Учебно-методический комплекс по дисциплине
|
|
Скачать 1.44 Mb.
|
|
^ В процессе жизнедеятельности под действием различных факторов в ДНК возникают повреждения, некоторые из них могут ликвидироваться благодаря репарации ДНК. Механизм репарации ДНК изучен на кишечной палочке. При воздействии на культуру кишечной палочки ультрафиолетовыми лучами на нити ДНК возникают повреждения - димеры (цитозин-цитозин, цитозин-тимин, чаще всего возникают димеры тимина, соединенные через атомы углерода и представляющие собой наиболее стойкие соединения). Димеры тимина приводят культуру кишечной палочки к гибели, если ее поместить в темноту. На свету димеры тимина расщепляются под действием фермента на два тнмина, тем самым, восстанавливая структуру ДНК, это явление называется световая фотореактивация. Исправляются повреждения, возникшие под действием ультрафиолетовых лучей. Повреждения, возникшие под влиянием других факторов (ионизирующая радиация, химические вещества и др.) исправляется в результате темновой фазы репарации. Она осуществляется в 5 этапов:
Темновая репарация происходит во всех клетках на всех фазах жизненного цикла. У бактерий восстанавливается до 95% повреждений. Темновая репарация обнаружена у высших организмов в культуре тканей. У человека известны заболевания, связанные с возникновением мутаций к генах, детерминирующих ферменты темновой репарации. В настоящее время известно около 10 наследственных заболеваний с нарушением репарационных процессов в ДНК. Пигментная ксеродерма - группа заболеваний, при которых отмечается повышенная чувствительность кожи к солнечным лучам (покраснение, пигментация, изъязвления, злокачественные образования). Это рецессивно-аутосомное заболевание. Фибробласты кожи больных людей более чувствительны к ультрафиолетовым лучам, чем фибробласты здоровых людей. Это связано с тем, что они обладают пониженной способностью выщеплять димеры тимина, следовательно, имеет место нарушение репарации на первом ее этапе, то есть произошла мутация в гене, кодирующем синтез ультрафиолетовой специфической эндонуклеазы. Возможны нарушения и на других этапах репарации ДНК или даже на нескольких этапах. ^ (синдром Луи Бара) - прогрессирующая атаксия мозжечка с нарушением координации движений, телеангиоэктазия склер. В этом случае сильно запаздывает второй этап репарации - удаление поврежденных оснований молекулы ДНК. Панцитопения при гипо- и апластических анемиях. Поражены все ростки костного мозга. При этом заболевании нарушен третий этап темновой репарации -синтез экзонуклеазы, завершающей вырезание поврежденного участка ДНК. ^ - сочетание недоразвития скелета, гипофизарной карликовости, гипогонадизма с врожденной телеангиоэктатической эритермой лица, участками гиперкератоза и гиперпигментации на туловище. Эти аномалии связаны с нарушением пострепликативного восстановления - 4, 5 этапов репарации. На нити ДНК в структуре гена могут возникнуть и нерепарируемые изменения - генные или точковые мутации: 1. Миссенс-мутация. Связаны с заменой одного нуклеотида на другой. В результате такой мутации возникло заболевание серповидноклеточная анемия. У гомозиготных носителей этого гена в эритроцитах содержится гемоглобин S, отличающийся от нормального гемоглобина. А только одной аминокислотой, потерявшей способность легко связывается с кислородом.
Выявлены механизмы, снижающие частоту фенотипического проявления мутаций и биологические антимутагенные факторы:
^ Наследственная информация, записанная с помощью генетического кода, хранится в молекуле ДНК. Процессы жизнедеятельности осуществляются в клетке на основе полученной информации, однако в этих процессах принимает участие не сама ДНК, а РНК, выполняющая роль посредника. Рибонуклеиновые кислоты (РНК), присутствующие в клетках как прокариот, так и эукариот, бывают трех основных типов: информационная (матричная - мРНК), транспортная (тРНК) и рибосомальная (рРНК). В ядре клеток эукариот содержится РНК четвертого типа - гетерогенная ядерная РНК (гяРНК). В отличие от молекулы ДНК, РНК представляет собой одну полинуклеотидную цепь, включающую 4 разновидности нуклеотидов, содержащих остаток фосфорной кислоты, сахар-рибозу и одно из четырех азотистых оснований - аденин, гуанин, цитозин и урацил. Рибосомальная РНК (рРНК) входит в комплексе с белками в состав рибосом, функции которых непосредственно связаны с реализацией генетической информации при синтезе пептидных связей. Р-РНК образуется на матрице ДНК, в особых локусах - генах, отвечающих за ее синтез; тРНК - короткая (70-80 нуклеотидов) полинуклеотидная цепь, осуществляющая функцию транспорта аминокислот к месту сборки пептидной цепи - к рибосоме. Эти молекулы также синтезируются на матрице ДНК. Особенностью тРНК является пространственная конфигурация. Благодаря образованию водородных связей между комплементарными последовательностями нуклеотидов молекула образует три петли. Средняя петля несет три нуклеотида (антикодон) комплементарных определенному кодону в молекуле иРНК, шифрующему данную аминокислоту. Так как один из нуклеотидов антикодона содержит нетипичное основание, которое может комплементировать с любым основанием кодона, то одна и та же тРНК способна узнавать несколько кодонов, различающихся по одну (главным образом третьему) основанию. В связи с этим в цитоплазме встречается около 40 видов различных тРНК, способных переносить 20 аминокислот. К 3' концу молекулы тРНК прикрепляется определенная молекула аминокислоты. Все тРНК начинаются с фосфорилированного 5' -конца; первым основанием обычно является G. На 3' -конце всегда присутствуют три основания -ЦЦА и концевая гидроксилъная группа (-ОН) - акцепторный конец. К этому концу присоединяется остаток аминокислоты. Прежде чем соединиться с тРНК, аминокислоты активируются. Активация аминокислот происходит при их взаимодействии с АТФ и образованием аминоациладенилата (активированная форма аминокислоты), который представляет собой смешанный ангидрид, образованный остатком фосфорной кислоты, АМФ и карбоксильной группой аминокислоты. С аминоациладенилата остаток аминокислоты переносится на тРНК, специфичную для каждой аминокислоты, и в виде аминоацил -тРНК поступает в рибосомы. Эти реакции катализируются ферментом аминоацил-тРНК-синтетазой, строго специфичным для каждой аминокислоты и каждой тРНК. и-РНК- молекула, на которую переписывается по принципу комплементарности информация с определенного участка молекулы ДНК. Списанная информация поступает в виде иРНК в цитоплазму и является инструкцией для сборки пептидной цепи на рибосоме. Таким образом, молекула ДНК при участии различных видов РНК обеспечивает специфический синтез в клетке. ^ В связи с тем, что у прокариот геном организован в виде кольцевидной молекулы ДНК, расположенной непосредственно в цитоплазме клетки, различные этапы реализации наследственной информации практически не разобщены ни во времени, ни в пространстве. Транскрипция и сборка пептидной цепи - трансляция протекают практически одновременно. По мере освобождения начала молекулы иРНК от матрицы ДНК к ней присоединяются рибосомы и начинается синтез пептидных цепей. ^ Геном эукариот организован сложнее, чем у прокариот. Для него характерен хромосомный уровень организации. В хромосомах ДНК находится в окружении белков. В геноме эукариот имеется много избыточной ДНК. В конце 70-х годов было высказано предположение о наличии в генетическом материале эукариот неинформативных участков - интронов, которые вставлены между информативными - экзонами. Интронноэкзонная организация генов у эукариот определяет необходимость преобразования первичного транскрипта (преинформационной РНК - продукта транскрипции) в зрелую иРНК. Она должна быть освобождена от неинформативных участков и защищена против разрушающего воздействия ферментов цитоплазмы. Кроме того, у эукариот появляется ядерная мембрана, которая пространственно разобщает место хранения генетической информации (хромосомы в ядре) и место синтеза пептидной цепи (рибосомы). Иными словами, у эукарнот процессы транскрипции и трансляции разобщены как пространство (ядерной оболочкой), так и во времени (процессами созревания иРНК). Таким образом, в ходе реализации наследственной информации у эукариот выделяют следующие этапы:
1. Транскрипция - осуществляется с помощью РНК-полимераз. РНК-полимераза 1 синтезирует пре-рРНК. РНК-полимераза П синтезирует пре-иРНК. РНК-полимераза III -пре-тРНК. Раньше считали, что транскрипция происходит по 1 из 2-х расплетаемых нитей ДНК. Сейчас установлено, что транскрипция идет по обеим нитям в 2-х направлениях. Одна нить ДНК несет наследственную информацию (смысловая), другая, комплементарная ей - антисмысловая. В клетке антисмысловая иРНК играет роль в управлении дифференцировкой и иногда - в регуляции синтеза белка. Если образуется комплекс (дуплекс иРНК + антисмысловая иРНК), тогда невозможен перенос иРНК из ядра в цитоплазму, следовательно, нет трансляции на рибосомах. В участке ДНК, соответствующем отдельному гену перед структурной частью, в которой зашифрована последовательность аминокислот в пептиде, обязательно располагается последовательность нуклеотидов, узнаваемая РНК-полимеразой. Такая последовательность называется промотором. РНК-полимераза находит промотор, взаимодействует с ним и после этого, двигаясь вдоль молекулы ДНК, обеспечивает постепенную сборку молекулы иРНК в соответствии с принципом комплементарности и антипараллельности. В конце структурной части гена расположен участок с особой последовательностью нуклеотидов - терминатор. Он обязательно включает один из нонсенс-триплетов, не кодирующих аминокислоты. В результате транскрипции синтезируется молекула преинформационной РНК. 2. ^ Это превращения, происходящие с первичным транскриптом, направленные на образование зрелой, стабилизированной иРНК, способной выполнять функцию матрицы при трансляции и защищенной от разрушающего действия специфических ферментов цитоплазмы. Основные стадии процессинга:
В результате процессинга у эукариот зрелая нРНК характеризуется следующими особенностями строения: Кэп - особая последовательность нуклеотидов с метилированными основаниями, которая обеспечивает узнавание малых субъединиц рибосом; Лидер - вводная последовательность нуклеотидов, комплементарная последовательности в молекуле рРНК малой субъединицы рибосом, которая обеспечивает прикрепление иРНК к малой субъединице. Стартовый кодон - триплет нуклеотидов, кодирующий в большинстве случаев аминокислоту формилметионин (АУГ). Кодирующая часть - последовательность колонов, шифрующих определенную последовательность аминокислот в соответствующей пептидной цепи. Поли А-хвост - концевая часть молекулы иРНК, включающая нонсенс-кодон и поли-А последовательность. Трансляция - процесс сборки пептидной цепи, происходящей в цитоплазме на рибосомах на основании программы, содержащейся в иРНК. Основные фазы трансляции: 1) инициация; 2) элонгация; 3) терминация. Инициация трансляция предполагает следующие события:
Таким образом, фаза инициация завершается формированием комплекса иРНК и рибосомы с подстановкой начальной для всех пептидных цепей аминокислоты -формилметионин. Фаза элонгации, т.е. наращивание пептидной цепи. Осуществляется путем постепенной подстановки аминокислоты в соответствии с очередным кодовом иРНК, который встает против аминоацильного центра. К этому кодону присоединяется соответствующая тРНК, имеющая комплементарный ему антикодон. Она несет определенную аминокислоту, которая располагается в аминоацильном центре (АЦ), тРНК, соединенная с предыдущим кодовом оказывается в пептидильном центре (ПЦ где располагает свою аминокислоту (цепочку АК). Между двумя аминокислотами, расположенными в пептидильном и аминоацильном центре, при участии имеющихся здесь ферментов возникает пептидная связь: После установления пептидной связи предыдущая тРНК отделяется от своей аминокислоты и своего кодона и уходит в цитоплазму, а последняя тРНК, нагруженная цепочкой аминокислот, переходит в ПЦ, заставляя иРНК перемещаться вдоль рибосомы и устанавливать новый кодон против аминоацильного центра. После прохождения через рибосому всей кодирующей части иРНК на рибосоме собирается пептидная цепь с определенной последовательностью аминокислот. Фаза терминации наступает, когда в контакт с рибосомой приходит концевой участок иРНК, который включает нонсенс-кодон, не кодирующий никакой аминокислоты. На этом сборка пептидной цепи заканчивается. По мере освобождения 5/ конца иРНК колпачок может находить новые малые субьединицы рибосом и процесс трансляции может повторно осуществляться на новых рибосомах. Комплекс рибосом, находящихся в контакте с одной молекулой иРНК и синтезирующих одинаковые пептидные цепи, называется полирибосомой (полисомой). ^ Реализация наследственной информации в живых системах - это сложный процесс, требующий очень тонкой регуляции для того, чтобы обеспечить в определенных клетках в определенное время синтез определенных белков в необходимом количестве. Все клетки организма, возникая путем митоза, получают полноценный набор генетической информации, образуемый при оплодотворении родительских гамет. Несмотря на это, они отличаются по своим морфологическим, биохимическим н функциональным свойствам друг от друга. В основе этих различий лежит активное функционирование в разных клетках разных частей генома. Большая часть генома в клетках организма находится в неактивном -репрессивном состоянии в только около 10% генов дерепрессированы, т. е. активно транскрибируются. Спектр транскрибируемых генов зависит от тканевой принадлежности клетки, от периода ее жизнедеятельности и периода индивидуального развития организма Регуляция активности генов может осуществляться на всех этапах реализации генетической информации, но наиболее экономически выгодной является регуляция на стадии транскрипции. Основная масса генов, активно функционирующих в большинстве клеток организма на протяжении онтогенеза, - это гены, которые обеспечивают синтез белков общего назначения (белки рибосом, хромосом, мембран и т. д.), тРНК и рРНК. Транскрибирование этих структурных генов обеспечивается соединением РНК-полимеразы с их промоторами и не подчиняется каким-либо другим регулирующим воздействиям. Такие гены называются конститутивными. Другая группа структурных генов, обеспечивающих синтез некоторых белков-ферментов, в своем функционировании зависит различных регулирующих факторов и называется регулируемыми генами. Их активное функционирование, скорость и продолжительность транскрибирования могут регулироваться как генетическими факторами, так и факторами негенетической природы. Генетическими факторами регуляции транскрипции являются гены-регуляторы и операторы. Гены-регуляторы определяют синтез белков-регуляторов, способных в активном состоянии соединяться с оператором, включающим или выключающим транскрипцию структурных генов. В зависимости от свойств белка-регулятора различают негативный и позитивный контроль транскрипции со стороны гена-регулятора. При негативном контроле белок-регулятор, соединяясь с оператором, прекращает (выключает) транскрипцию. Такой белок называется репрессором. При позитивном контроле белок-регулятор, соединяясь с оператором, включает транскрипцию. В таком случае продукт гена-регулятора называется апоиндуктором . Таким образом, наряду со структурными генами в геноме имеются гены-регуляторы, которые, обеспечивая репрессию или депрессию структурных генов, регулируют процессы синтеза белка в клетке. Наряду с генетическими факторами в регуляции экспрессии генов важная роль принадлежат факторам негенетической природы - эффекторам. К ним относятся вещества небелковой природы, расщепляемые или синтезируемые в клетке при участии различных ферментов. В зависимости от того, как эффектор воздействует на активность генов, различают индукторы, включающие транскрипцию генов, и корепрессоры, выключающие ее. Действие эффектора заключается в его взаимодействии с белком-регулятором, при котором он либо активируется и может соединяться с оператором, либо инактивируется и теряет способность соединяться с оператором. Таким образом, экспрессия генов является результатом регулирующего воздействия на процессы транскрипции как со стороны самого генома (гены-регуляторы и операторы), так и со стороны факторов негенетической природы. ^ Изучение регуляции экспрессии генов на стадии транскрипции у прокариот привело к созданию в 1961 г. модели оперона (Жакоб и Мано). Оперон -это тесно связанная последовательность структурных генов, определяющих синтез группы ферментов для какой-либо одной из биохимических реакций. Особенностью прокариот является транскрибирование иРНК со всех структурных генов оперона. Такая полицистронная иРНК в дальнейшем разрезается на фрагменты, соответствующие матрицам для синтеза отдельных ферментов. Цепи структурных генов оперона всегда предшествует промотор, узнаваемый РНК-полимеразой. У конститутивных генов этого достаточно для осуществления транскрипции. У регулируемых генов между промотором и структурными генами располагается оператор - последовательность нуклеотидов, которая узнается белком-регулятором (репрессором), находящимся в активном состоянии. Белок-репрессор представляет собой аллостерический белок, способный изменять свои биологические свойства при соединении с различными специфическими молекулами и обладает двумя высокочувствительными группами; одной из них он распознает оператор, другой -специфично связывает индуктор. Одновременно быть связанным с двумя молекулами он не может. Индуктор представляет низкомолекулярное вещество, которое связывается с репрессором и переводит его в неактивную форму, неспособную более связываться с оператором. Так, в Lac-системе индуктором является лактоза, после ассоциации с которой репрессор отсоединяется от оператора. При отсутствии в среде лактозы активный репрессор, взаимодействуя с оператором, репрессирует гены А, В, С - транскрипции нет. Появление в среде лактозы инактивирует репрессор, он не соединяется с оператором и осуществляется транскрипция генов А, В, С, отвечающих за синтез ферментов, которые расщепляют лактозу. Уменьшение содержания лактозы в результате ее ферментативного расщепления приводит к соединению активного репрессора с оператором и выключению транскрипции генов А, В, С. ^ У эукариот не установлено оперенной организации генов. Гены, определяющие синтез ферментов одной цепи биохимических реакций, могут быть рассеяны в геноме и очевидно не имеют, как у прокариот, единой регулирующей системы. В связи с этим синтезируемые мРНК у эукариот моноцистронны, т.е. являются матрицами для отдельных пептидных цепей. В настоящее время механизмы регуляции активности эукариотических генов интенсивно изучаются. Установлено, что регуляция транскрипции у эукариот является комбинационной, т. е. активность каждого гена регулируется большим спектром генов-регуляторов. У многих эукариотических генов, кодирующих белки и транскрибируемых РНК-полимеразой II, в ДНК имеется несколько областей, которые узнаются разными белками-регуляторами. Одной из них является область, расположенная вблизи промотора. Она включает около 100 пар нуклеотидов, в том числе ТАТА-блок, располагающийся на расстоянии 25 пар нуклеотидов от точки начала транскрипции. Установлено, что для успешного присоединения РНК-полимеразы II к промотору необходимо предварительное соединение с ТАТА-блоком особого белка - фактора транскрипции - с образованием стабильного транскрипционного комплекса. Именно этот комплекс ДНК с белком узнается РНК-полимеразой П. Другая область, играющая важную роль в регуляции активности эукариотических генов, располагается на большом расстоянии от промотора (до нескольких тысяч пар нуклеотидов) и называется ЭНХАНСЕРОМ (от англ. enhance - усиливать). И энхансер, и препромоторный элемент эукариотических генов - это короткие последовательности нуклеотидов, которые связываются с соответствующими регуляторными белками. В результате взаимодействия этих белков происходит включение или выключение генов. Особенностью регуляции экспрессии эукариотических генов является также существование белков-регуляторов, которые способны контролировать транскрипцию многих генов, кодирующих, возможно, другие белки-регуляторы. В связи с этим некоторые (главные) белки-регуляторы обладают координирующим влиянием на активность многих генов и их действие характеризуется плейотропным эффектом. Ввиду того, что в геноме эукариот имеется много избыточных ДНК, а в каждой клетке организма транскрибируется всего 7-10% генов, логично предположение о том, что у них преобладает позитивный генетический контроль, при котором активация небольшой части генома оказывается более экономичной, нежели репрессия основной массы генов. Несомненной особенностью регуляции транскрипции у эукариот является подчиненность этих процессов регулирующим влияниям со стороны гормонов организма. Последние часто играют роль индукторов транскрипции. Примером участия гормонов в регуляции активности определенных генов может служить влияние тестостерона на развитие тканей организма по мужскому типу при наличии специфического белка-рецептора. Отсутствие последнего при мутации соответствующего гена не дает возможности гормону проникнуть в ядра клеток-мишеней и обеспечить включение определенного набора генов: развивается синдром тестикуляриой феминизации или синдром Морриса: особь с кариотипом ХУ, но внешне более сходны с женщиной, не способна иметь потомство, т.к. ее половые железы (семенники) недоразвиты, их выводные протоки часто формируются по женскому типу, вторичные половые признаки также характерно для женского пола. Следующая особенность регуляции генной активности у эукариот связан: с образованием комплекса ДНК с белками - хроматином. Ведущая роль в компактизации ДНК принадлежит гистонам, поэтому они несомненно участвуют и в процессах регуляции генной активности. Непременным условием для осуществления транскрипции у эукариот является предварительна декомпактизация хроматина на соответствующем участке, где временно утрачивается связь с Н1-гистонами и несколько ослабляется связь с нуклеосомными гистонами. Правда, нуклеосомная организация хроматина не утрачивается даже в ходе транскрипции, однако контакт ДНК и негистоновых белков становится возможным и происходит дерепрессия гена. Для эффективной регуляции экспрессии генов у эукариот существуют механизмы, работающие не только на стадии транскрипции, но и на других этапах этого процесса. Связанная с экзон-интронной организацией генов необходимость процессинга, в том числе сплайсинга, делает возможным регуляцию этих процессов в ядре: используя один и тот же первичный транскрипт, можно обеспечить образование матриц для разных пептидов, вырезая из них разные последовательности или изменяя последовательности на 5' и 3' концах мРНК. Транспорт зрелых мРНК из ядра в цитоплазму также регулируется: лишь небольшая часть РНК, транскрибируемая с генов, после сплайсинга покидает ядро. Значительное количество ее деградирует. Существуют механизмы, обеспечивающие регуляцию процессов синтеза пептидных цепей. Они менее экономичны, но отличаются быстротой реагирования на изменения потребностей клетки в данном белке. Регуляция трансляции осуществляется на стадии инициации, когда блокируется присоединение к малой субъединице рибосомы тРНК, несущей формилметионин. В результате при наличии в цитоплазме иРНК трансляции на ней не происходит. Такая ситуация наблюдается, например, при отсутствии в цитоплазме гена, что ведет к выключению трансляции глобиновых цепей гемоглобина. Регуляция процесса реализации наследственной информация может осуществляться и на стадии посттрансляционных изменений, когда происходит задержка в формировании активных молекул белка при наличии пептидных цепей. Например, для формирования активной формы инсулина из проинсулина должны вырезаться две субъединицы. Торможение этих процессов уменьшает выход конечного активного продукта. ^ Основные достижения молекулярной генетики, особо отразились в бурном развитии генной инженерии. Генетическая (генная) инженерия - область молекулярной биологии и генетики, ставящая своей задачей конструирование генетических структур по заранее намеченному плану, создание организмов с новой генетической программой. Основные методы генной инженерии были разработаны в 60-70-х годах нашего века. Они включают три основных этапа:
В настоящее время раскрыта тонкая структура гена. Известно, что ген содержит информацию на первичную структуру одного полипептида. Число кодонов в гене не может быть меньше числа аминокислот в белке. Средний размер гена 1000-1200 нуклеотидов. Существуют разные подходы выявления последовательности нуклеотидов в гене. Принципиально возможно познание структуры гена путем изучения последовательности аминокислот в белке. Но это длинный путь, если учесть, что одна и та же аминокислота может кодироваться несколькими триплетами. Другой подход более реальный: путем анализа последовательностей нуклеотидов в информационных РНК, которые какое-то время существуют в цитоплазме и могут быть выделены. Гены для пересадки могут быть либо искусственно синтезированы, либо выделены из ДНК прокариот и хромосом эукариот. В настоящее время выделение высокомолекулярной ДНК проводят на ультрацентрифугах в градиенте плотности хлористого цезия. Известно два пути искусственного синтеза гена: химический и ферментативный. Для химического синтеза необходимо иметь полностью расшифрованную последовательность нуклеотидов. Впервые в 1970 году индийским ученым Корана Г. (США) был осуществлен искусственный синтез гена. Он синтезировал последовательность нуклеотидов в ДНК, специфическую для структуры гена транспортной аланиновой РНК в клетках пекарских дрожжей. Более двух лет затратили на этот синтез гена. Последовательность нуклеотидов в нити ДНК определялась по информационной РНК. Но этот ген был не способен работать in vitro. Причиной являлся синтез только структурной части гена, в нем не было регуляторных участков. Для транскрипции необходимо, чтобы фермент РНК-полимераза "узнавала" место промотора, где локализована точка инициации синтеза, и в этом месте "садилась" на матрицу. В 1976 г, в той же лаборатории был синтезирован ген тирозиновой тРНК бактерии кишечной палочки, состоящий не только из структурного участка (126 нуклеотидных пар), но и регуляторных частей - промотора и терминатора. Этот искусственно созданный по специальной программе ген был выведен в бактериальную клетку и функционировал как природный. Другим примером химического синтеза гена является синтез гена, кодирующего фермент, расщепляющий лактозу. Синтезированный ген в пробирке был встроен в плазмиду и введен в бактерию; кишечная палочка приобрела способность усваивать лактозу. Однако, химическим путем можно синтезировать небольшие по размеру гены прокариот, синтез сложных генов эукариот, состоящих из тысячи и более нуклеотидов, путем химического синтеза пока создать не удается. Кроме того, химический синтез очень трудоемкий и в настоящее время практически не используется. Наиболее успешным оказался ферментативный синтез гена. Центральная догма молекулярной генетики утверждает, что считка информации происходит в направлении: ДНК→РНК→белок. Но ряд авторов, начиная с 1948 года, выступали с соображениями, что РНК может быть предшественником ДНК. Подобное наблюдается у онкогенных РНК - содержащих вирусов. С РНК-вируса, попавшего в клетку, синтезируется провирус (ДНК - копия РНК) с помощью фермента обратная транскриптаза (ревертаза), а сам процесс называется обратной транскрипцией. Этот фермент был открыт в 1970 году Теминым, Мазутани, Балтимором. Клонирование (размножение) кДНК по известной иРНК было разработано Г.Бойером, С.Коэном и П.Бергом в 1973 году. На 1 этапе на основе иРНК по принципу комплементарности синтезируют односпиральную кДНК. На 2-3 этапах удаляют иРНК и достраивают вторую часть кДНК. Деполимеризацию исходной РНК-цепочки осуществляют путем щелочного гидролиза. Цепи ДНК устойчивы к обработке щелочью, а РНК полностью деполимеризуется. Двуцепочечную кДНК получают путем достраивания одноцепочечной кДНК под действием фермента ДНК-полимеразы. После такой обработки кДНК можно встраивать в вектор. Такая кДНК не имеет вставок - интронов, т. е. схема ее строения в этом смысле не отличается от бактериального гена. Ген, полученный путем ферментативного синтеза, может функционировать в бактериальной клетке, на нем синтезируется иРНК, а затем белок. Таким путем под руководством академика В. А.Энгельгардта был получен ген, определяющей синтез фермента галактозидазы, введенный в фаг. При размножении фага в клетке получили множество копий, что обеспечило синтез большого количества фермента. Это имеет не только теоретическое, но и практическое значение, так как галактозидаза применяется в пищевой промышленности. Следовательно, если иметь в пробирке выделенные молекулы иРНК, принадлежащие данному гену, то он может быть синтезирован с помощью фермента. Матрицей служит иРНК, ее выделяют, добавляют нуклеотиды, затравку, ферменты. На основе этих данных в 1972-1973 гг. во многих лабораториях мира были синтезированы гены глобина человека, кролика, голубя, мыши, утки, гены митохондрии печени крыс и другие. Гены, синтезированные с помощью ревертазы, не имеют регулярной части и промотора. Отсутствие регуляторных участков препятствует функционированию этих искусственных генов в животных клетках. При переносе в микробную клетку к структурным генам присоединяют промотор, извлеченный из микробной клетки. Ферментативный синтез гена имеет большие возможности: принципиально осуществимо проводить искусственный синтез любых индивидуальных генов путем транскрибирования их с соответствующих матричных РНК. Основным затруднением является синтез не структурных, а регуляторных генов, необходимых для их нормальной работы. Это в ряде случаев ограничивает использование искусственно синтезированных генов. Кроме этого, иРНК в клетках содержится в очень незначительном количестве и она обладает нестойкостью. В настоящее время получают рекомбинативные (гибридные) молекулы ДНК путем гибридизации in vitro фрагментов ДНК вирусного, бактериального и в меньшей степени эукариотного происхождения. Нахождение условий функционирования генов эукариот в бактерии позволяло бы решить проблему получения многих биологически активных веществ (гормонов). Одним из достижений является синтез гормона соматостатина, полученный в результате введения этого гена в кишечную палочку. Соматостатин регулирует поступление в кровь гормона роста, образуется он в гипоталамической области. Плазмиды, содержащие этот ген, были введены в бактерию и состыкованы с имеющимся в ее геноме регуляторным геном бетагалактозидазы. Наличие регуляторного участка обеспечило процесс транскрипции и трансляции. Однако создание искусственных генов, получение рекомбинантных молекул ДНК и введение их в клетки, в частности прокариот, может привести к появлению новых организмов с признаками, никогда ранее не имевшимися на Земле. Так, в США пересадили гены стафилококка кишечной палочки. В результате образовался гибридный штамм, обладающий свойствами обоих микроорганизмов. При манипуляции с геномом этой бактерии возникшие новые организмы могут приобрести патогенные свойства, быть устойчивыми к известным лекарственным препаратам и оказаться особо опасными для человека, поскольку в ходе предыдущей эволюции человеческий организм никогда не встречался с такими формами и может оказаться безоружным, В связи с этим на Международной конференции в США в 1974 г. были выработаны определенные правила, обязательные при манипуляциях с генетическим материалом и предложен ряд мер, которые должны сделать практически невозможным случайный выход из лабораторий в природу патогенных рекомбинантных микроорганизмов. Успехи молекулярной генетики должны быть использованы на благо человека: в борьбе против наследственных болезней, для создания новых микроорганизмов - продуцентов биологически активных веществ, синтеза растительных и животных белков и др. Молекулярная генетика развивается стремительно и уже располагает достаточными средствами и методами воздействия на наследственные заболевания. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям