Учебно-методическое пособие Составители: Д. А. Васильев, А. А. Щербаков, Л. В. Карпунина С. Н. Золотухин удк 619: 616
|
|
Скачать 3.74 Mb.
|
|
^
Систематика микроорганизмов данного рода не завершена и требует дальнейшей доработки. Достаточно указать, что по справочнику Берджи (1997 г., издания США-1994) в род Haemophilus входит 11 видов; Kilian, Biberstein (1984) авторитетно настаивают на 16 видах. Микроорганизмы рода - неподвижные, грамотрицательные коккобациллярные или палочковидные бактерии, характеризующиеся полиморфизмом; иногда могут образовывать нити. Облигатные паразиты; для роста необходимы ростовые факторы, содержащиеся в эритроцитах (что отражает название Haemophilus), особенно Х (протопорфирин IХ) и/или V (никотинамидадениндинуклеотид – NAD или NAD-фосфат – NADP). Температурные границы роста 24-43°С, оптимальная температура 35-37°С. Некоторые виды Haemophilus входят в состав нормальной микрофлоры организма человека и животных, другие вызывают тяжелые инфекции (менингит, эпиглоттит, пневмонию, перикардит и др.). Типовой вид — Haemophilus influenzaе. Внутри рода микроорганизмы дифференцируют по потребности в указанных факторах роста и биохимическим свойствам (табл. 20). ^
*На КА с эритроцитами лошади Фактор роста Х содержится в эритроцитах в виде термостабильной группы тетрапирролов, входящих в состав гематина и гемина (принимают участие в цитохромном транспорте электронов и синтезе каталазы и пероксидазы). Виды, нуждающиеся в Х-факторе, не способны синтезировать протопорфирин из -аминолевулиновой кислоты, что используют для их идентификации (см. ниже), фактор роста V — термолабильный кофермент, включающий НАД (коэнзим I) или НАДФ (коэнзим II). Этот фактор — составная часть витаминов группы В, участвующих в окислительно-восстановительных реакциях бактериальных клеток. V-фактор присутствует в некоторых продуктах (например, в дрожжах), а также синтезируется некоторыми бактериями (например, сарцинами, стафилококками, нейссериями и др.). Добавление в питательную среду НАД, НАДФ или никотинамидрибозида удовлетворяет потребность микроорганизма в V-факторе. Также рост гемофилов стимулирует посев вблизи колоний микроорганизмов, продуцирующих V-фактор. Потребность в его присутствии испытывает незначительное число видов, а Н. aprophilus не нуждается в обоих факторах. ^ Основной патоген; вызывает респираторные и менингеальные инфекции, эндокардиты, абсцессы, артриты, поражения кожи, ногтей и глаз. Гемофильные бактерии первым выделил Кох в начале 80-х гг. XIX в. из конъюнктивального экссудата больного египетским конъюнктивитом. Позднее схожий микроорганизм выделили М.И. Афанасьев (1891) и Пфейффер (1892) из гнойного отделяемого и ткани легкого больного, умершего во время пандемии гриппа. Длительное время его считали возбудителем гриппа (influenza), что объясняет происхождение видового названия. Недавно методом ДНК-гибридизации была установлена идентичность возбудителей конъюнктивита и легочных поражений, а возбудитель конъюнктивита, ранее известный как Haemophilus aegyptius, систематизирован как Haemophilus influenzae биовар aegyptius. МорфологияHaemophilus influenzae — небольшие (0,3-0,41-1,5 мкм) коккобациллы, склонные к плеоморфизму. Часть штаммов имеет полисахаридную капсулу. Клеточная стенка наружной мембраны содержит ЛПС (эндотоксин) и протеины; некоторые из них штаммоспецифичны и идентифицируются серологически, что иногда используют при эпидемиологических обследованиях. В зависимости от состояния популяции, на ША капсулосодержащие штаммы Haemophilus influenzae формируют слизистые М-колонии (сочные, сероватые, иризирующие [дающие радужную окраску] в проходящем свете), образованные мелкими палочками, либо блестящие S-колонии диаметром 3-4 мм (полупрозрачные, при окраске по Грaму капсулы выражены слабо или не выявляются). Некапсулированные штаммы на твердых средах формируют более мелкие зернистые R-колонии (с неровным краем, не иризируют, серовато-белого цвета). Образованы полиморфными палочками и нитевидными формами. ^ Haemophilus influenzae — факультативный анаэроб, хорошо растущий на воздухе. Обязательное условие роста, характерное всех видов Haemophilus -присутствие в питательной среде свежей крови. Перед внесением в среду эритроциты разрушают (наиболее часто инкубируют при 80°С в течение 15 минут, что способствует высвобождению факторов и разрушению ферментов, инактивирующих V-фактор); самостоятельно лизировать эритроциты Haemophilus influenzae не способна. Оптимальные среды для роста – ША, агар Левинталя и среда с переваром Файлдса (пептический перевар эритроцитов). Кроме указанных факторов, для анаэробного роста микроорганизмы утилизируют и другие продукты, содержащиеся в эритроцитах, например, протопорфирин IX, пиридиннуклеотиды и др.  Рисунок 19. Принципиальная схема бактериологического выделения Haemophilus influenzae ^ Антигенная структура гемофильной палочки включает Аг двух типов — капсульные (5-30% всех штаммов) и соматические. Питтмэн (1931) предложил разделить все известные штаммы по структуре капсульных Аг на 6 серотипов (a-f); каждый из Аг представлен комплексом углеводов. Серодиагностику проводят в РА типоспецифическими политиповыми или монотиповыми сыворотками; возможна трансформация серотипов между штаммами. Защитные AT к Аг капсулы усиливают поглощение бактерий фагоцитами и стимулируют бактериолиз в присутствии комплемента in vitro. Основную эпидемическую опасность представляет Haemophilus influenzae типа b; ее капсульный Аг состоит из полирибозы и полирибитолфосфата. Некапсулированные штаммы неоднородны по антигенному набору; один из них — Аг М имеет белковую природу и существует у всех штаммов. ^ Возбудитель плевропневмонии свиней. Выделяют также при артритах овец, абсцессах у быков. Клетки представляют собой очень короткие палочки с закругленными концами, чаще - парные коккобактерии, иногда образуют короткие цепочки и даже нитевидные формы. Грамотрицательные, некислотоустойчивые, неподвижные. Образуют капсулу. Факультативный анаэроб. Температурный оптимум 37-38°С. Для роста на питательных средах обычно требуют наличия в них V-фактора. На оптимальных плотных питательных средах (сывороточно-дрожжевой агар) через 48 ч инкубирования формируют прозрачные серо-белые круглые колонии диаметром 1-2 мм, с ровными краями, гладкой поверхностью, средневыпуклые. Консистенция колоний мягкая, а при первичной изоляции часто бывает липкой. Колонии S-формы флюоресцируют в косопроходящем свете. На кровяном агаре большинство штаммов дает b-гемолиз, у ряда штаммов скрытая гемолитическая активность может быть выявлена в САМР-тесте. На средах без V-фактора растут в виде мелких сателлитных колоний вблизи культуры (колоний) бактерии-кормилки. Доказано наличие 12 серологических вариантов (1—12). Вид патогенен для свиней, морских свинок, белых мышей, кроликов. ^ Изолируют при полиартритах и полисерозитах свиней, нередко вместе с Mycoplasma hyorhinis, а также при пневмониях. Распространено носительство у клинически здоровых свиней. У поросят послеотъемного возраста вызывает гемофилезный полисерозит (болезнь Глессера). Морфологически представляет собой мелкие тонкие палочки, коккобактерии, короткие нити. Грамотрицательные, некислотоустойчивые, неподвижные. Образуют капсулу. Факультативный анаэроб. Для роста нуждается в V-факторе. Температурный оптимум 37-38°С. На простых питательных средах не растет. При первичной изоляции в атмосфере желательно создавать повышенную концентрацию СО2. На оптимальной плотной питательной среде (шоколадный агар) через 48-72 ч культивирования формирует мелкие (0,4—0,5 мм) колонии. На жидких питательных в средах с V-фактором рост сопровождается слабым равномерным помутнением среды. Доказано наличие четырех сероваров: А, В, С, D (Bakos et al., 1952). ^ Выделен от кроликов с явлениями слизистого энтерита. Патогенность не установлена. Клетки представляют коккобактерии и полиморфные палочки, редко нити. Капсула не обнаружена. Для роста на питательных средах требуется V-фактор. На шоколадном агаре образует круглые, гладкие, сероватые, непрозрачные колонии. ^ Возбудитель коризы птиц. Обнаруживают в респираторном тракте здоровых птиц. Клетки представляют коккобактерии, полиморфные палочки или нитевидные формы. Образует капсулу. Лучше растет в атмосфере с повышенным содержанием СО2 (10%). На шоколадном агаре через 48 ч образует круглые, выпуклые, гладкие, сероватые, полупрозрачные диаметром до 1 мм колонии. Гемолитическими свойствами не обладает. Рост стимулируют добавлением сыворотки крови кур, требуются Х- и V-факторы. Подразделяется на четыре серовара: А, В, С — содержащие поверхностные термолабильные антигены (Hinz, 1962), и четвертый — термостабильный соматический антиген (Hinz,1980). H. aviumПатогенные свойства не установлены. Среда обитания — верхние дыхательные пути птиц. Клетки в виде коккобактерии, полиморфных палочек, иногда нитей, имеют капсулу. Для роста на питательных средах требуется V-фактор, не нуждается в повышенном содержании СО2, гемолитической активностью не обладает. На шоколадном агаре образует круглые, выпуклые, гладкие, серовато-белые колонии, но возможны зернистые, морщинистые. Колонии капсулообразуюших штаммов флюоресцируют. ^ Вид с неясным таксономическим положением. Возбудитель септицемии и тромбоэмболического менингоэнцефалита крупного рогатого скота; может поражать генитальные органы. Среда обитания — слизистые оболочки респираторного и генитального трактов крупного рогатого скота. Короткие палочки или нити, грамотрицательные, некислотоустойчивые, капсулы большинство штаммов не образуют, неподвижны. Температурный оптимум 37-38°С. Первичная изоляция микроорганизма требует повышенного содержания СО2 (10%). Потребности в Х- и V-факторах не доказаны. На плотных питательных средах через 24 ч образует круглые, гладкие колонии диаметром 0,2-0,6 мм. При более длительном инкубировании возможно появление выпуклого центра, плоской периферии и зернистости. H. agniВид с неясным систематическим положением. Выделен при сепсисе, артритах, менингитах, миозитах, пневмониях и маститах овец. Грамотрицательные коккобактерии или полиморфные палочки, до неправильной формы нитевидных клеток. Неподвижные, некислотоустойчивые. Некоторые штаммы образуют капсулу. На кровяном агаре при 5-10% СО2 формирует выпуклые, просвечивающие колонии диаметром 0,5-1,6 мм, возможен рост в аэробных условиях. Несмотря на отсутствие четкой потребности в ростовых факторах, лучше растет на шоколадном агаре, не дает роста на агаре Мак-Конки. ^ Вид с неясным систематическим положением. Обитает в генитальных органах здоровых жеребцов, возможно длительное носительство у кобыл в области клитора. Возбудитель эндометритов и цервицитов у кобыл. Клетки имеют форму мелких, грамотрицательных, иногда биполярно окрашенных палочек, коккобактерий, нитей. Некислотоустойчивы, неподвижны, образуют капсулу. Температурный оптимум 37-38°С. Плохо растет в аэробных и анаэробных условиях, оптимальным является содержание 5-10% СО2 в атмосфере. Рост на питательных средах стимулируется Х-фактором. На шоколадном агаре формирует через 24 ч единичные, мелкие (около 1 мм), круглые, выпуклые, блестящие колонии серо-белого цвета. При надавливании бактериологической петлей колонии скользят по поверхности среды. Гемолитической активностью не обладает. Плохо растет на кровяном, сывороточном агаре, не растет на агаре Мак-Конки. Остальные виды рода Haemophilus, по современным данным, не играют роли в патологии сельскохозяйственных животных. ^ Среды для выращивания гемофильных бактерий должны содержать специальные ростовые факторы. Для этого в основную среду крови добавляют свежий стерильный экстракт дрожжей или чистые препараты ростовых факторов: V- , Х-фактор. ^ Содержит Х- и V-факторы. Агаровую питательную среду (МПА, агар Хоттингера) расплавляют на водяной бане и, не охлаждая, добавляют в нее 10—15% по объему стерильной дефибринированной или нитратной крови лошади, барана или кролика. После охлаждения питательной среды до 55—60°С содержимое сосуда тщательно перемешивают и разливают по чашкам или пробиркам. ^ Содержит Х- и V-факторы. Готовят при изучении морфологии колоний, так как шоколадный агар непрозрачен. В этом случае к расплавленной и затем охлажденной до 60°С агаровой среде добавляют, встряхивая, 10% стерильной дефибринированной или цитрированной крови барана или лошади. Кровь добавляют дробно (5—7 раз) при тщательном перемешивании питательной среды, флакон с которой в промежутках выдерживают на водяной бане с температурой 65°С. После внесения всего объема крови питательную среду нагревают до кипения и оставляют в кипящей воде в течение 5 минут. Затем среду вынимают из водяной бани и 2-3 минуты выдерживают при комнатной температуре. Процедуру прогрева среды повторяют три раза. Далее питательную среду ставят на 2 ч на водяную баню при температуре 60°С для осаждения темных хлопьев свернувшейся крови. По истечении указанного срока осторожно, стараясь не взмучивать осадок, верхнюю прозрачную часть агара разливают по пробиркам или чашкам Петри. ^ Содержит V-фактор. К расплавленному МПА или агару Хоттингера (рН 7,2-7,4) добавляют 5-10% стерильной сыворотки крови лошади, крупного рогатого скота, овцы, кролика и такое же количество дрожжевого экстракта. ^ 250 г прессованных пекарских дрожжей суспендируют до образования гомогенной суспензии в 1 л дистиллированной воды. Суспензию в колбе из термостойкого стекла кипятят в течение 4—5 минут, непрерывно перемешивая. Микробную массу осаждают центрифугированием при 3-4 тыс. об/мин в течение 30 минут. Надосадочную жидкость сливают и стерилизуют, пропуская через стерилизующие пластины фильтра Зейтца. Полученный таким образом дрожжевой экстракт хранят в посуде из темного стекла при 4-5°С и используют в течение 8-10 суток после изготовления. ^ Метод применяется для культивирования видов, рост которых зависит от наличия в среде V-фактора. Исследуемый материал (или изучаемую культуру) засевают газоном на сывороточной или кровяной МПА, можно на агар Хоттингера в чашки Петри. После этого по диаметру чашки крестообразно в виде непрерывной линии бактериологической петлей засевают «питающую» культуру бактерий. Чаще используют Е. coli или Staphylococcus albus, не обладающие гемолитическими свойствами. Эти виды бактерий в процессе роста выделяют V-фактор, который диффундирует в толщу агаровой среды. В зоне диффузии V-фактора, вблизи питающей культуры, так называемой «баккормилки», способны расти колонии гемофильных бактерий (сателлитный рост), нуждающиеся в V-факторе. ^ Используют препарат гемин (Х-фактор) и НАД (V-фактор). В питательную среду (плотную, жидкую) вносят растворы гемина, НАД или оба препарата, в зависимости от ростовых потребностей бактерий. При этом учитывают, что НАД термолабилен, его необходимо стерилизовать фильтрацией и добавлять в охлажденную до 45°С среду, а гемин термостабилен и выдерживает автоклавирование. Среды с селективными свойствами используют для выделения гемофильных бактерий из загрязненного патологического материала. ^ (1972). Предназначена для культивирования Х- и V-фактор -зависимых видов бактерий. На чашке Петри с кровяным агаром (5% крови овцы) засевают по всей поверхности исследуемый материал. Затем на питательную среду помещают бумажный диск, пропитанный раствором, содержащим 5% сапонина и 2 ЕД бацитрацина. Сапонин разрушает эритроциты, вокруг диска образуется зона гемолиза, и из крови, находящейся в агаре, освобождаются фактор Х и V-фактор, которые обеспечивают рост гемофильных бактерий. Бацитрацин подавляет рост бацилл. ^ (1983). Состоит из шоколадного агара, содержащего 5 мкг/мл ванкомицина, 300 мкг/мл бацитрацина и 1 мкг/мл клиндамицина. Данная среда неблагоприятна для различных видов бактериальных контаминантов. Высеваемость гемофильных бактерий (Н. influenzae) в 10 раз выше, чем на обычном шоколадном агаре. ^ (1983). Обладает ингибирующим действием на наиболее часто встречающиеся контаминанты (Е. coli, P. haemolytiса, Р. multocida, S. faecalis, S. aureus). Представляет собой триптозную среду с дрожжевым экстрактом, содержащую 1 мкг/мл кристаллвиолета, 1 мкг/мл линкомицина, 8 мкмг/мл спектиномицина, 128 мкг/мл бацитрацина. ^ (1983). Рекомендуется использовать для подращивания Н. pleuropneumoniae перед высевом на плотную среду. Состоит из сердечно-мозгового бульона с 5% лошадиной сыворотки, 5% дрожжевого экстракта, 100 мкг/мл ДПН, 0,5 мкг/мл линкомицина и 1,5 мкг/мл бацитрацина. По данным Т. Little (1970), получены положительные результаты при выделении Н. pleuropneumoniae из контаминированного материала на шоколадном МПА, содержащем 1:25 000 кристаллвиолета и 1,6 ЕД бацитрацина. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
отлично
1
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям