важные открытия (выделен возбудитель, доказана роль крыс в эпидемиологии чумы), что позволило организовать профилактику на научной основе. Возбудитель чумы обнаружили Г.Н. Минх (1878) и независимо Иерсин и Китазато (1894). Большой вклад в изучение эпидемиологии чумы внесли исследования Л.М. Исаева и Н.Н. Клодницкого, а также И.И. Мечникова, руководившего работой противочумных отрядов в Астраханской губернии (1911 г.). В 40-х гг. в Северной Африке была отмечена последняя эпидемическая вспышка; тем не менее, с 1958 по 1979 гг. в мире зарегистрировано 47 000 случаев чумы. Последние вспышки были в Индии (вторая половина 90-х гг.) В эпидемиологическом отношении первое место занимают крысы (как самые распространенные и многочисленные грызуны); основную роль играют три вида — серая крыса-пасюк (Rattus norvegicus), черная крыса (Rattus rattus) и египетская крыса (Rattus alexandrinus); чумные эпизоотии среди крыс обычно предшествуют заболеваниям людей. В степных регионах (где крыс мало) ведущую роль играют суслики, сурки и песчанки; общий список диких грызунов включает около 240 видов и подвидов, не считая синантропных крыс и мышей. При эпизоотиях среди мышей определенная роль в переходе заболевания на людей может принадлежать кошкам. Длительное время господствовало мнение, что чума (городская чума) среди синантропных крыс первична, а в дикой природе (дикая чума) — вторична, однако выявление эндемичных очагов в областях, практически свободных от крыс (например, в провинциях Северной Индии), показало ошибочность подобных воззрений. Группу риска по заболеваемости «дикой» чумой составляют охотники и заготовители животного сырья. Часто «дикая» чума и большинство случаев «городской» чумы протекают в виде бубонных поражений. В передаче чумы человеку ведущую роль играют взрослые особи крысиных блох (Xenopsylla cheopsis), пожизненно сохраняющие возбудителя (общий список видов и форм блох, из которых выделяют возбудителя, насчитывает около 100 видов). Повсеместное вытеснение пасюком черной крысы сыграло, применительно к эпидемиологии чумы, положительную роль. На серых крысах паразитируют блохи Ceratophilus fasciatus, живущие преимущественно в норах грызунов, а не в их шерсти и гораздо реже перебирающиеся на человека, чем блохи черных крыс. Показано, что человек заражается не столько при укусе, сколько после втирания в кожу ее фекалий или масс (контаминированных бактериями), срыгиваемых при питании. Установлено, что бактерии, размножающиеся в кишечнике блохи, выделяют коагулазу, способствующую образованию «пробки» (чумной блок), препятствующей поступлению крови в ее организм. Попытки голодного насекомого к кровососанию сопровождаются срыгиванием зараженных масс на поверхность кожи в месте укуса. В жилищах человека блохи также могут переносить заболевание от человека к человеку (рис. 15).  ^ Природные очаги прочно связаны с определенными ландшафтно-климатическими условиями, всем им свойственна определенная засушливость климата, приводящая к развитию биоценозов, характерных для пустынь, полупустынь, степей, саванн и высокогорных лугов. В РФ природные очаги чумы существуют в 14 регионах: на юге Горного Алтая, Туве и Забайкалье, отдельные случаи отмечают в междуречье Волги и Урала, Ставрополья, Прикаспия и на Кавказе. Всемирное распространение заболевания охватывает практически всю Африку, Азию (особенно Юго-Запад) и Южную Америку; в США заболевание зарегистрировано в 15 штатах, а районы к западу от реки Миссисипи считают эндемичными. Бактерию Y. enterocolitica впервые выделили Шляйфштайн и Колмэн (1939, типировав ее как атипичного возбудителя псевдотуберкулеза. С середины 60-х годов появились сообщения о выделении данного микроорганизма от больных людей. Основное поражение, вызываемое Y. enterocolitica, —кишечный иерсиниоз — инфекция, сопровождающаяся диареей, энтеритом, псевдоаппендицитом, илеитом, узловатой эритемой и (иногда) септицемией или острым артритом. Ведущий симптом заболевания — гастроэнтерит. Возбудитель широко распространен в природе, его выделяют от насекомых, моллюсков, ракообразных, птиц, грызунов, собак, кошек, домашних сельскохозяйственных животных (основные хозяева). Y. enterocolitica можно также обнаружить в воде многих рек и озер. Инфицирование человека происходит, вероятно, фекально-оральным путем. Большую заболеваемость регистрируют в странах с теплым климатом. Точные значения распространенности кишечного иерсиниоза до сих пор не установлены, т.к. высеваемость возбудителя из фекалий при гастроэнтеритах не превышает 0-3%. Подъем заболеваемости отмечают в осенне-зимний сезон. В Европе основной резервуар — свиньи, большинство достоверных случаев заражения связаны с употреблением недостаточно термически обработанной свинины. Большинство случаев, зарегистрированных в Японии, связано с употреблением в пищу рыбы и ракообразных. Среди возбудителей доминирует серотип O3; в Новом Свете до начала 80-х гг. преобладали поражения, вызванные серотипом O8, но в настоящее время отмечают преобладание серотипа O3. Септицемии обычно регистрируют у лиц с иммунодефицитами, анемиями, нарушениями обмена железа, заболеваниями почек. Сравнительно редкие осложнения — фарингиты, поражения сердца и печени. Возбудитель псевдотуберкулеза впервые выделили Малласе и Виньяль (1883), а позднее детально изучили Эберт (1886) и Пфайффер (1886). Y.pseudotuberculosis вызывает у человека острый брыжеечный аденит или аппендицитоподобный синдром с патологоанатомическими изменениями, сходными с таковыми при туберкулезе; у диких и домашних животных заболевание протекает с системными поражениями. По-видимому, заражение человека Y. pseudotuberculosis происходит от инфицированного животного путем, общим для большинства кишечных инфекций. Природный резервуар возбудителя — грызуны, олени, домашние животные и птицы. Заболевания человека наблюдают сравнительно редко. Большая часть случаев зарегистрирована в Европе у подростков; пик заболеваемости — зимние месяцы. ПатогенезY. pestis внедряется в организм в месте укуса блохи; в свою очередь блохи инфицируются бактериями, питаясь кровью грызунов в период бактериемии, предшествующей гибели животных (трансовариальная передача возбудителя у блох отсутствует, бактерии погибают при попадании в кишечник личинок). При температуре 28°С (температура тела блохи) Y. pestis не образует фракцию 1 и V/W-Aг. В организме человека возбудитель болезни мигрирует по лимфатическим сосудам в региональные лимфоузлы, где захватывается мононуклеарными клетками. Так как внутриклеточный фагоцитарный киллинг подавляется возбудителем, то начинается его внутриклеточное размножения с развитием воспалительной реакции в лимфоузлах. Размножение бактерий в макрофагах лимфоузлов приводит к увеличению последних, слиянию, образованию конгломератов (бубонная форма). На данном этапе бактерии также резистентны к фагоцитозу полиморфно-ядерными лейкоцитами благодаря Fl и из-за нехватки специфических антител. Поэтому-то затем развивается геморрагический некроз лимфоузлов, бактерии получают возможность прорваться в кроветок и внедриться во внутренние органы, что приводит к септической форме. Возможна легочная форма поражения, при воздушно-капельном пути распространения. В результате распада микроорганизмов образуются эндотоксины, обуславливающие интоксикацию. Y. enterocolitica вызывает энтероколит с диареей, лихорадкой и болями в животе. Факторами вирулентности считают адгезины и инвазины, облегчающие взаимодействие с кишечным эпителием, низкомолекулярные протеины, ингибирующие активность бактерицидных факторов и энтеротоксин, аналогичный термостабильным токсинам Е. coli. Бактерии проникают в слизистую оболочку тонкой кишки, размножаются в пейеровых бляшках и мигрируют в брыжеечные лимфатические узлы. Вирулентность бактерий существенно повышается в присутствии Fe2+. Основной защитный барьер организма, скорее всего, — кислая среда желудка. ^ Чума. Инкубационный период заболевания — 3-6 суток (при эпидемиях или септических формах сокращается до 1-2 дней). Заболевание начинается внезапным подъемом температуры тела с головной болью и чувством разбитости; характерен налет на языке («натертый мелом язык»), его отек, в результате чего речь становится невнятной; в более тяжелых случаях развивается галлюцинаторное состояние. Наиболее часто возбудитель внедряется через кожные покровы, но только в 3-4% случаев отмечают местную реакцию в виде высокоинфекционных пустулы и карбункула (кожная чума). Чаще чумная палочка не вызывает воспалительных изменений кожи и мигрирует в ближайший лимфатический узел. В течение 2-6 дней в лимфатическом узле развивается серозно-геморрагическое воспаление, и формируется резко болезненный бубон. Нередко наблюдают присоединение регионарного бубона к кожной чуме, что дает кожно-бубонную форму чумы. Патогенетически различают первичные (всегда связаны с местом входных ворот инфекции) и вторичные бубоны (возникают лимфогенно). По клиническим проявлениям выделяют преимущественно локальные формы (кожная, кожно-бубонная и бубонная), генерализованные или внутренне-септические формы (первично- и вторичносептическая), внешне диссеминированные формы (первичная и вторичная легочная, кишечная). ^ При данной форме заболевания кардинальный признак — бубон (чаще подмышечный или паховый), ранний признак — ощущение сильной боли в месте будущего бубона (часто больной вынужден принимать неестественные позы). Увеличиваясь до 10 см в диаметре, бубон размягчается, может нагноиться и спонтанно дренироваться. В случае развития геморрагического некроза лимфатического узла и утраты барьерной функции в кровоток поступает большое количество бактерий, что ведет к вторичной чумной пневмонии и/или генерализованному чумному сепсису. Вторичная легочная чума (как осложнение) составляет 5-10% бубонных поражений и резко утяжеляет состояние больного; регистрируемый иногда (вследствие генерализации) вторичный чумной менингит, как правило, заканчивается смертью больного. Смертность без лечения при бубонной чуме достигает 75%. ^ — молниеносная и чрезвычайно контагиозная форма чумы; распространяется воздушно-капельным путем и эпидемически наиболее опасна. Больной выделяет с мокротой большое число чумных микробов; при этом объем мокроты может достигать огромных количеств (целыми тазами). Смертность без лечения близка к 100%. Смерть наступает через 2-6 суток после первичного аэрогенного контакта с инфекцией. ^ проявляется профузной диареей с обильным выделением крови и слизи, сильными болями в эпигастральной области; обычно заканчивается смертью больного. ^ характеризуется многочисленными кровоизлияниями в коже и слизистых оболочках; в тяжелых случаях наблюдают массивные кровотечения из почек, кишечника и кровавую рвоту. Генерализация процесса возникает без предшествующих местных явлений, типичны исключительно быстрое диссеминирование возбудителя в организме, массивные интоксикация и бактериемия. Заболевание быстро заканчивается смертью больного. Кишечный иерсиниоз. Сопутствующая регионарная лимфаденопатия имитирует приступ аппендицита. Диарея обусловлена действием термостабильного энтеротоксина, стимулирующего синтез гуанилатциклазы. ^ Кишечная инфекция может трансформироваться в септицемию с поражением внутренних органов и тяжелыми артритами; поражения обычно возникают через 1-14 суток от начала болезни. Патогенез суставной патологии связан со способностью компонентов клеточной стенки взаимодействовать с молекулами II класса HLA, образуя суперантигены, что активирует Т-клетки и стимулирует их пролиферацию. Аналогичные механизмы лежат в основе реактивных артритов, вызываемых стафилококками. ^ Способность Y.enterocolitica вызывать реактивные артриты рассматривается рядом авторов как основание считать их этиологическим агентом ряда форм анкилозирующего спондилита, тем более, что бактерии часто выделяют от подобных больных. Псевдотуберкулез. Y. pseudotuberculosis вызывает энтероколиты. Однако более характерно воспаление брыжеечных лимфатических узлов в илеоцекальной области, часто не отличимое от аппендицита. Диссеминирование по кровеносным или лимфатическим сосудам наблюдают редко. ^ Наиболее достоверный результат, подтверждающий диагноз, получают выделением иерсиний из патологического материала. Данные бактериологических исследований не менее важны для дифференциальной диагностики заболеваний, протекающих с лихорадкой, лимфаденопатиями и энтероколитами.  ^ Исследуемый материал. У больного с подозрением на чуму исследуют отделяемое бубона (при бубонной форме), содержимое язвы или других кожных поражений (кожная форма), мокроту и слизь из зева (легочная форма), кровь (все формы), фекалии и СМЖ (при поражениях кишечника или мозговых оболочек). Материал следует получить до начала антибиотикотерапии. Выделение Y.pestis проводят по стандартной схеме (рис. 16).  ^ Возбудитель кишечного иерсиниоза может быть выделен из крови (Y.enterocolitica) и из кала (Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica) по стандартной (рис. 17) и по оригинальной схеме, предложенной Д.А. Васильевым, Д.А. Померанцевым. Схема бактериологического выделения и идентификации Yersinia enterocolitica. (Д.А. Васильев, Д.А. Померанцев). ^ Иерсиниоз – острое инфекционное заболевание из группы зооантропонозов, характеризующееся полиморфностью клинического проявления, в первую очередь как пищевая инфекция людей с тенденцией к генерализации, септикопиемии, а также поражению различных органов и систем жизнедеятельности у людей и животных. Иерсиниоз относится к числу широко распространенных в мире инфекций, что обусловленно выраженной адаптационной способностью возбудителя. Исследования последнего десятилетия позволили сформулировать заключение о повсеместном распространении данной инфекции в России. Так как по международной классификации кишечный иерсиниоз входит в число четырех наиболее распространенных пищевых инфекций, опережая по некоторым показателям сальмонеллез, то основным путем заражения людей являются пищевые продукты, и в частности мясопродукты. ^ В бактериологическую лабораторию направляют не менее 200 г исследуемого субстрата, упакованного в водонепроницаемую тару и желательно в первые 1-3 часа после отбора. Если время доставки образцов свыше указанного срока, то материал допускается направлять в замороженном виде в термосе со льдом. ^ Первый этап (24-48 часов). Изучаемый субстрат (не менее 25 г) измельчают и смешивают со средой накопления – солевой фосфатно-буферный раствор (0,85% NaCl, КН2РО4 – 0,45 г, Na2НРО4 –6,34г, Н2О – 1000 мл) с 1% спиртовым раствором генцианвиолета, в соотношении 1:5 (1 часть продукта и 5 частей среды) встряхивают в течение 1 минуты и культивируют при +4°С 24 – 48 часов. Через указанные сроки (24 часа в первую очередь, с дальнейшим сохранением в холодильнике исследуемой суспензии) 1мл полученной бактериальной суспензии смешивают с 5 мл 0,5%-ного раствора КОН (приготовленного по следующей методике: готовят стерильный 40% раствор КОН, из него в пробирку, содержащую 7,9 мл 5% стерильного раствора NaCl, добавляют 0,1 мл) встряхивают и через минуту высевают на селективный агар. Параллельно на селективные среды высевают и со среды накопления, хранящейся в холодильнике, причем посев делают с верхней трети суспензии (но не с поверхности), не взбалтывая среду. ^ . Рост на селективных средах (24-48 часов). В качестве селективного агара используют несколько сред. На агаре Эндо рост изучаемых иерсиний – колонии мелкие, гладкие, слегка прозрачные. К 36 часам, удается их детальнее рассмотреть. ^ дает хорошие результаты: к 36 - 48 часам – колонии интенсивно-красного цвета, матовые, шероховатые, центр выпуклый. Однако недостаток данной селективной среды — достаточно сложный по структуре состав: глюкоза – 0,5 г, мочевина – 0,5г, молибденовокислый аммоний – 0,1 г, углекислый натрий безводный – 0,1 г, 30% водный стерильный раствор сухой желчи – 2 мл, 1,6% водный раствор краски конгорот – 0,9 мл, 1,0% водный раствор генцианвиолета – 0,1 мл, сухой питательный агар –4,5 г, дистиллированная вода – 100 мл. ^ (аналог БТС), она выпускается как коммерческая и имеет следующий состав: желчь медицинская 20 мл, раствор NaOH 4% – 10-12 капель, сухой питательный агар – 35 г, глюкоза –10 г. мочевина 5 г, 1,6% спиртовой раствор бромтимолового синего – 8 мл, дистиллированная вода 1000 мл. В случае трудностей с приобретением ее состав достаточно доступен и она легко готовится в лаборатории. К 1 литру воды добавляют сухой питательный агар, медицинскую желчь, автоклавируют 20 минут при 0,5 атм. После охлаждения до 80°С добавляют глюкозу, мочевину, индикатор бромтимоловый синий и все смешивают. Среда зеленоватого цвета, хранится неделю. Иерсинии, разлагая мочевину, изменяют цвет среды на сине-зеленый, а колонии будут синего цвета. Те микроорганизмы, что не разлагают мочевину, растут в виде желтых колоний. Через 24-48 часов культивирования при температуре 22°С проводят идентификацию выросших колоний. Преимущество среды в том, что выявляется уреазная активность. ^ . Клонирование, выделение чистой культуры (от 48 часов), биохимическая идентификация выделенных штаммов. Из выделенной по морфологии и окраске колонии берут бакмассу для мазка, окрашивают по Граму. Если при микроскопии наблюдают грамотрицательные, полиморфные палочки, с закругленными краями, без спор и капсул, одиночные, возможно кокковидные, реже овоидные, то оставшуюся бакмассу колонии переносят в МПБ, ресуспендируют, подращивают при 24-26°С и проводят идентификацию по биохимическим тестам. При положительной уреазной активности, ферментации глюкозы и отсутствии газообразования в первые 24 часа при 37°С исключают все газообразующие энтеробактериии родов: Escherichia, Edwardsiella, Citrobacter, Salmonella, Enterobacter, Hafnia. Способность ферментировать арабинозу исключает еще два рода – Proteus, Serratia, отсутствие ферментации инозита исключает род Klebsiella. Внутри родовая дифференциация Yersinia проводится с использованием следующих биохимических тестов: положительные результаты ферментации сахарозы, целлобиозы, сорбозы, сорбита и отрицательные показатели ферментации рамнозы, мелибиозы, раффинозы при положительном тесте на уреазу и подвижность при 25°С могут свидетельствовать о принадлежности выделяемой культуры к бактериям вида Yersinia enterocolitica. Внутривидовая дифференциация выделенных культур Yersinia enterocolitica делается с целью типирования биовариантов и проводится по следующим тестам: положительные результаты на индол, ксилозу, салицин, трегалозу указывают на принадлежность штаммов к 1 биовару, отрицательные результаты по этим тестам свидетельствуют о принадлежности штаммов к 5 биовару. Штаммы 2 биовара из указанных 4-х тестов дают отрицательные показатели только по салицину. Штаммы 4 биоварианта имеют из данных 4-х тестов положительный результат только по трегалозе. Штаммы 3 биовара дают отрицательные результаты по тестам на салицин и индол и положительные результаты по тестам на ксилозу и трегалозу. Биоварианты 2, 3, 4 являются наиболее патогенными для человека. При исследовании по третьему этапу проводят одновременно постановку по всем необходимым тестам, что сокращает сроки исследования выделенной культуры. ^ При соответствии полученных результатов по тестированию выделенной культуры с вышеуказанными данными полученный бактериальный штамм определяют как бактериальную культуру вида Yersinia enterocolitica. В случае, если изучаемая бактериальная культура не типируется как бактерии вида Yersinia enterocolitica, возможен вариант повторного использования бактериальной суспензии со средой накопления, хранящейся в холодильнике при +4°С. Оптимальным решением является постановка на исследование не одной пробы исследуемого образца, а целой серии проб. Общие сроки бактериологического исследования материала - в пределах 7 суток. Идентификация вида осуществляется биохимическими и серологическими методами. Для проведения ускоренной диагностики заболевания можно использовать чумной бактериофаг. Бактериофаг Y. pestis выделяют из различных источников, включая ткани больного человека и животных, а также блох. Многие авторы связывают естественное быстрое угасание заболевания в очаге с наличием бактериофага. Его высокая специфичность и вирулентность для чумной палочки позволяют применять его для идентификации чумы внесением в исследуемый материал перед посевом либо по увеличению титра бактериофага в среде. Для быстрого обнаружения также применяют AT, меченные флюоресцинами (позволяют обнаружить Y. pestis в различных объектах в течение первых 2 ч исследования), реакцию нейтрализации AT, реакцию преципитации в стандартных агаровых пластинках и метод ускоренного роста Y. pestis на средах обогащения. Также разработаны методы, ускоряющие биологическую пробу, например, введение зараженным животным глюкокортикоидов или куриного желтка, что позволяет ускорить диагностику чумы в случаях снижения вирулентности или при применении малой заражающей дозы. Основные биохимические свойства, дифференцирующие Y.pseudotuberculosis и Y. enterocolitica, представлены в таблицах 15 и 16. Дополнительными признаками могут служить результаты реакции Фoгеса-Проскауэра: всегда отрицательные у Y. pseudotuberculosis и положительные при 22-28°С у Y. enterocolitica. В последнее время для выделения Y.enterocolitica из фекалий предложена селективная среда, содержащая цефсулодин, иргазан и новобиоцин (CIN-агар). ^ Фосфатно-буферный раствор (ФБР)Раствор А: KH2PO4 – 9,08 г в 1,0 л дистиллированной воды; раствор Б: Na2HPO4 2H2O – 11,87 г в 1 л дистиллированной воды (pH 7,6-7,8). 150 мл раствора А соединить с 850 мл раствора Б. Разлить по 5 мл в пробирки, стерилизовать при 1 атм. в течение 1 часа. ^ Гидролизат казеина средней степени расщепления – 2,0 мл (Дагестанский НИИ питательных сред); экстракт пекарских дрожжей – 5,0 мл; фосфатно-буферный раствор (pH 7,6-7,8) – до общего объема 1 л. Экстракт пекарских дрожжей: к 500 г дрожжей, предварительно размельченных до гомогенной массы в фарфоровой ступке в малом объеме дистиллированной воды добавить до 1 л дистиллята. Взвесь слить в колбу и кипятить в течение 60 минут на медленном огне при помешивании. Взвесь охладить при 5°С в течение 16-18 часов. Затем надосадочную жидкость слить и профильтровать через широкопористый бумажный фильтр. Приготовленный дрожжевой экстракт разлить во флаконы, простерилизовать под давлением 0,5 атм. 30 минут; хранить при температуре 5-8°С в течение 12 месяцев. К 0,5 л фосфатно-буферного раствора добавить 2,0 г гидролизата казеина (предворительно подготовленного согласно указаниям на этикетке) и 5,0 мл экстракта дрожжей. Смешать встряхиванием, добавить фосфатно-буферный раствор до общего объема 1 л и проверить pH готовой среды (должен быть 7,6-7,8). Далее смесь разлить в пробирки по 5,0 мл и автоклавировать под давлением 0,5 атм. в течение 20 минут. Среду можно использовать в течение 7-10 суток при хранении в условиях холодильника. ^ Глюкоза 0,5 г Мочевина 0,25 г Молибденовокислый аммоний 0,1 г Сода безводная 0,1 г 30% водный раствор сухой желчи 2,0 мл 1,6% водный раствор конго-рот 0,8 мл 1% водный раствор генцианвиолета 0,1 мл Сухой агар 3,5 г Дистиллированная вода 100,0 мл Конго-рот и генцианвиолет растворить в горячей дистиллированной воде. Раствор сухой желчи готовить в стерильной воде. Указанные ингредиенты вносить в дистиллированную воду, нагревать и кипятить 5 минут при помешивании, разлить в чашки Петри. Цвет среды темно-вишневый, pH — 7,2-7,4. Среду можно хранить в течение недели в холодильнике. ^ Желчь медицинская 20 мл Раствор NaOH 4% 10-12 капель Сухой питательный агар 35 г Глюкоза 10 г Мочевина 5 г 1,6% спиртовой раствор с индикатором бромтимоловым синим 8 мл Дистиллированная вода 1 л К 1 л воды добавить сухой питательный агар, медицинскую желчь и автоклавировать 20 минут при 0,5 атм. После охлаждения до 80°С добавить глюкозу, мочевину, индикатор бромтимоловый синий, смешать и сразу разлить в стерильные чашки Петри, pH – 7,8. Хранить среду при температуре 5-8°С в течение недели. ^ Агар сухой питательный 3,5 г Лактоза 0,4 г Глюкоза 0,08 г Крахмал растворимый 0,05 г Сахароза 1,5 г Мочевина 0,25 г Уксуснокислый свинец 0,3-0,04 г Тиосульфат натрия 0,03 г Цистин 0,003 г 1% феноловокрасный водорастворимый 2,5 мл Дистиллированная вода 100 мл Ингредиенты вносить в любом порядке. Количество питательного агара, вносимого в среду, зависит от его серии. Если на этикетке указано, что на 100 мл воды его надо брать 5 г, то в среду добавляют 3,5 г, если на этикетке имеется рекомендация 3,5 г на 100 мл, то добавляют 2,5 г. Среду кипятить в течение 10-15 минут, разливать в стерильные пробирки по 5 мл, автоклавировать при 0,5 атм. 15 минут, после чего скашивать. Цвет среды абрикосовый. ^ Раствор А – калия гидроокись 400 г; вода дистиллированная до 1 л. Раствор В – натрия хлорид 5,0 г; вода дистиллированная до 1 л. Оба раствора приготовить отдельно и хранить в условиях холодильника. Перед началом работы приготовить рабочий раствор, смешивая 9,7 мл раствора В и 0,13 мл раствора А. Щелочной раствор должен быть прозрачным. ^ Двузамещенный фосфат калия 5,0 г Пептон 7,0 г Глюкоза 5,0 г Вода до 1 л Пептон и фосфат калия растворить в воде и кипятить 2-5 минут. После удаления осадка среду стерилизовать при 120°С в течение 20 минут, асептично добавить стерильный раствор глюкозы и разлить по 3-4 мл в пробирки. |
отлично
1
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям