Учебно-методическое пособие Составители: Д. А. Васильев, А. А. Щербаков, Л. В. Карпунина С. Н. Золотухин удк 619: 616
|
|
Скачать 3.74 Mb.
|
|
^
Brucella — бактерии, представляют собой мелкие (0,5-0,70,6-1,5 мкм) неподвижные палочки или коккобациллы. В мазках обычно расположены одиночно, реже парами, короткими цепочками, небольшими группами. Легко окрашиваются анилиновыми красителями, грамотрицательны. Полноценного биполярного окрашивания обычно не обнаруживают. Настоящих капсул не имеют, спор не образуют. Неподвижны, жгутиков не образуют. Хемоорганотрофы, метаболизм дыхательный; для роста необходимы тиамин, ниацин и биотин; рост часто стимулирует внесение пантотената кальция. Восстанавливают нитраты (исключая Brucella ovis); каталазоположительны и обычно оксидазоположительны, цитрат не утилизируют; индол не образуют; реакции с метиловым красным и Фогеса-Проскауэра отрицательные. Строгие аэробы (некоторые нуждаются в увеличении концентрации СО2 до 5-10%); растут в пределах 20-40°С (оптимальная температура 37°С); оптимум рН 6,6-7,4. Факультативные внутриклеточные паразиты; человек заболевает при непосредственном контакте с больным животным (доярки, скотники), а также при употреблении в пищу зараженных продуктов. Патогенные для человека Brucella abortus (палочка Банга), В. melitensis, В.suis, В. canis и их биотипы вызывают бруцеллез (также известен как ундулирующая, средиземноморская, мальтийская лихорадка или болезнь Банга). Заболевание описывал еще Гиппократ, но как самостоятельную нозоединицу его предложил выделить Мерстон в 1860 г. Возбудитель бруцеллеза был открыт и выделен английским медицинским врачем Брюсом (1986,1887) из селезенки погибшего от этой инфекции солдата из гарнизона на Мальте и позднее назван Brucella melilensis. В 1904-1907 гг. Заммитом была установлена теснейшая связь инфекции людей и потреблением козьего молока и выявлено, что козы и козье молоко являются источником и резервуаром инфекции для людей. В 1897 датские ветеринарные врачи Банг и Стрибольт из околоплодной жидкости коровы выделили второй вид - Brucella abortus (палочка Банга). В 1914 г. Траумом, а затем в 1916 г. Гудом и Смитом выделен возбудитель инфекционного аборта свиней, названный позднее - В. suis. В 1918 году американская исследовательница Ивенс, изучив биологические и серологические свойства всех трех культур, установила их большое сходство. Результаты этих наблюдений были подтверждены Майером и Фезье (1920), которые и предложили объединить данные микроорганизмы в одну группу. РаспространениеРезервуар и источник инфекции — домашние животные (овцы, козы, коровы, свиньи, реже собаки). Человек — вторичный хозяин; заболевания людей, исключая случаи лабораторного заражения, возникают на фоне эпизоотии. Бактерии передаются от животного к животным и человеку через контакт с зараженными фекалиями, мочой, молоком и мясом. Как правило, каждый из патогенных для человека видов бруцелл избирательно инфицирует специфических животных; Brucella abortus чаще вызывает бруцеллез у крупного рогатого скота (болезнь Банга), В. melitensis — у коз и овец (иногда кур), В. suis — у свиней. Резервуар отдельных биотипов последнего вида — также зайцы, а в районах Крайнего Севера РФ, на Аляске (США), северо-западных территориях и Юконе (Канада) источником заражения могут быть северные олени (карибу). В США и РФ заболеваемость людей бруцеллезом носит, прежде всего, профессиональный характер. Возбудитель внедряется в организм человека через поврежденную кожу, слизистую оболочку дыхательных путей и ЖКТ, конъюнктиву. Контактный путь заражения более характерен для овечьего и свиного бруцеллеза. В странах, где отсутствует массовая пастеризация молочных продуктов, бруцеллез более распространен. Например, в Испании ежегодно регистрировали около 100000 случаев бруцеллеза. Большинство из них вызвано употреблением в пищу зараженных молока и сыра. МорфологияКлетки отличаются выраженным полиморфизмом: в одном препарате наблюдаются кокки и удлиненные палочки (особенно в молодых культурах). Клетки Brucella melitensis чаще представлены кокковидными формами, В.abortus и В. suis — палочками с закругленными концами. Возможно наличие капсул у некоторых видов, выявляемых при культивировании на среде Дорсе, на средах, содержащих 10% иммунной сыворотки барана или лошади, а также при выращивании на куриных эмбрионах. Капсульные культуры можно получить и при воздействии специфическим бактериофагом. Колонии видов Brucella мелкие, выпуклые и гладкие, мутноватые, с перламутровым оттенком (S-формы); первые генерации при посеве из органов развиваются довольно медленно (2 недели и больше), при пересевах лабораторных культур обычно достаточно 2-5 суток. В процессе диссоциации образуют шероховатые R-колонии. Нуждаются в сложных, обогащенных средах содержащих несколько аминокислот, тиамин, никотинамид и ионы магния. Brucella abortus дает оптимальный рост в атмосфере, содержащей 5-10% СО2. Рост бруцелл стимулирует внесение в питательную среду 5% глицерина или сыворотки. Сыворотка и кровь стимулируют рость, но гемин (Х-фактор) и НАД (У-фактор) влияния на рост не оказывают. Для выращивания обычно применяют триптозный, триптозо-казеиново-соевый и кровяной (5% овечьей крови) агар; оптимальная среда для культивирования — печеночный агар Хеддльсона. При выращивании для проверки диссоциации культур применяют 1% декстрозный агар с добавлением 2% глицерина (можно дополнить внесением 5% сыворотки). ^ Различные виды бруцелл практически неразличимы в реакциях простой перекрестной агглютинации, что впервые установила Ивенс (1918). Поверхностные Аг бруцелл дифференцируют истощением агглютининов по Кастелгани. Серологические свойства бактерий представлены в табл. 18. Два главных поверхностных Аг, А и М, имеют количественные видовые различия; соотношение для Brucella melitensis составляет 1:20, для В. abortus и В. suis — 2:1. Для их идентификации применяют соответствующие антисыворотки. Третий поверхностный Аг — термолабильный L-Аг, имеющий сходство с Vi-Аг сальмонелл. Шероховатые формы содержат специфический R-Аг; для его идентификации применяют специфические антисыворотки, используемые при серотипировании бруцелл. ^
^ Бруцеллы ферментируют углеводы, однако образования кислоты или газа обычно недостаточно для идентификации. Для дифференциации используют способность некоторых биотипов вырабатывать сероводород, а также чувствительность к бактериостатическому действию красителей — основного фуксина и тионина (табл. 19). ^
Патогенез^ : контактный, алиментарный и аспирационный. Принимая во внимание губительное действие желудочного сока на бруцелл, можно полагать, что при алиментарном заражении возбудитель инвазирует через верхние отделы ЖКТ. Из первоначальных ворот бруцеллы диссеминируют по лимфатическим путям и депонируются в лимфатических узлах. В первые 5-10 суток бактерии размножаются в макрофагах регионарных лимфатических узлов (миндалины, заглоточные, подчелюстные, язычные, шейные узлы и лимфоидная ткань подвздошно-слепокишечного отдела кишечника), несмотря на то, что последние способны к частичному внутриклеточному их уничтожению (при малых дозах заражения способны полностью элиминировать возбудитель). Показано, что бруцеллы выделяют низкомолекулярные продукты, ингибирующие фагосомо-лизосомальное слияние. Морфологически отмечают диффузную пролиферацию и гиперплазию элементов ретикулоэндотелиальной системы. К 20 суткам начинается процесс формирования гранулeм, представленных крупными эпителиоидными клетками. Из разрушенных макрофагов бруцеллы попадают в кровоток, что приводит к инфицированию печени, селезенки, почек, костного мозга, эндокарда (нельзя исключить и того, что возбудитель может сразу захватываться фагоцитами крови в месте внедрения и гематогенно диссеминировать). В пораженных органах находят очаги некроза, окруженные инфильтратами. В дальнейшем бактерии могут попасть в молочные железы и появиться в молоке. При зоонозах, вызванных бруцеллами, инфицирование плаценты и тканей плода животных приводит к абортам, тогда как при бруцеллезе беременных женщин спонтанные аборты регистрируют не чаще, чем у здоровых. Столь разительное различие обусловлено наличием ускоряющего рост бруцелл i-эритритола в плаценте животных. ^ Разнообразие клинических проявлений бруцеллеза на практике нередко приводит к ошибочной диагностике тифа, стрептококковых инфекций, туберкулеза и т.д. Для постановки достоверного диагноза необходимо идентифицировать возбудитель. Первоначально необходимо провести бактериологическое исследование крови, принимая во внимание системный характер поражений; также изучают мочу, грудное молоко, аспираты костного мозга и биопсийный материал печени. ^ Образцы инкубируют в МПБ или бульоне Мартена (можно использовать соевый бульон) при 37°С. При проведении исследования засевают 2 порции среды и в одной создают повышенную концентрацию СО2. Через 4-5 суток наблюдают рост бруцелл, нередко в виде мелких колоний, вкрапленных в тяжи фибрина, среда остается слегка мутной или прозрачной. После пересева на твердые среды отмечают характерный рост колоний, из которых отвивают чистые культуры с последующими идентификацией биохимических свойств, определением способности расти на средах с добавлением некоторых анилиновых красителей (бактериостатический метод Хеддльсона) и определением биотипа реакциями агглютинации (рис. 18).  ^ Серологические исследования. Реакция агглютинации (реакция Райта) — один из основных методов диагностики бруцеллеза. Динамика реакции может быть различной, для нее характерно колебание титров, в течение суток положительная реакция (с первого дня заболевания); наиболее высокие титры отмечают через 1-2 месяца. Для получения адекватных результатов необходимо использовать негемолизированную сыворотку и Аг, приготовленный из S-форм бруцелл (применять Аг диссоциированных форм нельзя), в эндемичных очагах вызванных Brucella melitensis, рекомендуют применять гомологичный Аг (V доклад Комитета экспертов ВОЗ, 1970). Следует помнить, что для реакции Ранта характерны проагглютинационные зоны, или прозоны (отсутствие агглютинации в первых разведениях и четкое ее проявление в более высоких разведениях сыворотки). Часто применяют микрометод реакции агглютинации на стекле (реакция Хеддльсона). В острой фазе заболевания диагностическую ценность имеет иммуноферментный метод, выявляющий IgM в сыворотке больного Для диагностики, особенно при отрицательных результатах бактериологических и серологических исследований, используют аллергические кожные пробы (проба Бюрне), обычно положительные у 70-85% пациентов к концу 1 месяца заболевания. В качестве Аг применяют бруцеллин (мелитин, абортин) — протеиновый экстракт культуры бруцелл. Пробу также применяют для проведения эпидемиологических обследований (бывает положительной после вакцинации). Для выявления возбудителя в молоке широко применяется кольцевая проба Банга. ^ Для выделения и поддержания культур бруцелл используют мясо-пептонный печеночный бульон, печеночно-глюкозо-глицериновый бульон, картофельный агар, мясо-пептонный печеночно-глюкозо-глицериновый агар, печеночно-глюкозо-глицериновый агар, сывороточно-декстрозный агар, эритрит-агар, агар Альбими и другие среды. При выделении бруцелл из загрязненного материала в среды добавляют генцианвиолет 1:100-250 тыс., малахитовый зеленый — 1:500 тыс., кристаллвиолет — 1:100 тыс. ^ (МППБ). К 610 мл мясной воды добавляют 305 мл печеночного настоя, 10 г пептона, 5 г натрия хлорида. Кипятят 60 минут, водой доводят объем до первоначального. Фильтруют, разливают в пробирки (колбы), стерилизуют при 110°С 30 минут. ^ К 900 мл печеночного настоя добавляют 9 г пептона, 5 г натрия хлорида, 25 г агар-агара. Варят в автоклаве 60 минут при 100-110°С. Фильтруют, устанавливают рН 7-7,2. Добавляют 20 г глюкозы и 25 мл глицерина. Разливают в пробирки, стерилизуют при 110°С 30 минут. ^ готовят так же, как и предыдущую среду, но агар не добавляют. Печеночно-сывороточный и печеночно-аминопептидный агар. К 1 л печеночного настоя добавляют 10 г пептона, 5 г натрия хлорида, 20 г агар-агара, 17 мл 10%-ного раствора натрия двууглекислого. Автоклавируют при 115°С 20 минут. Фильтруют, устанавливают рН 7-7,2. Добавляют 10 г глюкозы и 20 мл глицерина. Разливают по сосудам, стерилизуют при 110°С 20 минут. Перед использованием в расплавленную и охлажденную до 45°С среду вносят 10-20% стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота или 10-15% аминопептида Среду разливают в пробирки или бактериологические чашки. ^ К 500 мл мясной воды добавляют 500 мл печеночного настоя, 10 г пептона, 5 г натрия хлорида и 2 г агар-агара. Кипятят до расплавления агара. Устанавливают рН 7-7,2. Разливают по сосудам и стерилизуют при 115°С 30 минут. Перед использованием в подогретый до 45°С агар добавляют 10% стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота или барана или аминопептида. ^ К 835 мл дистиллированной воды добавляют 20 г агар-агара, 10 г пептона, 5 г натрия хлорида, 165 мл мясной воды. Кипятят до расплавления агара. Фильтруют, устанавливают рН 7,4. Разливают в колбы и стерилизуют 15 минут при 115°С. Перед использованием в расплавленный и охлажденный до 45°С агар вносят 10% стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота или лошади, 1% декстрозы. ^ В 1 л дистиллированной воды 15 минут варят 500 г очищенного и мелко нарезанного картофеля. Отвар фильтруют через ватно-марлевый фильтр, доводят объем водой до 1 л. Добавляют 10 г пептона, 5 г натрия хлорида, 25 г агар-агара, кипятят до расплавления агара. Устанавливают рН 7,2. Агар оставляют для застывания; прозрачную верхнюю часть отрезают, расплавляют, фильтруют через ватный фильтр. Корректируют рН до 7,2. Добавляют 10 г глюкозы и 30 мл глицерина. Разливают по колбам или пробиркам. Стерилизуют при 115°С 20 минут. Готовая смесь должна иметь рН 6,8. ^ В 1 л дистиллированной воды растворяют 2 г пептона, 1 г декстрозы, 5 г натрия хлорида, 0,1 г натрия бисульфата. Добавляют 2 мл дрожжевого аутолизата. При изготовлении плотной среды добавляют 2-2,5% промытого агар-агара. Стерилизуют при 115°С 30 минут. ^ К 1 л дистиллированной воды добавляют 20 г пептона Дифко, 20 мл дрожжевой воды, 5 г натрия хлорида, 20 г промытого агар-агара или агара Дифко. Устанавливают рН 7,3, Нагревают до расплавления агара, фильтруют через ватный фильтр. В горячую среду добавляют 1 г глюкозы и 0,1 г натрия бисульфата. Корректируют рН до 7,2—7,3. Разливают в колбы или пробирки, стерилизуют 20 минут при 110°С. Для приготовления дрожжевой воды в 1 л дистиллированной воды суспендируют 1 кг пекарских (хлебных) дрожжей, кипятят 5-10 минут, фильтруют через плотный фильтр. Хранят в темном месте под хлороформом не более 2 недель. ^ (рецепты фирмы Oxoid). К расплавленным и охлажденным до 55-60°С агаровым средам (сывороточно-декстрозный или кровяной агары с 5% лошадиной сыворотки и 1% декстрозы) добавляют следующие антибиотики (из расчета на 1 л среды): полимиксин В — 500 ИЕ, бацитрацин – 25 000 ИЕ, циклогексимид — 100 мг, налидиксовая кислота — 5 мг, нистатин — 100 000 ИЕ и ванкомицин — 20 мг. Антибиотики суспендируют в 10 мл метанола. Вносят суспензию в среду и тщательно перемешивают. ^ В предварительном опыте с использованием эталонных культур бруцелл разных видов определяют необходимую концентрацию красителей в среде, позволяющую дифференцировать виды. В 20 мл этанола растирают 0,1 г тионина и отдельно — основного фуксина. Доводят объем красок до 100 мл дистиллированной водой. Полученные разведения красителей 1:10 000 добавляют в расплавленный и охлажденный до 45-60°С сывороточно-декстрозный агар, перемешивают и разливают в чашки Петри. Готовят суспензию из 48-часовой агаровой культуры исследуемого штамма бруцелл на 0,8%-ном растворе натрия хлорида концентрацией 1010 бактериальных клеток в 1 мл. Одну каплю суспензии засевают штрихом на агар с красителем (отдельно с тионином и фуксином). Одновременно эту суспензию засевают на агар без красителя. Инкубируют до появления роста культуры на агаре без красителей. Учитывают результат по наличию роста на агаре с красителями. ^ На подсушенный в течение 24 ч агар Альбими в чашке Петри засевают исследуемую культуру бруцелл и инкубируют при 37°С до появления колоний. Затем на колонии наливают водный раствор кристаллвиолета и выдерживают 15 с. Раствор краски сливают в чашку с дезинфицирующим раствором, а колонии рассматривают под лупой (или при малом увеличении микроскопа). Колонии S-формы светлого, а R-формы — фиолетового цвета. ^ К 1л водопроводной воды добавляют 500 г фарша из свежей печени крупного рогатого скота. Настаивают 3 ч при 25-30°С или 6-10 ч при 4°С. Кипятят, помешивая, 1-2 ч, доливают водой до первоначального объема. Осевший фарш удаляют. Настой фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в колбы и стерилизуют при 115°С 20 минут. ^ К 1л водопроводной воды добавляют 500 г фарша из свежего мяса крупного рогатого скота. Настаивают при 4°С 15-18 ч. Фарш удаляют. Настой кипятят 30-40 минут, доливают водой до первоначального объема. Фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в колбы. Стерилизуют при 120°С 20 минут. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
отлично
1
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям