Методические указания к лабораторным работам и вопросы для самостоятельной подготовки студентов 2-го курса эколого-биологического факультета

Техника безопасности

• 
  Категорически запрещается отмеривать концентрированные кислоты и щелочи обыкновенными пипетками – для отмеривания реактивов использовать мерные пробирки.
  
• 
  Будьте внимательны при наливании концентрированных кислот и щелочей.
  
• 
  В процессе нагревания постоянно перемешивайте жидкость, не допускайте выброса ее из пробирки.
  
• 
  Соблюдайте правила пожарной безопасности.
  

• 
  выделить белки из мышечной ткани и яичного альбумина;
  
• 
  провести кислотный гидролиз яичного альбумина;
  
• 
  разделить предложенную смесь аминокислот методом распредели-тельной хроматографии, определить, какие аминокислоты входят в ее состав.
  

3. 
   20 мл полученной суспензии дважды фильтруют через складчатый фильтр.
   
4. 
   С фильтратом, содержащим яичный альбумин, проделывают цветные реакции на белки (биуретовую, нингидриновую, ксантопротеиновую, реакции Милона, Фоля).
   

Радиальная (круговая) хроматография

1. 
   Хроматографическую бумагу вырезают в форме диска, диаметр которого соответствует внутреннему диаметру эксикатора. В центр диска (на точку старта) наносят микропипеткой в несколько приемов 0,005-0,01 мл исследуемой смеси аминокислот. Нанесение смеси следует проводить очень аккуратно, слегка касаясь микропипеткой стартовой точки, чтобы диаметр мокрого пятна был не более 5 мм. После каждого нанесения пятно подсушивают над электроплиткой или в термостате.
   
2. 
   В центре хроматограмм делают иглой отверстие, в которое пропускают фитилек из сложенной вчетверо х/б нити. Хроматограмму помещают в эксикатор, на дно которого предварительно наливают верхний слой растворителя. Проверяют положение фитилька и хроматограммы: конец фитилька должен быть погружен в растворитель, а края хроматограммы должны находиться на выступах эксикатора. Закрывают эксикатор крышкой.
   
3. 
   Растворитель поднимается вверх по фитильку, а затем радиально распространяется по бумаге от центра. Когда растворитель достигнет края бумаги, ее вынимают из эксикатора, высушивают под тягой, обрабатывают 0,5%-м раствором нингидрина (готовится на ацетоне или спирте) и помещают в сушильный шкаф при 60-70 ^оС на 10-15 минут. На хроматограмме появляются сине-фиолетовые пятна, каждое из которых соответствует отдельной аминокислоте.
   

Нисходящая хроматография

1. 
   Из хроматографической бумаги вырезают полоску шириной 5 см и длиной, примерно соответствующей высоте камеры. На расстоянии 10 см от конца полоски проводят простым карандашом стартовую линию, в середине которой отмечают точку старта. На стартовую точку микропипеткой наносят 0,005-0,01 мл смеси аминокислот (в несколько приемов, диаметр мокрого пятна не более 5 мм), периодически просушивая бумагу над электрической плиткой (или над настольной лампой).
   
2. 
   На дно хроматографической камеры наливают небольшое количество нижнего слоя растворителя, а в установленную лодочку – верхний слой растворителя. Хроматограмму с нанесенной смесью аминокислот помещают в камеру так, чтобы ближний к старту конец был опущен в лодочку и зафиксирован в ней предметным стеклом, а другой висел вертикально, не касаясь стенок камеры. Камеру закрывают крышкой и оставляют при комнатной температуре на 18-20 часов.
   
3. 
   Растворитель продвигается по хроматограмме сверху вниз, и когда фронт его приблизится к нижнему краю бумаги, хроматограмму вынимают из камеры и высушивают под тягой. Затем ее обрабатывают 0,5%-м раствором нингидрина и помещают в сушильный шкаф при 60-70 ^оС на 10-15 минут для развития окраски, после чего на ней появляются пятна сине-фиолетового или лилового цвета, соответ-ствующие аминокислотам.
   

• 
  выделить основные две фракции из яичного белка и доказать, что альбумин, входящий в его состав, хорошо растворяется в дистил-лированной воде, а глобулин  в растворе солей;
  
• 
  провести предложенные реакции необратимого осаждения белков;
  
• 
  с помощью реакций высаливания разделить белки плазмы крови на основные фракции (фибриноген, альбумины и глобулины);
  
• 
  доказать, что высаливание  обратимый процесс, при котором сохраняются свойства нативного белка, а денатурация  необратимый;
  
• 
  проанализировать полученные результаты и сделать выводы.